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Dominios de las neuregulinas implicados en su maduración, transporte a la membrana plasmática y acción biológica

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178 pages
Colecciones : CIC. Tesis del Centro de Investigación del Cáncer
Fecha de publicación : 20-ene-2009
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Dominios de las neuregulinas implicados en su maduración, transporte a la membrana plasmática y acción biológica TESISDOCTORALRuth Rodríguez Barrueco Centro de Investigación del Cáncer Salamanca 2008
El Dr. ATANASIOPANDIELLAALONSO, Profesor de Investigación del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), CERTIFICA:
Que la memoria tituladaDominios de las neuregulinas implicados en su maduración, transporte a la membrana plasmática y acción biológica,presentada por la licenciada RUTHRODRÍGUEZBARRUECOha sido realizada bajo su dirección en el Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer (IBMCC) y reúne, a su juicio, originalidad y contenidos suficientes para que sea presentada ente el tribunal correspondiente y optar al grado de Doctora por la Universidad de Salamanca. Y para que así conste, expide el presente certificado en Salamanca a 20 de enero de 2009. Fdo. Dr. Atanasio Pandiella Alonso
Índice1
Índice Abreviaturas…………………………………………………………………………….… Introducción……………………………………………………………………………….. 1. Receptores ErbB/HER………………………………………………………………..
1.1. Estructura y activación de los receptores ErbB…………………………...
1.2. Receptores ErbB y cáncer……………………………………………………..
1.2.1. EGFR ………………………………………………………………………..
1.2.2. ErbB2 ………………………………………………………………………..
1.2.3. ErbB3 ………………………………………………………………………..
1.2.4. ErbB4 ………………………………………………………………………..
1.3. Aproximaciones terapéuticas…………………………………………………
1.3.1. Anticuerpos monoclonales ………………………………………………..
1.3.2. Inhibidores de la actividad tirosina quinasa ………………………..……
2. Ligandos de la familia del EGF……………………………………………………..
2.1. Especificidad de los ligandos de la familia del EGF……………………..
2.2. Ligandos EGF y cáncer………………………………………………………..
3. Neuregulinas……………………………………………………………………………
3.1. Genes, expresión y función biológica………………………………………..
3.1.1.NRG1……………………………………………………………………….. 3.1.2.NRG2………………………………………………………………………..3.1.3.NRG3………………………………………………………………………..3.1.4.NRG4………………………………………………………………………..
3.2. NRG1: Clasificación y dominios estructurales……………………………. 3.2.1. Nterminal …………………………………………………………………...3.2.2. DominioKringle …………………………………………………………….3.2.3. Dominio inmunoglobulina ………………………………………………….3.2.4. Región espaciadora ………………………………………………………..3.2.5. Dominio Rico en Cisteínas (CRD) ………………………………………..3.2.6. Dominio EGF ………………………………………………………………..3.2.7. Región yuxtamembrana …………………………………………………...3.2.8. Dominio transmembrana …………………………………………………..3.2.9. Cola citosòlica ………………………………………………………………
5
13 14 15 20 20 21 23 24 25 25 26 29
30 32 33 34 36 38 39 39 40 40 41 42 43 43 44 45 45 46
2 Índice 3.3. Señalización ………………………………………………………………..3.3.1. Señalización a través de los receptores ErbB …………………………..
3.3.1.1. Activación de los receptores ……………………………………..
3.3.1.2. Cascada de señalización ………………………………………...
3.3.1.3. Efectos sobre la transcripción génica …………………………..
3.3.1.4. Señalización independiente de transcripción ………………….
3.3.2. Señalización independiente de receptores ErbB ……………………….
3.3.2.1. A través de la cola citoplasmática ……………………………....
3.3.2.1. Neuregulina nuclear ……………………………………………… 3.3.3. Regulación de los niveles de neuregulina ……………………………….3.4. Papel de las neuregulinas en cáncer ……………………………………
Hipótesis y Objetivos Material y Métodos……………………………………………………………………… 1. Reactivos y animales de experimentación……………………………………….
 2. Anticuerpos……………………………………………………………………………...
2.1. Anticuerpos comerciales …………………………………………………………..
2.2. Anticuerpos generados en el laboratorio ………………………………………..
2.3. Producción de proteínas de fusión ……………………………………………….
2.4. Obtención de péptidos acoplados a KLH ………………………………………..
2.5. Obtención de antisueros …………………………………………………………..
2.6. Purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad ……………………
3. Cultivos celulares………………………………………………………………..…….
3.1. Condiciones de cultivo …………………………………………………………….
3.2. Preservación de líneas celulares …………………………………………………
3.3. Transfección y selección de clones estables ……………………………………
 4. Generación de mutantes……………………………………………………………..
 5. Electroforesis y Western Blot………………………………………………………..
5.1. Extracción de proteínas e inmunoprecipitación …………………………………
5.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida …………………………………………..
5.3. Western Blot ………………………………………………………………………..
 6. Inmunofluorescencia………………………………………………………………….
49 49 49 52 53 54 55 55 55 55 57
61
63 63 65 65 66 66 68 68 68 69 70 70 71 72 73 73 74 75 76
Índice3
 7. Citometría de flujo……………………………………………………………………..
7.1. Marcaje de superficie ………………………………………………………………
7.2. Análisis de ciclo celular …………………………………………………………....
 8. Ensayo de protección de proteasas……………………………………………….
 9. Fraccionamiento subcelular…………………………………………………………
10. Proliferación celular……………………………………………………………………
11. Análisis estadístico……………………………………………………………………. Resultados y Discusión……………………………………………………………….
1. Formas moleculares de NRGα2c………………………………………………….
1.1. Localización subcelular ……………………………………………………………
1.2. Modificaciones postraduccionales ……………………………………………….
2. Determinantes de la localización subcelular de NRGα2c ..…………………..
2.1. Actividad biológica de las formas solubles de NRGα2c ……………………….
2.2. Exposición de los mutantes de NRGα2c a la superficie celular ………………
2.3. Anclaje a la membrana de los mutantes de NRGα2c ………………………….
2.4. Topología y glicosilación de los mutantes de NRGα2c ………………………..
2.5. Péptido señal de TGFα ............................................................................................
3. Propiedades biológicas asociadas a los diferentes dominios de NRG……
3.1. Mutantes retenidos en el interior de la célula …………………………………..
ΔIg 3.2. Mutante NRG ……………………………………………………………………. ΔIg 3.2.1. Actividad de la forma soluble de NRG ………………………………...ΔIg 3.2.2. Actividad de la forma transmembrana de NRG ………………………
3.2.3. Actividad biológica de TGFα................................................................
Conclusiones……………………………………………………………………………… Bibliografía…………………………………………………………………………………
77 77 77 78 78 79 79
81 81 83 87 92 97 99 100 109 117 120 122 132 134 137 140
147
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Abreviaturas5
Abreviaturas AbsAbsorbance Absorbancia ADAMA Disintegrin and Metalloproteinase Desintegrina y Metaloproteinasa AGAparato de Golgi ARIAAcetylcholine Receptor Inducing Activity Inductor del Receptor de Acetilcolina ATPAdenosine Triphosphate Trifosfato de Adenosín BadBcl2 Antagonist of Cell Death Antagonista de Bcl2 de Muerte Celular BclxLBcl2like 1 protein Proteína similar a Bcl2 1 BRCABreast Cancer Type 1 Susceptibility Protein Proteína de Susceptibilidad al Cáncer de Mama de Tipo I BSABovine Serum Albumin Seroalbúmina Bovina CaMKCalcium/CalmodulinDependent Serine/ThreonineProtein Kinase 1 Quinasa de Serina/Treonina Dependiente de Calcio/Calmodulina 1 CdkCell Division Protein Kinase Proteina Quinasa de División Celular cDNAComplementary Deoxyribonucleic Acid Ácido Desoxiribonucleico Complementario CHOChinese Hamster Ovary Ovario de Hámster Chino CHXCyclohexymide Cicloheximida COPICoat Protein I Proteína de Cubierta I COPIICoat Protein II Proteína de Cubierta II CRCColorectal Cancer Cáncer Colorrectal CRDCysteinRich Domain Dominio Rico en Cisteínas 2+ CREBResponse Element Binding ProteinCa /cAMP 2+ Proteína de Unión al Elemento de Respuesta a Ca /cAMP
6 AbreviaturasCYR61Cysteinerich Angiogenic Inducer 61 Inductor 61de la Angiogénesis Rico en Cisteínas DaDalton DAPI4'6Diamidino2Phenylindole Diclorhidrato de 4',6Diamidino2Fenilindol DEPCDiethylpyrocarbonate Dietilpirocarbonato DGDiacylglycerol Diacilglicerol DMEMDulbecco’s Modified Eagle’s Medium Medio de Eagle Modificado por Dulbecco DMSODimethyl Sulfoxide Dimetil Sulfóxido DNADeoxyribonucleic Acid Ácido Desoxiribonucleico dNTPDeoxynucleotides Triphosphate Desoxinucleótidos Trifosfato D.O.Densidad Óptica DON1Divergent of Neuregulin1 Divergente de Neuregulina1 DOXDoxycycline Doxiciclina 4EBP1Eukaryotic Translation Initiation Factor 4EBinding Protein 1 Proteína de Union al Factor de Inicio de la Traducción 4E 1 EDTAEthylenediaminetetraacetic Acid Ácido Etilendiaminotetraacético EGFEpidermal Growth Factor Factor de Crecimiento Epidérmico EGFREpidermal Growth Factor Receptor Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico eIF4EEukaryoticTranslation Initiation Factor 4B Factor de Inicio de la Traducción Eucariota 4B CREBcAMP Response ElementBinding Protein Proteína de Unión al Elemento de Respuesta a AMP Cíclico EphB2Ephrin TypeB Receptor 2 Receptor de Efrina de Tipo B 2 ErbBErythroblastic Leukemia Viral Oncogene B Oncogén Viral de la Leucemia de Eritroblastosis B Erk1/2Extracellular SignalRegulated Kinase1/2 Quinasa Regulada por Señales Extracelulares 1/2
Erk5
FACS
FAK
FITC
Flt1
Gab
GABP
GAPDH
GFP
GGF
GM130
GPCR
Grb
GST
H&N
HA
HBEGF
HDAC2
HEK
HEPES
Extracellular SignalRegulated Kinase5 Quinasa Regulada por Señales Extracelulares 5 Fluorescence Activated Cell Sorter Clasificación Celular por Fluorescencia Focal Adhesion Kinase Quinasa de Adhesiones Focales Fluorescein Isothiocyanate Isotiocianato de Fluoresceína Fmslike Tyrosine Kinase 1 Tirosina Quinasa Similar a Fms1 GRB2AssociatedBinding Protein Proteína de Unión Asociada a GRB2 Growth AssociatedBinding Protein Proteína de Unión Asociada al Crecimiento Glyceraldehyde 3Phosphate Dehydrogenase Gliceraldehido 3Fosfato Deshidrogenasa Green Fluorescent Protein Proteína Verde Fluorescente Glial Growth Factor Factor de Crecimiento Glial Golgi Matrix Protein of 130 kDa Proteína de 130 kDa de la Matriz del Golgi GProteinCoupled Receptor Receptor Asociado a Proteína G Growth Factor ReceptorBound Protein Proteína Unida a Receptor de Factor de Crecimiento GlutationSTransferase GlutatiónSTransferasa Head and Neck Cabeza y Cuello Haemaglutinin Hemaglutinina Heparin Binding Epidermal Growth Factor Factor de Crecimiento Epidérmico de Unión a Heparina Histona Deacetilasa 2 Histona Deacetilasa 2 Human Embrionary Kidney Riñón Embrionario Humano 4(2Hydroxyethyl)1Piperazineethanesulfonic Acid Ácido 4(2Hidroxietil)1Piperazineetanosulfónico
Abreviaturas7
8 AbreviaturasHERHuman Epidermal Growth Factor Receptor Receptor del Factor Epidérmico Humano HGFHepatocyte Growth FactorFactor de Crecimiento de Hepatocitos HIF1αHypoxiaInducible Factor 1α Factor Inducible por Hipoxia 1α HRPHorseradish Peroxidase Peroxidasa de Rábano Hsp70Heat Shock Protein 70 Proteína de Choque Térmico 70 hUBC9Human Ubiquitin Carrier Protein 9 Proteína Humana Transportadora de Ubiquitina 9 IgImmunoglobulin Inmunoglobulina IHQImmunohistochemistry Inmunohistoquímica IPImmunoprecipitation Inmunoprecipitación IP3Inositol Triphosphate Trifosfato de Inositol IPTGIsopropylßDThiogalactopyranoside Isopropilβ−DTiogalactopiranósido KGFKeratinocyte Growth Factor Factor de Crecimiento de Queratinocitos KLHKeyhole Limpet Hemocyanin Hemocianina de Lapa KRHKrebs Ringer Hepes mAbMonoclonal Antibody Anticuerpo Monoclonal MAPKMitogen Activated Protein Kinase Proteína Quinasa Activada por Mitógenos MBS3Maleimidobenzoic Acid NHydroxysuccinimide Ester NHidroxisuccinamida del Ácido mMaleimidobenzoico MCSSMedio de Cultivo Sin Suero MEKMeiosisSpecific Serine/ThreonineProtein Kinase Proteína Quinasa de Serina/Treonina Específica de Meiosis MEKKMeiosisSpecific Serine/ThreonineProtein Kinase Kinase Proteína Quinasa de la Quinasa de Serina/Treonina Específica de Meiosis MMLVRTMoloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Transcriptasa Reversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney
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