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Spéciation directe de métalloprotéines séparées sur gels d'électrophorèse : analyses XAS de la superoxyde dismutase et ICP-MS de protéines arseniées

De
201 pages
Sous la direction de Richard Ortega
Thèse soutenue le 01 décembre 2009: Bordeaux 1
L’analyse métalloprotéomique est un nouveau champ d’étude qui couple la détermination du protéome et l’identification, localisation et spéciation des éléments inorganiques complexés aux protéines. La faible concentration de ces hétéroéléments et la labilité possible de ceux-ci nécessite la mise en place d’outils de chimie analytique permettant une séparation des protéines à grande résolution, sans modifier la liaison protéine-hétéroélément, et une spéciation des protéines avec une technique bénéficiant d’une faible limite de détection. L’objet de cette étude est la mise en place de tels protocoles pour une application sur deux systèmes protéiques, modèles représentant les deux principales interactions métal-protéine : formation de complexes métalliques ou de liaisons covalentes. Dans une première partie, nous avons étudié la superoxyde dismutase à cuivre et zinc (CuZnSOD), protéine dont des formes mutantes sont impliquées dans une maladie neurodégénérative, la sclérose latérale amyotrophique. Les isoformes de point isoélectrique de CuZnSOD sauvage et mutante, séparées sur gel d’électrophorèse, ont été analysées par spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS). Une analyse XAS sur des protéines séparées sur gel d’électrophorèse a ainsi pour la première fois été menée. Le traitement des spectres obtenus au seuil du Zn révèle la faisabilité de cette technique et celui au seuil du Cu met notamment en évidence des différences d’état d’oxydation Cu(I) et Cu(II) entre les isoformes. Dans une seconde partie, nous avons étudié la métabolisation de l’arsenic dans le cadre de la cancérogénicité de ce métalloïde. Les protéines extraites de cellules hépatiques exposées à l’arsenic ont été séparées par électrophorèse sur gel et chromatographie en phase liquide. L’analyse des échantillons obtenus par spectrométrie de masse a mis en évidence trois espèces protéiques complexant l’arsenic.
-Superoxyde dismutase
-Arsenic
-Electrophorèse sur gel
-Spectroscopie d'absorption des rayons X
-Spectrométrie de masse
Metalloproteomic is a new discipline which ally proteome determination and the identification, location and speciation of inorganic elements bound to proteins. The low concentration of these heteroelements and sometimes their non-covalent binding to proteins need to set up analytical tools enabling the protein separation at high resolution, without any modification of the bond protein-heteroelement, and the protein speciation with a technique presenting a low detection limit. The aim of this study is to set up such protocols on two proteic systems, depicting the two main protein-heteroelement interactions: forming of metallic complexes or covalent bonds. First, we studied copper, zinc superoxide dismutase (CuZnSOD), mutants of this protein being involved in a neurodegenerative disease, the amyotrophic lateral sclerosis. Isoelectric point isoforms of wild-type and mutant CuZnSOD, separated on electrophoresis gel, were analyzed using X-ray Absorption Spectroscopy (XAS). XAS experiments on proteins separated on electrophoresis gel were performed for the first time. Data analysis at Zn K-edge demonstrated the feasibility of this technique and the ones at the Cu K-edge highlighted oxidation states Cu(I) et Cu(II) differences between isoforms. Second, we studied arsenic metabolisation to understand its carcinogenicity. Proteins extracted from hepatic cells exposed to arsenic were separated using gel electrophoresis and liquid chromatography. Samples analysis using mass spectrometry highlighted three proteic species which bind arsenic.
Source: http://www.theses.fr/2009BOR13880/document
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N° d’ordre : 3880






THÈSE

PRÉSENTÉE A

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES

Par Sylviane CHEVREUX

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR
SPÉCIALITÉ : CHIMIE ANALYTIQUE ET ENVIRONNEMENT

SPECIATION DIRECTE DE METALLOPROTEINES
SEPAREES SUR GELS D’ELECTROPHORESE :
ANALYSES XAS DE LA SUPEROXYDE DISMUTASE ET ICP-MS DE PROTEINES
ARSENIEES

Directeur de recherche : Richard Ortega




er
Soutenue le : 1 décembre 2009

Devant la commission d’examen formée de :

M. HAZEMANN Jean Louis, Directeur de recherche CNRS, Grenoble (Rapporteur)
M. LOBINSKI Ryszard, Directeur de recherche CNRS, Pau (Rapporteur)
M. MORETTO Philippe, Professeur, Université de Bordeaux 1 (Examinateur)
M. ORTEGA Richard, Directeur de recherche CNRS, Gradignan (Examinateur)

A mon père,
A Johnny, ma mère et mes sœurs,
A ma famille et mes amis,
Et au Pr Yves Pérel
4 REMERCIEMENTS

Le document que vous tenez actuellement entre vos mains ou que vous consultez sur
un écran d’ordinateur est issu d’un travail d’équipe. Il n’aurait ainsi pas pu voir le jour sans
l’aide de plusieurs personnes. A ce titre, je profite de la présence de cette section afin de
remercier ces différents contributeurs.

En tout premier lieu, je remercie mon jury de thèse, en les personnes de Jean Louis
Hazemann, Ryszard Lobinski, Philippe Moretto et Richard Ortega, pour avoir eu l’amabilité
d’accepter de faire partie de ce jury et pour s’être attentivement penché sur le contenu de ce
manuscrit et sur ma présentation afin de m’en donner un avis constructif.
Mes remerciements vont dans un second temps à Bernard Lavielle, directeur du
Laboratoire de Chimie Nucléaire Analytique et Bioenvironnementale (CNAB), pour m’avoir
accueillie au sein de son unité et à Richard Ortega, mon directeur de thèse, pour son
encadrement, sa disponibilité, l’aide qu’il m’a apporté dans certaines étapes de ce travail de
thèse et l’expertise qu’il m’a transmise dans son domaine.
Je remercie l’équipe du Groupe d’Imagerie Chimique Cellulaire et Spéciation du
CNAB, composée, outre Richard Ortega, de Guillaume Devès et Asunción Carmona, ainsi
que d’anciens membres de ce groupe, Stéphane Roudeau, Aurélien Fraysse et Thomas
Bacquart, pour m’avoir transmis leurs savoirs et savoir-faire dans leur spécialités respectives.
Pour la problématique de l’étude de la superoxyde dismutase à cuivre et zinc, mes
remerciements vont aux membres de la ligne ID26 (dont Pieter Glatzel et Tsu-Chien Weng) et
BM30b-FAME (dont Jean Louis Hazemann, Denis Testemale et Isabelle Alliot) de l’ESRF
pour m’avoir accueillie sur leurs lignes respectives et avoir permis d’effectuer des analyses
XAS de nos protéines séparées sur gel d’électrophorèse. Mes plus amples remerciements
s’adressent de même à Pier Lorenzo Solari, pour m’avoir guidé dans le traitement de données
EXAFS, mais aussi pour sa disponibilité, sa rigueur et ses conseils.
Pour la problématique de l’étude des protéines de réponse à l’arsenic, mes
remerciements visent le Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et
Environnement, dont Ryszard Lobinski, Sandra Mounicou, Christophe Pécheyran et Fanny
Claverie, pour m’avoir accueillie au sein de leur unité, pour leur disponibilité et pour avoir
ainsi eu l’amabilité d’effectuer les séparations chromatographiques de mes échantillons
protéiques, ainsi que les analyses par ICP-MS suivant les séparations des protéines par
chromatographie et électrophorèse sur gel.

5 Le bon déroulement d’une thèse nécessite la convergence de connaissances,
compétences et moyens apportés par l’entourage scientifique, mais il est aussi intimement lié
à l’entourage personnel, permettant de décompresser, se recharger et relativiser.

Je garde ainsi un excellent souvenir de soirées, concerts (B.B. King !!), repas, billards,
quiz au Frog & Rosbif (une seule victoire…), visites touristiques, séances de ciné et séances
jeux de rôles expérimentés avec différents personnels du CNAB, CENBG et LSM hors de
l’enceinte du campus : Annie-Claude, Arnaud, Benoît, Bertrand, Claire, Fredrik, Jebril,
Jérémy, Jérôme, Julien, Marie-Hélène G., Marie-Hélène V., Patrick, Pia, Serguei, Sylvie,
Thomas, Tina, Tony, Vanessa et Virginie. Mes encouragements à Guillaume, Thomas et
Vanessa qui seront les prochains doctorants du CNAB à soutenir leur thèse!
Un grand merci à mes amis, qui ont su me supporter, dans tous les sens du terme, ces
trois dernières années. Je ne les citerai pas tous pour ne pas monopoliser la place, mais je
pense plus particulièrement à Diana & Guillaume, Kamila, Nima, Thibault, Thomas, Tony et
Virginie & Eddy. Une pensée particulière pour Laura et Nadège qui sont restées en contact
malgré les années de séparation…
Et pour conclure, mes plus profonds remerciements aux deux éléments déclencheurs
de toute cette aventure, mon père et le Pr Pérel, et à ceux qui m’ont donné le courage de la
poursuivre, ma mère, mes sœurs, ma belle-mère et ma famille, notamment maternelle qui est
la plus proche du cœur malgré la distance. Et the last but not the least, merci Johnny, le pilier
et le co-artisan de cette thèse, je te dédicace les heures à écouter en boucle « The kill » et « A
beautiful lie » afin d’extérioriser tout ce stress !



6 Remerciements……….……………………………………………………………………….5

Introduction générale……………………………………………………………………….11

1. Etude d’un complexe métalloprotéique avec liaison non covalente : la superoxyde
dismutase à cuivre et zinc……………………………………………………………….19

1.1. Présentation du cadre de l’étude…………………………………………………..21
1.1.1. La superoxyde dismutase à cuivre et zinc…………………………………….21
1.1.2. Sclérose latérale amyotrophique et CuZnSOD……………………………….24
1.1.3. Cu et Zn de la CuZnSOD, lien avec la SLA………………………………….26

1.2. Préparation des échantillons……………………….………………………………30
1.2.1. Culture de levures…………………………………………………………….30
1.2.2. Extraction protéique…………………………………………………………..32
1.2.3. Dosage des protéines………………………………………………………….33
1.2.4. Prétraitements éventuels de la CuZnSOD…………………………………….34
1.2.4.1.Réduction et alkylation de la CuZnSOD………………………………….34
1.2.4.2.Exposition à H O ………………………………………………………...34 2 2
1.2.4.3.Exposition à ZnSO ……………………………………………………….35 4
1.2.5. Séparation des isoformes……………………………………………………..35
1.2.5.1.Focalisation isoélectrique…………………………………………………36
1.2.5.2.Electrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide……………..37
1.2.6. Détection de la CuZnSOD par coloration des gels d’électrophorèse…………38
1.2.7. Conditionnement et stockage des échantillons……………………………….39
1.2.7.1.Conditionnement et stockage des strips…………………………………..39
1.2.7.2.Conditionnement et stockage des gels bidimensionnels………………….39

1.3. Méthodes d’analyse…………………………………………………………………41
1.3.1. Emission de rayons X par particules chargées accélérées (PIXE, Particle-
Induced X-ray Emission)………………………………………………………..41
1.3.1.1.Principe de la technique…………………………………………………..41
1.3.1.2.Applications aux métalloprotéines………………………………………..42
1.3.1.3.Spécificités techniques lors de la mesure…………………………………43
1.3.2. Spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS, X-ray Absorption
Spectroscopy)…………………………………………………………………...44
7 1.3.2.1.Principe de la technique…………………………………………………..44
1.3.2.1.1. XANES (X-ray Absorption Near-Edge Structure)……………….45
1.3.2.1.2. EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure)……………46
1.3.2.2.Applications aux métalloprotéines………………………………………..47
1.3.2.3.Spécificités techniques lors de la mesure…………………………………48
1.3.2.3.1. L’European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble)….48
1.3.2.3.2. La ligne de lumière ID26…………………………………………49
1.3.2.3.3. La ligne de lumière BM30b-FAME………………………………50

1.4. Résultats et discussion.……………………………………………………………..52
1.4.1. Etude de la nature des isoformes de la CuZnSOD : application sur des
CuZnSOD commerciales………………………………………………………..52
1.4.1.1. Point isoélectrique des isoformes natives de CuZnSOD………………...53
1.4.1.2. Réduction et alkylation de la CuZnSOD…………………………………55
1.4.1.3. Exposition de la CuZnSOD à ZnSO …………………………………….58 4
1.4.1.4. Quantification du Cu et Zn des isoformes de la CuZnSOD par PIXE…...60
1.4.1.5. Analyses XAS aux seuils du Zn et du Cu des isoformes de la
CuZnSOD………………………………………………………………….63
1.4.1.5.1. Analyses XANES………………………………………………...63
1.4.1.5.2. Analyses EXAFS………………………………………………...71
1.4.1.6. Conclusion sur la nature des isoformes……………………………..…...81

1.4.2. Comparaison de la forme sauvage hWT et d’une forme mutante (A4V) de la
CuZnSOD……………………………………………………………………….82
1.4.2.1.Point isoélectrique des isoformes des CuZnSOD exprimées par la
levure………………………………………………………………………82
1.4.2.2. Exposition de hWT et A4V à H O ……………………………………..84 2 2
1.4.2.3. Quantification du Cu et du Zn des isoformes de la CuZnSOD par
PIXE……………………………………………………………………….87
1.4.2.4. Analyses XAS aux seuils du Zn et du Cu des isoformes de la
CuZnSOD…………………………………………………………………90
1.4.2.4.1. Analyses XANES………………………………………………...90
1.4.2.4.2. Analyses EXAFS……….………………………………………...93
1.4.2.5. Conclusion sur la comparaison entre hWT et A4V…………………….108

1.4.3. Conclusion sur les isoformes de la CuZnSOD………………………………108
8
2. Etude de complexes métalloprotéiques avec liaison covalente : protéines de réponse à
une exposition à l’arsenic……………………………………………………………...113

2.1. Présentation du cadre de l’étude…………………………………………………115
2.1.1. La problématique de l’arsenic dans le monde……………………………….115
2.1.1.1.Le contexte mondial de l’exposition à l’arsenic………………………...115
2.1.1.2.Arsenic et pathologies associées………………………………………...116
2.1.2. Devenir de l’arsenic dans le vivant……………………………………….…117
2.1.2.1.L’arsenic…………………………………………………………………117
2.1.2.2.Biotransformation de l’arsenic…………………………………………..118
2.1.2.3.Arsenic et protéines……………………………………………………...120

2.2. Préparation des échantillons……………………………………………………...122
2.2.1. Culture des cellules HepG2 et exposition à As……………………………...122
2.2.2. Extraction et dosage des protéines…………………………………………..123
2.2.3. Purification de l’extrait protéique…………………………………………...124
2.2.4. Séparation par focalisation isoélectrique……………………………………126
2.2.5. Séparation par chromatographie d’exclusion stérique………………………126
2.2.5.1.Présentation de la technique……………………………………………..126
2.2.5.2.Spécificités techniques…………………………………………………..127
2.2.6. Conditionnement et stockage des échantillons……………………………...128
2.2.6.1.Conditionnement et stockage des gels d’électrophorèse….……………..128
2.2.6.2.Conditionnement et stockage des échantillons liquides…………………128

2.3. Méthode d’analyse : la spectrométrie de masse avec ionisation par plasma
d’argon …………………………………………………………………..………...130
2.3.1. Principe de la spectrométrie de masse………………………………………130
2.3.2. Application à l’étude de protéines séparées sur gel d’électrophorèse………132
2.3.3. Spécificités techniques………………………………………………………133
2.3.3.1.Etude des extraits protéiques liquides par ICP-MS et HPLC couplée à
l’ICP-MS…………………………………………………………………133
2.3.3.2.Etude des protéines séparées sur gel d’électrophorèse par ablation laser
couplée à l’ICP-MS………………………………………………………134

2.4. Résultats et discussion……………………………………………………………136
9 2.4.1. Identification en masse de protéines fixant As……………………………...136
2.4.2. Identification des zones de pI de protéines fixant As……………………….159

Conclusion et perspectives……..…………………………………………………………..171

Références bibliographiques………………………………………………………………181
10