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AGRADECIMIENTOS


Estas son las primeras líneas de mi tesis doctoral, y no por ello tienen menos
importancia que el resto. Es más, sin todas estas personas que citaré posteriormente
nada de lo que vendrá a continuación tendría ningún sentido. Por ello quiero agradecer:

A Juan Pedro Bolaños, por su magnífica dirección del trabajo de tesis, por sus
inagotables ideas y por ser una de las personas más eficientes que conozco. Ójala algún
día pueda ser la mitad de la mitad de lo buen científico que tú eres.

A Ángeles Almeida, por su apoyo incondicional y porque sin ella este trabajo no
sería tan bonito.

A los profesores Pablo Hueso, Marcial Llanillo y Carmen Arizmendi por
introducirme en el mundo de la investigación. A Emilio Fernández, por todo su apoyo y
por todas esas historias que nos cuenta y que ayudan a desconectar del trabajo diario.

A la Dra. Carol MacKintosh por acogerme en el laboratorio de Dundee y
tratarme como a uno más de su grupo. A Salvador Moncada por su ayuda en la
elaboración del artículo

A mis compañeros y excompañeros de laboratorio, que son muchos y cada cual
más importante. A María, por todo lo que me ha enseñado, por todas esas excursiones
del patetik team y por tener esa niña tan bonita que tanto nos ha alegrado. A Nacho, por
todo lo que me enseñó sobre biología molecular y bases de datos, porque siempre que
he necesitado algo ha estado ahí, pero sobre todo por aquellos miércoles de Guinness y
todas las cervezas que nos hemos tomado después. A Mónica Resch, por su inagotable e
impagable ayuda, por escucharme siempre que lo he necesitado y porque sin ti aún me
quedaría, al menos, un año para acabar mi tesis. A Rubén, porque a parte de compañero
ha sido un buen amigo, vas a ser un gran científico. A Julia, por tantos y tantos diálogos
y por ser tan buena chica. A Carolina, por su ayuda con el artículo. A Seila, porque a
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pesar de sus desvaríos es una gran chica que me ha hecho reír mucho, aún tenemos una
apuesta pendiente. A Miguel Veas-etc, por esos partidos de fútbol y esas partidas de
póker, has hecho más ameno mi último año en el laboratorio. A Patricia, por esas
charlas sobre música y cine que tanto me gustan. A Verónica, porque a pesar del poco
tiempo que lleva, ya sabe “chupar y montar”. A las “técnicos”; Mónica, Silvia, Carmen
y Virgina por la alegría que transmiten cuando hacen su trabajo. A tod@s esos
“extranjeros” que pasaron por el labo, a Dennis, compañero de viaje por Dublín, a Anna
por su sensibilidad, a Élena, sí sí, a Nadja, Dina, Rita, Yanina, por el buen ambiente que
supieron crear.

A toda esa gente, que siempre está ahí para ayudar en los experimentos, a
Carmela por su ayuda con las inmunos, a las chicas del “cell sorting”, a los chicos del
confocal, a la gente del animalario, a los que me han ayudado con los experimentos
radiactivos y a Tomy por ayudarnos a preparar las prácticas.

A mis amigos de Salamanca, a Abi, a pesar de su desplante de la tesis, a Patri,
que ya son muchos años juntos, y todos buenos, a Rosario y Adrián, a Isa, por esos
abrazos que tanto me gusta darte, a Javi, porque me hacía falta un hombre entre tanta
mujer, a Jose Ignacio, por nuestras pachanguillas. A los equipos de fútbol de Innova, del
INCYL y de Traducción y al de basket del Cuenca por esas cenas y por contribuir un
poco al “mens sana in corpore sano”.

A mis amigos de Ávila, por permitirme desconectar de la rutina salmantina. A
Paco, por los musetes y por escucharme tantas veces. A Neftalí, porque siempre quiere
tomarse una cerveza conmigo, ya sea en Ávila o en Frankfurt. A Futu y a Mimi por
ganarme tantas veces al mus. A Angelito, por tragarse mis chapas y por esas noches de
divagaciones transcendentales. A Luis, por ser tan buena persona. Y a todos los demás
(Jaime, Raúl, Vicen, Paco Moranco, Gil, Johan, Toño, Jimeno, Juanan, Chachi, Turón,
Mario, etc), por tantas y tantas noches de fiesta. A mi amiga Mabel, porque a pesar de la
distancia siempre parece que está cerca. A Marcos por ayudarme a conocer la nightlife
de Dundee.

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A mis padres, sin los cuales nada de esto estaría sucediendo. Porque siempre me
han apoyado en todas mis decisiones, haciéndolas mucho más fáciles de tomar. Os
quiero.

Y por último, a la persona más importante, Lorena, porque necesitaría un libro
entero para agradecerte todo lo que haces por mí, me apoyas cuando que lo necesito, me
riñes cuando me porto mal, estás todos los días a mi lado y, sobre todo, me quieres
siempre.


























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"Si no te equivocas de vez en cuando, es que no lo intentas"

Woody Allen






















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ABREVIATURAS

7-AAD 7-amino-actinomicina D
Potencial de membrana mitocondrial ∆ψ m
Akt Proteína kinasa B
AMP Adenosina monofosfato
AMP kinasa AMPK
AD Enfermedad de Alzheimer
ADP Adenosina difosfato
APC/C Complejo promotor de la anafase
ATP Adenosina trifosfato
Factor neurotrófico derivado de cerebro BDNF
BSA Albúmina sérica
DAPI 4’,6-diamino-2-fenilindol
DETA-NO (Z)-1-[2-(2-aminoetil)-(N)-(2-aminoetil) amino]-1-
diazonio-1,2-diolato
Dihidroxiacetona fosfato DHAP
DIM-PIM Dihidrocloruro de dimetil pimelimidato
DMEM Medio de Eagle modificado por Dulbecco
DNA Ácido desoxirribonucleico
DNAsa Desoxirribonucleasa
5,5’-ditio-bis-ácido 2-nitrobenzoico DTNB
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
EGF Factor de crecimiento epidérmico
F1,6Bpasa Fructosa 1,6 bisfosfatasa
F1,6P 2 β-D-fructosa-1,6-bisfosfato
F2,6Bpasa Fructosa 2,6 bisfosfatasa
F2,6P β-D-fructosa-2,6-bisfosfato 2
F6P D-fructosa 6 fosfato
FAD Flavin adenin dinucleótido
Suero fetal de ternera FCS
G3P Glicerol 3 fosfato
G6P Glucosa 6 fosfato
G6PD Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa
GA3P Gliceraldehído 3 fosfato
GABA Ácido γ-aminobutírico
GAP43 Proteína asociada a crecimiento-43
GAPDH Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa
GFAP Proteína fibrilar glial ácida
GFP Proteína verde fluorescente
GMP Guanosina monofosfato
GSH Glutation reducido
GSH-EE Glutation etil éster
GSSG Glutation oxidado
GSx Glutation
GTP Guanosina trifosfato
Het Dihidroetidina
HIF-1 Factor de hipoxia inducible 1
IGF-1 Factor de crecimiento insulínico 1
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Inosina monofosfato IMP
K Constante de disociación i
K Constante de Michaelis-Menten m
LDH Lactato deshidrogenasa
LKB1 AMP kinasa kinasa
Lipopolisacárido LPS
MAP-2 Proteína asociada a microtúbulos-2
MCT Transportador de monocarboxilato
+NAD Nicotín adenín dinucleótido (oxidado)
NADH Nicotín adenín dinucleótido (reducido)
+ Nicotín adenín dinucleótido fosfato (oxidado) NADP
NADPH tido fosfato (reducido)
NMDA N-metil-D-aspartato
NO Óxido nítrico
ORF Marco de lectura abierta
Tampón fosfato salino PBS
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PDH Piruvato deshidrogenasa
PEP Fosfoenol piruvato
PFK1 6-fosfofructo-1-kinasa
PFK2 Fosfofructokinasa 2
Pfkfb 6-fosfofructo-2-kinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa
Pfkfb1 ructosa-2,6-bisfosfatasa-1
Pfkfb2 ructosa-2,6-bisfosfatasa-2
Pfkfb3 ructosa-2,6-bisfosfatasa-3
Pfkfb4 ructosa-2,6-bisfosfatasa-4
PGI Fosfoglucosa isomerasa
Pi Fosfato inorgánico
PKA Proteína kinasa A
PKB Proteína kinasa B
PKC Proteína kinasa C
PPi Pirofosfato
PPP Vía de las pentosas fosfato
PRG1 Progestina 1
R5P Ribosa 5 fosfato
RNA Ácido ribonucleico
RNAi RNA de interferencia
RNAm RNA mensajero
ROS Especies reactivas del oxígeno
SDS Dodecilsulfato sódico
S.E.M. Error estándar de la media
shRNA Small hairpin RNA
siRNA Small interfering RNA
SOD Superóxido dismutasa
SNC Sistema nervioso central
TCA Ciclo de los ácidos tricarboxílicos
TF Tampón fosfato
TIM Triosa isomerasa
V Velocidad máxima max
X5P Xilulosa 5 fosfato
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ÍNDICE

Introducción

1. 6-fosfofructo-2-kinasa/fructosa-2,6-bisfosfatasa (Pfkfb)
1.1. Antecedentes históricos e importancia biológica
1.2. Dominios de la Pfkfb
1.3. Evolución filogenética
1.4. Isoformas de la Pfkfb y su conservación genética
1.5. Reacción catalizada por la Pfkfb
1.6. Cofactores de la Pfkfb
1.7. Activadores de la Pfkfb
1.8. Inhibidores de la Pfkfb
1.9. Isoforma de hígado
1.9.1. Información general
1.9.2 Secuencias y residuos de aminoácidos implicados en la
actividad de la enzima
1.9.3. Regulación
1.10. Pfkfb2. Isoforma de corazón
1.10.1. Información general
1.10.2. Regulación
1.11. Pfkfb3. Isoforma de cerebro
1.12. Pfkfb4. Isoforma de testículos
1.12.1. Información general
1.12.2. Regulación
2. Pfkfb3. Isoforma de cerebro
2.1 Información general
2.2. Regulación de la Pfkfb3
2.2.1. Regulación de la Pfkfb3 por fosforilación
2.2.2. Regulación de la Pfkfb3 por HIF-1 α
2.2.3. Regulación hormonal de Pfkfb3
2.3. Pfkfb3 y cáncer
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2.4. Pfkfb3 en el metabolismo cerebral
2.4.1. El cerebro: un tejido dependiente de glucosa
2.4.2. El lactato como fuente de energía en neuronas
2.4.3. La glucosa como fuente principal de energía en astrocitos
2.4.4. Los oligodendrocitos: una célula consumidora de glucosa y
lactato
2.5. Regulación diferencial de la glucolisis en neuronas y astrocitos

Hipótesis y objetivos

Material y métodos

1. Especie ensayada, condiciones del animalario y control de la edad
gestacional
2. Preparación de los cultivos celulares
2.1. Cultivo primario de neuronas
2.2. Cultivo primario de astrocitos
2.3. Cultivo de HEK293-T
3. Construcción de plásmidos
3.1. RNA de interferencia
3.1.1. Diseño de los “small hairpin RNA” (shRNA)
3.1.2. Diseño de los “small interfering RNA” (siRNA)
3.2. Sobreexpresión de proteínas
3.2.1. Sobreexpresión de las variantes alternativas RB2K3 y
RB2K6 de Pfkfb3
3.2.2. Sobreexpresión de Cdh1
3.2.3. Sobreexpresión de G6PD
3.3. Mutagénsis dirigida
4. Transfección transitoria de células en cultivo
5. Tratamiento de las células
5.1. Inhibición de la cadena transportadora de electrones
5.2. Inhibición del proteosoma
5.3. Inhibición de caspasas
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