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Synthèse d'oligosaccharides de chondroïtines et de sulfates de chondroïtines biotinylés pour l'étude de la biosynthèse des protéoglycanes du cartilage, Synthesis of biotinylated chondroitin and chondroitin sulfate oligosaccharides for biosynthesis study of cartilage's proteoglycans

De
313 pages
Sous la direction de Jean-Claude Jacquinet
Thèse soutenue le 30 novembre 2009: Orléans
L’arthrose est la plus fréquente des maladies articulaires pour laquelle aucun traitement efficace n’est aujourd’hui disponible. Elle est caractérisée par une destruction du cartilage et de ses composants, dont font partie les protéoglycanes. Les principaux protéoglycanes cartilagineux sont les sulfates de chondroïtines, qui sont de longs polysaccharides linéaires hétérogènes composés d’unités disaccharidiques répétitives constituées d’un acide-D-glucuronique et d’une N-acétyl-D-galactosamine. Dans le but d’étudier la biosynthèse de ces composés et ainsi de mieux comprendre le mécanisme d’action des enzymes qui y sont impliquées, la synthèse chimique d’oligosaccharides de chondroïtines et de sulfates de chondroïtines biotinylés a été réalisée. Grâce à une méthodologie efficace et innovante basée sur une hydrolyse acide d’un polymère de sulfates de chondroïtines, des intermédiaires clés ont rapidement été obtenus. Une stratégie d’élongation les utilisant a ensuite été appliquée pour conduire à une première famille de sept oligosaccharides non sulfatés (du disaccharide à l’octasaccharide). Deux nouvelles familles d’oligosaccharides de sulfates de chondroïtines A et C, sulfatés de façon homogène ont été préparées, à partir d’un précurseur commun par stratégie divergente. Pour la première fois, deux oligosaccharides de sulfate de chondroïtine A, présentant une sulfatation hétérogène, ont également été synthétisés. Ces travaux ont mené à la préparation de treize oligosaccharides biotinylés finaux.
-Oligosaccharides biotinylés
-Sulfates de chondroïtines
Osteoarthritis is the most frequent articular disease but until now no treatment exists. It is characterized by a destruction of cartilage and its components as proteoglycans. Major cartilage’s proteoglycans are chondroitin sulfate, which are linear and heterogeneous polysaccharides composed of disaccharidic repeating units constituted of a D-glucuronic acid and an N-acetyl-D-galactosamine. In order to study biosynthesis of those compounds and so to better understand working mechanism of the implicated enzymes, chemical syntheses of biotinylated chondroitin and chondroitin sulfate oligomers have been achieved. Thanks to an efficient hydrolysis of a starting chondroitin sulfate polymer, key building blocks were quickly obtained. An elongation strategy using them has been then applied to give a first family of seven non sulfated oligosaccharides (from disaccharide to octasaccharide). Two new families of chondroitin sulfate A and C oligosaccharides, with homogeneous sulfation have been prepared from a common precursor by divergent strategy. For the first time, two chondroitin sulfate A oligosaccharides with an heterogeneous sulfation have been synthetized. This work has led to thirteen final biotinylated oligosaccharides.
-Biotinylated oligosaccharides
-Chondroitin sulfate
Source: http://www.theses.fr/2009ORLE2036/document
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UNIVERSITÉ D’ORLÉANS



ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES ET TECHNOLOGIES

Institut de Chimie Organique et Analytique

THÈSE présentée par :
Aude VIBERT


Soutenue le : 30 novembre 2009

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université d’Orléans
Discipline : Chimie Organique

SYNTHESE D’OLIGOSACCHARIDES DE
CHONDROITINES ET DE SULFATES DE
CHONDROITINES BIOTINYLES POUR L’ETUDE
DE LA BIOSYNTHESE DES
PROTEOGLYCANES DU CARTILAGE

THÈSE dirigée par :
M. Jean-Claude JACQUINET Directeur de Recherche INSERM, Orléans

RAPPORTEURS :
M. David BONNAFFE Professeur, Université de Paris-Sud, Orsay
M. Vincent FERRIERES Professeur, ENSC, Rennes
______________________________________________________

JURY :
M. Olivier MARTIN Professeur, Orléans, Président du jury
M. David BONNAFFE Professeur, Université de Paris-Sud, Orsay
M. David CRICH Professeur, ICSN, Gif-sur-Yvette
M. Vincent FERRIERES Professeur, ENSC, Rennes
Mme Chrystel LOPIN-BON Maître de conférences, Orléans
M. Jean-Claude JACQUINET Directeur de Recherche INSERM, Orléans
tel-00471388, version 1 - 8 Apr 2010


































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UNIVERSITÉ D’ORLÉANS




ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES ET TECHNOLOGIES

Institut de Chimie Organique et Analytique

THÈSE présentée par :
Aude VIBERT


Soutenue le : 30 novembre 2009

pour obtenir le grade de : Docteur de l’université d’Orléans
Discipline : Chimie Organique

SYNTHESE D’OLIGOSACCHARIDES DE
CHONDROITINES ET DE SULFATES DE
CHONDROITINES BIOTINYLES POUR L’ETUDE
DE LA BIOSYNTHESE DES
PROTEOGLYCANES DU CARTILAGE

THÈSE dirigée par :
M. Jean-Claude JACQUINET Directeur de Recherche INSERM, Orléans

RAPPORTEURS :
M. David BONNAFFE Professeur, Université de Paris-Sud, Orsay
M. Vincent FERRIERES Professeur, ENSC, Rennes
______________________________________________________

JURY :
M. Olivier MARTIN Professeur, Orléans, Président du jury
M. David BONNAFFE Professeur, Université de Paris-Sud, Orsay
M. David CRICH Professeur, ICSN, Gif-sur-Yvette
M. Vincent FERRIERES Professeur, ENSC, Rennes
Mme Chrystel LOPIN-BON Maître de conférences, Orléans
M. Jean-Claude JACQUINET Directeur de Recherche INSERM, Orléans

tel-00471388, version 1 - 8 Apr 2010























tel-00471388, version 1 - 8 Apr 2010















































A mes parents,
A mes soeurs,
A tous ceux qui m’ont soutenue.

tel-00471388, version 1 - 8 Apr 2010


















































tel-00471388, version 1 - 8 Apr 2010 Remerciements

Ces travaux de thèse ont été réalisés au sein l’Institut de Chimie Organique et Analytique
(UMR 6005) de l’Université d’Orléans, sous la direction du Docteur Jean-Claude Jacquinet et
du Docteur Chrystel Lopin-Bon.

Je remercie le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche et l’ANR-05-BLAN
(GAG-GT) pour leur soutien financier.

Je tiens à remercier Messieurs David Bonnaffé, Professeur à l’Université de Paris-Sud et
Vincent Ferrières, Professeur à l’Ecole Nationale Supérieure de Chimie de Rennes, d’avoir
accepté de juger ce travail en étant rapporteurs.
Je remercie également Messieurs David Crich, Professeur à l’Institut de Chimie des
Substances Naturelles de Gif-sur-Yvette et Olivier Martin, Professeur à l’Université
d’Orléans, d’avoir aimablement accepté de prendre part à mon jury de thèse.

Un grand merci à Monsieur Jean-Claude Jacquinet, Directeur de Recherche INSERM, pour ce
sujet de thèse qui m’a tant apporté. Merci pour tous ses bons conseils et la pédagogie dont il
m’a fait profiter, pour toutes nos dicussions mais surtout d’avoir été un directeur de thèse si
disponible et présent du début à la fin.

Un énorme Merci à Madame Chrystel Lopin-Bon, maître de conférences à l’Université
d’Orléans, pour son aide et son soutien pendant mes quatre années au laboratoire. Merci
d’avoir été si patiente et si disponible pour les nombreuses répétitions de mes
communications orales, mes corrections, pour nos intenses séances d’analyses de spectres
RMN, pour nos manipulations en duo (les bonnes et les mauvaises), pour ses conseils pour le
présent et pour l’avenir et son soutien permanent. Merci d’avoir été une encadrante comme il
en existe peu. Et un merci tout particulier à Franck d’avoir été si patient et compréhensif.

Mes remerciements s’adressent aussi à Madame Valérie Desvergnes, Chargée de Recherche
CNRS, avec qui j’ai effectué mon premier stage à l’ICOA et qui a su me faire partager et me
transmettre sa passion pour la recherche en chimie organique et qui m’a donné l’envie de faire
une thèse.
Merci aussi à Monsieur Vincent Pomel, qui a été mon superviseur lors de mon stage en
entreprise, pour avoir conforté cette envie.

Je n’oublie pas les anciennes du labo 8. Farah, ma collègue de laboratoire et de bureau
pendant un an et demi et Caryn, avec qui j’ai passé de bons moments. Un merci plus
particulier à Emmanuelle pour nos fous-rire parfois dus à sa maladresse au laboratoire et puis
par la suite pendant nos séances de sport…

Merci à tous ceux avec qui j’ai partagé une ou plusieurs années à l’ICOA. Mes compagnons
du déjeuner à la tisanerie : Myriam (mon taxi lors de ma première année de fac), Arnaud,
Nathalie, mais aussi Christelle (ma voisine), Virginie (ma voisine du labo 7, pour toutes nos
discussions au labo, en congrès et lors de nos soirées), Ugo (avec qui j’ai découvert les joies
de l’enseignement, les cours du CIES, la chimie générale,…), Catherine, Niko, Sylvestre,
Matthieu, Ana Catarina, Sandrina, Sandrine, Deimante, Elise, Jérôme, Abdel, Laurent, Fred,
Nico, Aurélien, Alexis, Monika, Fabien, Mathieu, Emeline, Sophie, Estelle, Franck, Raphaël,
Emilie, Jean-Marie et tous les autres pour la bonne ambiance qui règne au sein de l’Institut.

Je tiens également à remercier les stagiaires qui sont passés au laboratoire, Claire, Rémi,
Romain, Thomas et plus particulièrement Anne-Catherine (la championne du TCA).
tel-00471388, version 1 - 8 Apr 2010


Je remercie aussi Véronique avec qui les TP fûrent un réel plaisir, pour son aide précieuse et
sa bonne humeur pendant ces séances. Un merci tout particulier à Hélène, en premier lieu
pour nos premiers TP et surtout, par la suite, pour avoir été une collègue de laboratoire si
agréable. Merci d’avoir été si enthousiaste et impliquée lorsque nous avons travaillé ensemble
et puis pour toutes nos discussions chimiques et parfois (même souvent) culinaires!, pour tous
les bons moments que nous avons passé ensemble.

J’adresse un grand merci à mes amies Sophie et Camille pour nos escapades et toutes nos
discussions, à Laetitia pour avoir été une oreille attentive pendant nos soirées.

Je remercie profondément Julien pour m’avoir toujours soutenue, pour avoir su m’encourager
et trouver les mots justes à chaque instant.

Et enfin, je remercie de tout cœur mes parents (merci pour tout), mes sœurs Charlotte et
Alice, ma grand-mère, mes grands-parents, ma famille pour leur soutien quotidien et leurs
mots réconfortants et sans qui cette thèse n’aurait pu être accomplie.























tel-00471388, version 1 - 8 Apr 2010 Sommaire

SOMMAIRE SOMMAIRE



ABREVIATIONS ..................................................................................................................- 1 - ABREVIATIONS
INTRODUCTION ........................................................................ -3-Erreur ! Signet non défini.
I- INTRODUCTION BIOLOGIQUE...................................................................................- 4 -
I-1 L’ARTHROSE ET LE CARTILAGE...................................................................................- 4 -
I-1.1 Arthrose : Généralités ....................................................................................................................- 4 -
I-1.2 Cartilage et articulation .................................................................................................................- 5 -
I-1.3 Le processus arthrosique................................................................................................................- 6 -
I-2 LES PROTEOGLYCANES (PGs) ........................................................................................- 8 -
I-2.1 Définition .........................................................................................................................................- 8 -
I-2.2 Structures et propriétés des protéoglycanes...............................................................................- 11 -
I-3 LES SULFATES DE CHONDROITINES (CS).................................................................- 12 -
I-3.1 Définition et structure ..................................................................................................................- 12 -
I-3.2 Propriétés biologiques ..................................................................................................................- 13 -
I-4 BIOSYNTHESE DES PROTEOGLYCANES ...................................................................- 15 -
I-4.1 Biosynthèse....................................................................................................................................- 15 -
I-4.2 Polymérisation des chaînes de sulfates de chondroïtines...........................................................- 16 -
I-4.3 Conclusion .....................................................................................................................................- 17 -
I-5 NECESSITE DE LA SYNTHESE CHIMIQUE ................................................................- 17 -
IIII-- TTRRAAVVAAUUXX DDEE SSYYNNTTHHEESSEESS DDEECCRRIITTSS DDAANNSS LLAA LLIITTTTEERRAATTUURREE.......................- 18 -
II-1 SYNTHESES PAR VOIE CHIMIQUE.............................................................................- 18 -
II-1.1 Première synthèse d’un disaccharide de sulfate de chondroïtine A........................................- 18 -
II-1.2 Synthèse de disaccharides de sulfates de chondroïtines A et C...............................................- 20 -
II-1.3 Synthèse d’un trisaccharide de sulfate de chondroïtine A.......................................................- 21 -
II-1.4 Synthèse de di-, tri- et tétrasaccharides de chondroïtines et sulfates de chondroïtines A, C et E-
23 -
II-1.5 Synthèse de disaccharides réducteurs de sulfates de chondroïtines A et C ...........................- 25 -
II-1.6 Synthèse de pentasaccharides de sulfates de chondroïtines A et C.........................................- 27 -
II-1.8 Synthèse de di- et tétrasaccharide de sulfate de chondroïtine E .............................................- 31 -
II-1.9 Synthèse d’un hexa- et d’un octasaccharide de sulfate de chondroïtine E.............................- 33 -
II-1.10 Synthèse d’oligomères de chondroïtines à partir d’un polymère..........................................- 33 -
IIII--22 SSYYNNTTHHEESSEESS PPAARR VVOOIIEE EENNZZYYMMAATTIIQQUUEE....................................................................- 36 -
II-2.1 Synthèse de 2000..........................................................................................................................- 36 -
II-2.2 Synthèse chimio-enzymatique à partir d’un intermédiaire oxazoline ....................................- 37 -
II-2.1 Synthèse séquentielle d’oligosaccharides de chondroïtines via l’utilisation d’une chondroïtine
polymérase mutante ..............................................................................................................................- 39 -
II-3 SYNTHESE COMBINATOIRE ........................................................................................- 40 -
IIII--44 CCOONNCCLLUUSSIIOONN....................................................................................................................- 42 -
III- STRATEGIE DE SYNTHESE ....................................................................................- 43 -
III-1 STRUCTURE DES OLIGOSACCHARIDES SYNTHETISES....................................- 43 -
III-2 BIOTINE/STREPTAVIDINE...........................................................................................- 44 -
III-3 STRATEGIE DE SYNTHESE .........................................................................................- 45 -
tel-00471388, version 1 - 8 Apr 2010 Sommaire

IV- SYNTHESE DES OLIGOSACCHARIDES NON SULFATES .................................- 48 -
IV-1 RETROSYNTHESE ..........................................................................................................- 48 - IV-1 RETROSYNTHESE
IV-2 PREPARATION DE L’UNITE DISACCHARIDIQUE DE BASE 118_......................- 50 -
IV-2.1 Dépolymérisation d’un polymère de sulfates de chondroïtines..............................................- 50 -
IV-2.2 Hydrolyse du polymère de CS ..................................................................................................- 52 -
IV-2.3 Protection de l’amine.................................................................................................................- 53 -
IV-3 SYNTHESES DU DISACCHARIDE DONNEUR CLE 88............................................- 56 - IV-3 SYNTHESES DU DISACCHARIDE DONNEUR CLE 88
IV-3.1 Protection des hydroxyles libres ...............................................................................................- 56 -
IV-3.2 Activation de la position anomérique : synthèse du trichloroacétimidate acétylé 88 ..........- 57 -
IV-4 SYNTHESE DU DISACCHARIDE BIOTINYLE 122...................................................- 60 -
IV-4.1 Glycosylation..............................................................................................................................- 60 -
IV-4.2 Réduction du groupement N-trichloroacétyle.........................................................................- 60 -
IV-4.3. Déprotection des esters.............................................................................................................- 61 -
IV-4.4 Couplage avec la biotine............................................................................................................- 61 -
IV-5 SYNTHESE DES BLOCS CLES 93 ET 121 ET STRATEGIE D’ELONGATION ....- 65 -
IV-5.1 Synthèse du bloc donneur clé : le trichloroacétimidate lévulinoylé 93..................................- 65 -
IV-5.2 Synthèse du bloc accepteur clé : le disaccharide 121 ..............................................................- 69 -
IV-5.3 Stratégie d’élongation................................................................................................................- 71 -
IV-6 SYNTHESES DES OLIGOSACCHARIDES PROTEGES ......................................- 72 -
IV-6.1 Synthèse du trisaccharide n = 1, m = 0.....................................................................................- 72 -
IV-6.2 Synthèse du tétrasaccharide n =1, m = 1..................................................................................- 72 -
IV-6.3 Synthèse du pentasaccharide (n = 2, m = 0) et de l’hexasaccharide (n = 2, m = 1)...............- 73 -
IV-6.4 Synthèse de l’heptasaccharide (n = 3, m = 0) et de l’octasaccharide (n = 3, m = 1) .............- 74 -
IV-7 SYNTHESES DES OLIGOMERES BIOTINYLES.......................................................- 76 -
IV-7.1 Réduction des groupements N-trichloroacétyle ......................................................................- 76 -
IV-7.2 Déprotection des esters..............................................................................................................- 79 -
IV-7.3 Couplage avec la biotine............................................................................................................- 80 -
IV-8 CONCLUSION ..............................................................................................................- 82 -
V- SYNTHESE DES OLIGOSACCHARIDES DE SULFATATION HOMOGENE EN
POSITION 4 OU 6......................................................................................................................- 83 -
V-1 PREMIERE STRATEGIE APPLIQUEE A LA SYNTHESE DE
TETRASACCHARIDES............................................................................................................- 83 - TETRASACCHARIDES
V-1.1 Synthèse du trichloroacétimidate benzylidène 173...................................................................- 85 -
V-1.2 Glycosylations « push-pull » .......................................................................................................- 85 -
V-1.3 Synthèse du disaccharide précurseur 100 .................................................................................- 87 -
V-1.4 Synthèse du tétrasaccharide : Glycosylation « push-pull »......................................................- 89 -
V-2 SECONDE STRATEGIE....................................................................................................- 91 -
V-2.1 Stratégie divergente utilisant l’acétal benzylidène ...................................................................- 93 -
V-2.2 Synthèse des blocs clés accepteurs 188 et donneurs 186 et 187................................................- 97 -
V-2.3 Synthèses des oligosaccharides protégés..................................................................................- 101 -
V-2.5 Réduction des groupements N-trichloroacétyle......................................................................- 105 -
V-2.6 Réaction de sulfatation..............................................................................................................- 113 -
V-2.7 Saponification des esters ...........................................................................................................- 116 -
V-2.8 Couplage avec la biotine ...........................................................................................................- 118 -
VV--33 CCOONNCCLLUUSSIIOONN ..................................................................................................................- 119 -
VI- SYNTHESE DES OLIGOSACCHARIDES DE SULFATATION HETEROGENE EN
POSITION 4......................................................................................................................- 120 -
VI-1 SYNTHESE DES TRISACCHARIDE ET TETRASACCHARIDE PROTEGES ....- 120 -
VI-2 DECHLOROACETYLATION.......................................................................................- 121 -
VI-3 REDUCTION DES GROUPEMENTS N-TRICHLOROACETYLES.......................- 122 - VI-3 REDUCTION DES GROUPEMENTS N-TRICHLOROACETYLES

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