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Estudio del contenido de oligosacáridos, glicolípidos y fosfolípidos de la leche de oveja. Participación en la defensa del recién nacido frente a infecciones

De
180 pages
Colecciones : TD. Ciencias biosanitariasDBBM. Tesis del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
Fecha de publicación : 5-nov-2008
En esta tesis se han expuesto los resultados de nuestro estudio sobre ciertos aspectos de la composición química de la leche de oveja y la implicación de algunos de sus componentes en la defensa no especializada del lactante.Lo primero que hicimos fue valorar el extracto seco y el contenido de grasa de nuestra leche. A continuación se llevó a cabo un análisis del contenido de ácidos siálicos totales y de cada una de las fracciones de sialoglicoconjugados (oligosacáridos, glicoproteínas y caseínas). También se valoró el contenido de ácidos siálicos libres. Los ácidos siálicos parecen ser esenciales para el reconocimiento bacteriano. Después llevamos a cabo el estudio de los glicolípidos. En primer lugar se analizaron los glicoesfingolípidos ácidos, los gangliósidos, compuestos que portan al menos un ácido siálico en su molécula. Para completar el estudio de los glicoesfingolípidos se realizó un análisis de los glicoesfingolípidos neutros. Tras realizar el estudio de los glicoesfingolípidos se llevó a cabo el análisis de los fosfolípidos. Para finalizar con el estudio de la composición química de la leche de oveja, decidimos llevar a cabo algunos análisis de oligosacáridos. Una vez estudiados estos aspectos sobre la composición química de la leche de oveja, decidimos completar nuestro trabajo tratando de comprobar la implicación de algunos de sus componentes en la defensa del neonato, participando como falsos receptores de patógenos. Primero se realizaron ensayos de adhesión bacteriana con eritrocitos de caballo y de ovino. Se utilizaron varias cepas distintas de E. coli [cuatro enteropatogénicas (ETEC) y dos uropatogénicas (UPEC)]. Una vez comprobada la capacidad hemaglutinante de las cepas se introdujeron en los ensayos distintos compuestos para ver si afectaban o no esta capacidad hemaglutinante. Por último se realizaron ensayos de adhesión de las distintas cepas a glicolípidos y oligosacáridos de la leche de oveja separados mediante cromatografía en placas de HPTLC. Para finalizar se hicieron ensayos de adhesión de las cepas uropatógenicas humanas a oligosacáridos de la leche de oveja.In this work we have tried to explain the results of our study on certain aspects of the chemical composition of sheep s milk and the involvement of some of these components in the non-specialised defence of newborn infants.We first assessed the dry extract and the fat content of our milk.Then we carried out an analysis of the amount of total sialic acids in each fractions of sialoglicoconjugates (oligosaccharides, glycoproteins and casein). It was also assessed the amount of free sialic acids. Sialic acids appear to be essential for bacterial recognition. Afterwards we made the study of glycolipids. Firstly we analysed acid glycosphingolipids, gangliosides, which are compounds that carry at least one sialic acid in its molecule. To complete the study of glycosphingolipids we made an analysis of the neutral glycosphingolipids. After making the study of glycosphingolipids the analysis of phospholipids was carried out.To conclude the study of the chemical composition of sheep's milk, we decided to completed our work with some analysis of oligosaccharides. Once these studies on the chemical composition of sheep's milk were finished, we decided to complete our work trying to verify the involvement of some of its components in the defence of the newborn, as false receptors for some pathogens. First, bacterial adhesion was tested using horse and sheep erythrocytes. We used several different strains of E. coli [four enteropathogenic (ETEC) and two uropathogenic (UPEC).] Once the haemagglutinating ability of the strains were tested, some different compounds were introduced in the essays to test again the haemagglutinating capacity.Finally, we tested the adhesion of the different strains to glycolipids and oligosaccharides from sheep s milk separated by chromatography on HPTLC plates. Also we tested the adhesion of the uropathogenic human strains to oligosaccharides of sheep s milk.
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DEPARTAMENTODEBIOQUÍMICAY
BIOLOGÍAMOLECULAR
TESIS DOCTORAL
“ESTUDIO DEL CONTENIDO DE OLIGOSACÁRIDOS, GLICOLÍPIDOS Y FOSFOLÍPIDOS DE LA LECHE DE OVEJA. PARTICIPACIÓN EN LA DEFENSA DEL RECIÉN NACIDO FRENTE A INFECCIONES”
LORENA ZANCADA VALDERRAMA
Salamanca, 2008
PABLO HUESO PÉREZ, Profesor Titular de Universidad del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Salamanca,  AUTORIZA:  La presentación de la Tesis Doctoral titulada: “Estudio del contenido de oligosacáridos, glicolípidos y fosfolípidos de la leche de oveja. Participación en la defensa del recién nacido frente a infecciones”, que ha sido realizada bajo su dirección por la licenciada en Bioquímica Dña. Lorena Zancada Valderrama en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Salamanca.  Y para que así conste, firma el presente documento en Salamanca, a cinco de Noviembre de dos mil ocho.  Pablo Hueso Pérez
 Este trabajo ha sido financiado mediante los siguientes proyectos de investigación: xSA 019-04 del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación de la Junta de Castilla y León titulado “Estudio de la adhesión de diversos sialoglicoconjugados de los lactorremplazantes a cepas enterotoxigénicas deEscherichia coliaisladas de bovinos. Contenido en sialoglicoconjugados de la leche de cabra y oveja”. xSA053A07 del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación de la Junta de Castilla y León titulado “Glicolípidos y fosfolípidos de la leche de cabra y oveja. Estudio de la capacidad de adhesión de estos compuestos a microorganismos patógenos (cepas enterotoxigénicas deEscherichia coli) para neonatos de rumiantes”.  La autora de este trabajo ha disfrutado de una beca de formación de personal investigador de la Consejería de Educación de la Junta de Castilla y León (Orden de 14 de Noviembre de 2003).
 Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS  Me gustaría concluir este trabajo expresando mi agradecimiento a las personas que han contribuido a su desarrollo de una u otra manera:  Quiero agradecer a Ángel García Arroyo, veterinario de la Sociedad Cooperativa Ganadera de Lácteos y Derivados de Valderrodrigo (Salamanca), que nos proporcionó las muestras de leche de oveja.  Al Matadero Comarcal ASOCARSA S.A. (Salamanca) por facilitarnos la recogida de las muestras de sangre de ovino y al Dr. José Luis Vega Pla, del Laboratorio de Grupos Sanguíneos del Servició de Cría Caballar (Córdoba) por enviarnos la sangre de caballo.  Al Dr. César Raposo, del Servicio General de Espectrometría de Masas de la Universidad de Salamanca, por las facilidades a la hora de hacer los análisis de ácidos grasos.  Al Dr. Clemens Kunz, del Instituto de Ciencias Nutricionales de la Universidad de Giessen (Alemania), por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio durante unos meses y por su trato amable.  A mis compañeros de laboratorio: a Ángel y a Fedra, porque ha sido un placer compartir un tiempo con vosotros, y a Fernando, por los momentos tan agradables que hemos compartido a lo largo de estos años, te echaré de menos. A los tres, gracias por vuestro compañerismo y vuestra amistad.  A mis compañeros de Departamento, en especial a los del 106, 108 y 112. A los profesores y miembros del Departamento, por su trato cordial y su disposición para prestarme ayuda cuando fue necesaria. A Josefa por ayudarme y resolver mis dudas siempre que lo necesité.  A mis amigos, en especial a Bea y a Móni, que han estado a mi lado a lo largo de estos años, compartiendo los buenos y los malos momentos. Gracias por estar siempre ahí.  De una forma especial quiero dar las gracias a Pablo. Gracias por confiar en mí y darme la oportunidad de realizar este trabajo. Gracias por ser tan buen jefe (será difícil encontrar otro igual), y sobre todo gracias por tu cercanía y tu amabilidad.  A mi familia, mi abuela, mi hermano, y sobre todo a mis padres, porque a ellos les debo todo lo que soy. Gracias por vuestra paciencia, por vuestros consejos y gracias por quererme tanto.  A Jose, por aguantar mi mal humor (eso te toca por ser la otra mitad), por tu paciencia y tu comprensión. Por los sueños compartidos y los que quedan por compartir.
A mis padres
NUESTRO “ORO” BLANCO DE CADA DÍA La leche es un precioso regalo de la naturaleza, condición que invita a considerarla como un don divino. En todas las civilizaciones se le han atribuido propiedades milagrosas. Hace 5000 años, en la época mesolítica, el hombre ya había pasado de un estadio en el que solamente recolectaba y cazaba a otro en el que se dedicaba al cultivo y a la cría de ganado. Un buen día descubrió el ordeño y toda su vida se transformó. A partir de aquel momento, la leche fue considerada como alimento por excelencia, fuente de fortaleza y de vida.  “Según la mitología grecorromana, Hércules, hijo del todopoderoso dios Zeus y de una mortal, fue llevado por su padre para ser alimentado secretamente del pecho de su esposa, la diosa Hera, mientras ella dormía. Hércules succionaba la leche con tanta fuerza, que al dejar de mamar, la leche surgió a borbotones y se derramó. Así, la leche de la diosa le otorgó a Hércules un carácter divino, y las gotas que se dispersaron por el cielo dieron origen a la Vía Láctea.”  Como ésta, muchas otras leyendas hacen referencia a la importancia de la leche en diferentes ámbitos, ya sea como alimento, cosmético, medicina…  Tras muchos siglos de historia, cada vez es mayor el interés por conocer con detalle tanto el aspecto estructural, como el funcional, de la leche.  Este estudio trata de dilucidar algunos aspectos sobre la composición química de la leche de oveja, una gran desconocida, y la implicación de algunos de sus componentes en la defensa del neonato frente a determinadas infecciones.
ABREVIATURAS
ÌAS: ácido siálico ÌASC: ácidos siálicos unidos a caseína ÌASG: ácidos siálicos unidos a glicoproteínas ÌASL: ácidos siálicos libres
ÌASO: ácidos siálicos unidos a oligosacáridos ÌAST: ácidos siálicos totales ÌASUL: ácidos siálicos unidos a lípidos ÌBSA: seroalbúmina bovina ÌC: cloroformo ÌCHO: colesterol ÌCMP: caseinomacropéptido ÌETEC:Escherichi colienterotoxigénica ÌFA: ácido graso ÌFAME: ésteres metílicos de ácidos grasos ÌFAO: Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación ÌFFA: ácidos grasos libres ÌGal: galactosa ÌGalCer: galactosilceramida ÌGalNAc:N-acetilgalactosamina ÌGb3: globotriaosilceramida ÌGb4: globotetraosilceramida o globósido ÌGC: cromatografía de gases ÌGg: gangliósidos
ÌGlc: glucosa
ÌGlcCer: glucosilceramida ÌGlcNAc:N-acetilglucosamina ÌHPAEC-PAD: cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica  de pulsos ÌHPTLC: cromatografía en capa fina de alta resolución
ÌLacCer: lactosilceramida ÌLCFA: ácidos grasos de cadena larga ÌLR: lactorreemplazante ÌM; MetOH: metanol ÌMAPA:Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación ÌMCFA: ácidos grasos de cadena media ÌMFGM: membrana del glóbulo de grasa de la leche ÌMAG: monoacilgliceroles