Structural and functional characterisation of photosystem II from two His-tagged transplastomic strains of Nicotiana tabacum [Elektronische Ressource] / von Dario Piano

Mainuser

Sujets

• Biologie

Informations

• Publié par: goethe_universitat_frankfurt_am_main
• Publié le: 01 janvier 2007
• Nombre de lectures: 11
• Langue: English
• Poids de l'ouvrage: 8 Mo

Extrait

Structural and functional characterisation of
Photosystem II from two His-tagged
transplastomic strains of Nicotiana tabacum






Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften



vorgelegt beim Fachbereich Biowissenschaften
der Johann Wolfgang Goethe – Universität
in Frankfurt am Main





von
Dario Piano
aus Sardara


Frankfurt am Main 2007
(D30)

1














Vom Fachbereich -----------------------------------------------------------------------------der


Johann Wolfgang Goethe-Universität als Dissertation angenommen.


















Dekan:------------------------------------------------------------------------------------------------

Gutacher:--------------------------------------------------------------------------------------------

Datum der Disputation:--------------------------------------------------------------------------




2
Table of contents

Zusammenfassung -----------------------------------------------------------------------------------------1

Summary ----------------------------------------------------------------------------------------------------6

Abbreviations -----------------------------------------------------------------------------------------------9

I. Introduction --------------------------------------------------------------------------------------------10

1.0. Origin and evolution of the photosynthesis -------------------------------------------------- 11

1.1. Origin of the photosynthetic machinery: phylogeny and structural origin ---------------12

1.2 Photosystem II composition in cyanobacteria, algae and higher plants ------------------14

1.2.1. Intrinsic subunits -----------------------------------------------------------------------14

1.2.2. Extrinsic subunits ----------------------------------------------------------------------17

1.3 Electron-transfer and charge separation in Photosystem II --------------------------------19

1.4 Light harvesting and photoprotection ---------------------------------------------------------22

1.5 Aims of this work --------------------------------------------------------------------------------30

II. Material and methods --------------------------------------------------------------------------------32

2.0. Material -------------------------------------------------------------------------------------------32

2.0.1 Suppliers --------------------------------------------------------------------------------32

2.0.2 Chemicals -------------------------------------------------------------------------------33

2.1. Equipment ----------------------------------------------------------------------------------------36

2.1.1. General Equipment --------------------------------------------------------------------36

2.1.2. PSII and lipids purification equipment ---------------------------------------------36

2.1.3. PSII analysis equipment --------------------------------------------------------------37

2.2. Methods -------------------------------------------------------------------------------------------38

2.2.1. Biological material and culture of tobacco plants --------------------------------38

2.2.2. Thylakoid preparation ----------------------------------------------------------------38

2.2.3. Photosystem II preparation by differential centrifugation -----------------------39

3
2+2.2.4. Photosystem II preparation by Ni -NTA affinity chromatography ------------40


2.2.5. Chlorophyll determination (Chl a + Chl b) ----------------------------------------41

2.2.6. Absorption spectroscopy --------------------------------------------------------------42

2.2.7. SDS Polyacrylamide gel electrophoresis -------------------------------------------42

2.2.8. Blue Native Polyacrylamide gel electrophoresis ----------------------------------43

2.2.9. Western blot ----------------------------------------------------------------------------44

2.2.10. Protein identification by MALDI-TOF, MALDI-Q-TOF mass spectrometry and
bioinformatics --------------------------------------------------------------------------45

2.2.11. Gel filtration ----------------------------------------------------------------------------45

2.2.12. Oxygen evolution ----------------------------------------------------------------------45

2.2.13. Two-dimensional crystallisation of photosystem II -------------------------------46

2.2.14. Electron microscopy ------------------------------------------------------------------46

Sample preparation and single particles analysis ---------------------------46

Electron crystallography --------------------------------------------------------47

2.2.15. Isolation of thylakoid lipids ----------------------------------------------------------48

2.2.16. Thin layer chromatography ----------------------------------------------------------48

2.2.17. Pigment determination by HPLC ----------------------------------------------------48

III. Results ---------------------------------------------------------------------------------------------------49

3.0. PSII purification and characterisation from transplastomic tobacco -----------------------49

3.1. Thylakoid purification ----------------------------------------------------------------------------49

3.2. PSII purification -----------------------------------------------------------------------------------51

3.2.1. Thylakoid solubilisation --------------------------------------------------------------51

3.2.2. Ni-NTA binding and washing --------------------------------------------------------54

3.2.3. Elution and concentration ------------------------------------------------------------56

3.3. Sample characterisation -------------------------------------------------------------------------59

3.3.1. PSII subunit characterisation --------------------------------------------------------59

4
3.3.2. The PSII subunits PsbS and Psb27 --------------------------------------------------62

3.3.3. PSII lipids and cofactors characterisation -----------------------------------------65


3.3.4. PSII purity analyses -------------------------------------------------------------------68

3.4. PSII functionality assay-------------------------------------------------------------------------73

3.5. Two dimensional crystallisation of PSII from spinach -------------------------------------74

IV. Discussion ----------------------------------------------------------------------------------------------78

V. References ----------------------------------------------------------------------------------------------85

Acknowledgments ---------------------------------------------------------------------------------------97


































5


Zusammenfassung

Photosystem II (PSII) ist ein Polypeptid-Kofaktor-Komplex, dessen Untereinheiten als
Homodimer organisiert vorliegen und in höheren Pflanzen in den Granabereichen der
Thylakoidmembran eingebettet sind. PSII Monomere wiederum bestehen aus Hetero-
Oligomeren, die pseudo-symmetrisch um eine Achse positioniert sind, welche
rechtwinklig zur Membranebene steht (Loll et al. 2005). PS II agiert als photochemisch
aktives Enzym, das mit Hilfe der gebundenen Chlorophylle Photonen einfängt und unter
Beteiligung weiterer Kofaktoren einen Elektronenfluss von Wasser zu Plastochinon
betreibt. Dabei wird gleichzeitig molekularer Sauerstoff frei gesetzt. Die primäre
Ladungstrennung findet nach Absorption eines Photons im PSII Kern statt, welcher sich
aus den Untereinheiten D1, D2, den α- und β-Untereinheiten von Cytochrom b (PsbE 559
und PsbF) sowie den Chlorophyll a-bindenden Kernantennen CP47 und CP43
zusammensetzt (Loll et al. 2005). Bei den übrigen Polypeptiden des Photosystems II
handelt es sich um niedermolekulare Proteine, deren Funktion in vielen Fällen noch
nicht geklärt ist. Einige dieser Untereinheiten werden im Chloroplasten kodiert (PsbE,
F, H, I, J, K, L, M, N, T und Z) während andere im Nukleus kodiert werden (PsbR, S,
W und X). Im Allgemeinen bilden sie eine bis vier transmembrane Helices (Barber et
al. 1997). Der Teil des Photosystems II, der für die Spaltung von Wasser zuständig ist,
besteht aus einem Mn -Ca Übergangskomplex. Dieser ist im Thylakoidlumen lokalisiert 4
und wird Wasser spaltender oder Sauerstoff bildender Komplex genannt. In höheren
Pflanzen wird er durch die extrinsischen Unte