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Second generation model complexes for the enzyme purple acid phosphatase [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Marta Zajaczkowski-Fischer

De
197 pages
INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg vorgelegt von Diplom-Chemikerin Marta Zajaczkowski-Fischer aus Krakau (Polen) Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2010 Second Generation Model Complexes for the Enzyme Purple Acid Phosphatase Gutachter: Prof. Dr. Peter Comba Prof. Dr. Roland Krämer Für meine Eltern I Acknowledgements - Danksagungen Zu allererst möchte ich Herrn Prof. Dr. Peter Comba danken für die faszinierende und anspruchsvolle Themenstellung, die dieser Arbeit zugrunde liegt. Ich habe die wissenschaftliche Freiheit bei der Ausarbeitung sehr geschätzt, aber auch die immer gewährte Anleitung und Hilfe an den kritischen Punkten dieses Unternehmens. Unheimlich dankbar bin ich auch für die vielen Möglichkeiten, Konferenzen zu besuchen und natürlich für den ermöglichten Aufenthalt in Brisbane, Australien. Nicht zu vergessen sind die vier Skiseminare, die ich immer sehr genossen habe. Furthermore, I´d like to say „thank you“ to Prof. Dr. Graeme Hanson for his advice, help and hospitality during my stay at the University of Queensland, Brisbane and beyond. I really enjoyed working with you, but I also appreciate you as a friend. Thank you very much for reading and correcting this thesis. I hope that my English was not too bad.
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INAUGURAL - DISSERTATION


zur
Erlangung der Doktorwürde
der
Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der
Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg







vorgelegt von
Diplom-Chemikerin Marta Zajaczkowski-Fischer
aus Krakau (Polen)


Tag der mündlichen Prüfung: 29.10.2010





Second Generation Model Complexes for the Enzyme
Purple Acid Phosphatase
















Gutachter: Prof. Dr. Peter Comba
Prof. Dr. Roland Krämer





Für meine Eltern
I
 
Acknowledgements - Danksagungen

Zu allererst möchte ich Herrn Prof. Dr. Peter Comba danken für die faszinierende und
anspruchsvolle Themenstellung, die dieser Arbeit zugrunde liegt. Ich habe die
wissenschaftliche Freiheit bei der Ausarbeitung sehr geschätzt, aber auch die immer gewährte
Anleitung und Hilfe an den kritischen Punkten dieses Unternehmens. Unheimlich dankbar bin
ich auch für die vielen Möglichkeiten, Konferenzen zu besuchen und natürlich für den
ermöglichten Aufenthalt in Brisbane, Australien. Nicht zu vergessen sind die vier
Skiseminare, die ich immer sehr genossen habe.
Furthermore, I´d like to say „thank you“ to Prof. Dr. Graeme Hanson for his advice, help and
hospitality during my stay at the University of Queensland, Brisbane and beyond. I really
enjoyed working with you, but I also appreciate you as a friend. Thank you very much for
reading and correcting this thesis. I hope that my English was not too bad.
Thank you to Prof. Lawrence Gahan for including me into his group during my stay in
Brisbane and his interest in and suggestions for my work. I hope I could contribute to your
research in some way. Thank you to Prof. Paul Bernhardt for his help with the bulk
electrolysis and fruitful discussions. A huge thank you to Dr. Chris Noble for his assistance
with the EPR measurements and advice in the simulation of the spectra. Without you I would
have been lost! Thanks to all the people that helped me at the UQ, including Dr. Tri Le for
NMR assistance – especially for all the 2D experiments, George Blazak for microanalysis
measurements and a lot of nice chats, Graham MacFarlane for ESI measurements, David
Rosolen for assistance with UV/vis measurements, Paul Malek Mirzayans for helping me with
the microwave reactor, Kristian Dalle for being a wonderful lab mate and our climbing
sessions, Rebecca Buchholz for introducing me into the world of kinetic experiments, and
Michelle Zee, Bianca McCarthy, Darryl Angus, Dr. Kieran Hadler, Fernandy Ely and Dr.
Eleanor Leung for their friendship. Thanks to all you lovely people at the CAI (former CMR)
for making me feel so welcome and for your help with all kinds of issues. Special thanks to
Barbara Rash for all the nice chats and her good wishes.
Ein herzliches Dankeschön auch an meine lieben AK-Kollegen in Heidelberg! Ich habe mich
wirklich wohlgefühlt bei Euch und werde Euch vermissen. Vor allem Danke an Dr. Bodo
Martin für seine unermüdliche Hilfe bei computertechnischen und –chemischen
Fragestellungen aller Art (unterstützt durch Sacha Hausberg – Danke für alles!!!) und Dr. II 
 
Marion Kerscher für Diskussionsfreude und Unterstützung beim experimentellen Part, sowie
für die Korrektur der Arbeit – ich weiß es zu schätzen, dass Du dich durch das Pamphlet
gekämpft hast! Danke an die weltbeste Laborpartnerin und mittlerweilen gute Freundin Nina
Dovalil für „einfach Alles“. Ohne Dich hätte ich bestimmt nicht mehr Spaß gehabt als in der
Geschlossenen. Danke Euch allen die mich während der vier Jahre im AK Comba begleitet,
ermutigt und unterstützt haben, die mit mir Kaffee und Bier getrunken haben, Sinn und
Unsinn geredet haben und für den alltäglichen „normalen Wahnsinn“ in 503. Vielen Dank
auch an die Nachbarn, den AK Linti, die dazu nach bestem Wissen und Gewissen beigetragen
haben. Vor allem danke ich Philipp Butzug, Thomas Zessin und Prof. Linti für Aufnahme und
Lösen der Kristallstrukturen, die in dieser Arbeit enthalten sind. Danke, liebe Marlies und
liebe Karin, für die großartige Hilfe in allen administrativen Angelegenheiten und unsere
netten Gespräche. Ohne Euch würde der Laden nicht laufen! Desweiteren danke ich auch den
Mitarbeitern der chemischen Institute in Heidelberg für vielfältige Hilfe und Unterstützung:
PD. Dr. Markus Enders und Beate Termin für die NMR-Experimente, Dr. Gross und seinem
Team für die Massenspektren, den Angehörigen des Elementaranalytischen Labors und den
zahlreichen Mitarbeitern im Hintergrund. Extra Dank an meine vier Forschis, Carolin Lang,
Kerstin Mayer, Jakob Striffler und Reida Rutte, für Eure gute Arbeit und den Einsatz den Ihr
gezeigt habt.
Für die finanziellen Mittel in Form eines Stipendiums des Graduiertenkollegs 850 danke ich
der Deutschen Forschungsgemeinschaft und für diverse Reisekostenzuschüsse danke ich
herzlich der HGS MathComp und der Graduiertenakademie.
Zuletzt danke ich meinen Eltern und meinem Mann Sven für die seelisch-moralische und auch
finanzielle Unterstützung während des Studiums und der Doktorarbeit. Ich liebe Euch.


III
 
Abstract

The present thesis is concerned with the development and characterization of new diferric
purple acid phosphatase (PAP) model systems, which include functional groups that are
meant to act as a second coordination sphere in phosphoester hydrolysis. A short review on
purple acid phosphatases, including the postulated reaction mechanisms in phosphoester
hydrolysis, and published PAP model complexes is given in Chapter 2. Furthermore,
important data regarding published bridged diferric complexes are presented, in order to have
a basis for interpretation of the analytical data in the results part.
In Chapter 3, the results on the new model complexes are presented and discussed. At
1first, the cyclam-based ligand L and its coordination chemistry are described (Chapter 3.1).
1The most important findings are the following: Ligand L predominantly forms a µ-oxo
- 1bridged diferric complex when reacted with [FeCl ] in situ. This complex, called K , can 4
readily coordinate phosphate and inactive phosphoesters, also in partly aqueous solution.
Interestingly, the inactive phosphodiester diphenylphosphate (DPP) coordinates in a
IIImonodentate mode to one Fe , whereas the monoesters para-nitrophenylphosphate (pNPP)
IIIand 1-naphthylphosphate (1-NP) bind in a bridging mode to both Fe centers. The
monodentate coordination of DPP is encouraging in terms of the intended reactivity in
phosphoester hydrolysis, as this coordination mode is believed to be the active one, leading to
a terminal hydroxide as a possible nucleophile.
2 3Chapter 3.2 deals with the phenolate-based ligands HL and H L and their coordination 3
chemistry. These ligands are derivatives of the published HBPMP ligand and incorporate
amino and amido functional groups as second coordination sphere mimics. Diferric
2 3complexes, called K and K , are obtained by in situ reaction of the ligands with a ferric salt.
A spectrophotometric pH titration was performed and revealed the pH dependent species
2distribution and the corresponding pK values of the complex solutions. K has three a
equilibria between pH 4.6 and 11, where the second equilibrium is the deprotonation of the
3second coordination sphere amines. In contrast, K has only two equilibria due to the low pK a
2of the amido protons. Regarding the coordination of phosphoesters, K shows a similar
1 IIIbehavior to K . DPP is coordinated monodentately to one Fe , whereas pNPP and 1-NP form
3bridging complexes. This is not observed with K , which shows bridging coordination with IV 
 
both, mono- and diesters, possibly due to the lack of hydrogen bond donors in the second
coordination sphere.
1 2 3The complexes K , K and K were tested for hydrolytic activity towards the activated
phosphoester substrates bis-(2,4-dinitrophenyl)phosphate (BDNPP) and 2,4-dinitrophenyl-
1 2phosphate (DNPP). The results of these experiments are presented in Chapter 3.3. K and K
are the first examples of PAP model complexes that catalyze the hydrolysis of the
phophomonoester DNPP. So far, only diester hydrolysis with PAP model complexes has been
reported in literature, while the inactive bridging coordination mode is observed for
1 2phosphomonoesters. We draw the fact, that K and K can hydrolyze monoesters, back to the
hydrogen bonding interaction of the coordinated substrates to the remote ligand parts. A
1closer analysis of the reactivity of K towards DNPP and BDNPP, based on DFT calculations,
shows that 1) BDNPP is stabilized by the interaction with the protonated cyclam in the
monodentate coordination mode, 2) the hydrolysis of DNPP has a significantly lower
activation barrier with the hydrogen bonding interactions than without and 3) this barrier is
lower than the energy barrier to a bridging coordination mode. As a conclusion, a mechanism
is proposed, where the substrate binds in a monodentate coordination mode and is
subsequently attacked by a terminal hydroxide. This active species is in equilibrium with the
inactive bridging complex. In the case of the diester BDNPP, the equilibrium is shifted to the
active species, while the monoester DNPP is more stable in the bridging coordination mode.
1The hydrolysis product remains bound to K and inhibits catalysis.

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