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The influence of Herpesvirus saimiri oncoprotein Tip on apoptosis signaling pathways in T cells [Elektronische Ressource] = Der Einfluss des Onkoproteins Tip von Herpesvirus saimiri auf Apoptose-Signalwege in T-Zellen / vorgelegt von Stefan Richter

De
64 pages
The influence of Herpesvirus saimiri oncoprotein Tip on apoptosis signaling pathways in T cells Der Einfluss des Onkoproteins Tip von Herpesvirus saimiri auf Apoptose-Signalwege in T-Zellen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Stefan Richter aus Erlangen Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 09.12.2010 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Christian Koch Zweitberichterstatter:PD Dr. Brigitte Biesinger-Zwosta Contents I. Abstract 1 1. Abstract 1 2. Zusammenfassung in deutscher Sprache 2 II. Introduction 3 III. Rationale 11 IV. Materials and Methods 12 1. Materials 12 1.1 Bacteria 12 1.2 Cell lines 12 1.3 Media 13 1.4 Plasmids 14 1.5 Restriction enzymes 14 1.6 Oligonucleotides 15 1.7 Inhibitors, recombinant proteins, and other stimuli 16 1.8 Antibodies 16 1.9 Buffers and solutions 18 2. Methods 20 2.1 Cultivation of bacteria for plasmid preparation 20 2.2 Cell culture 20 2.3 Electroporation of eukaryotic cells 20 2.4 Cell lysis 20 2.5 Protein methods 21 2.6 Cell based methods 21 2.7 FACS analyses 22 2.8 Nucleic acid methods 23 V. Results 25 1.
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The influence ofHerpesvirus saimirioncoprotein Tip on apoptosis signaling pathways in T cells Der Einfluss des Onkoproteins Tip vonHerpesvirus saimiriauf Apoptose-Signalwege in T-ZellenDer Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.vorgelegt von Stefan Richter aus Erlangen
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg09.12.2010 Prof. Dr. Rainer Fink Prof. Dr. Christian Koch PD Dr. Brigitte Biesinger-Zwosta
Tag der mündlichen Prüfung: Vorsitzender der Promotionskommission: Erstberichterstatter:Zweitberichterstatter:
ContentsI. Abstract 1. Abstract 2. Zusammenfassung in deutscher Sprache II. Introduction III. Rationale IV. Materials and Methods 1. Materials 1.1 Bacteria 1.2 Cell lines 1.3 Media 1.4 Plasmids 1.5 Restriction enzymes 1.6 Oligonucleotides 1.7 Inhibitors, recombinant proteins, and other stimuli 1.8 Antibodies 1.9 Buffers and solutions 2. Methods 2.1 Cultivation of bacteria for plasmid preparation 2.2 Cell culture 2.3 Electroporation of eukaryotic cells 2.4 Cell lysis 2.5 Protein methods 2.6 Cell based methods 2.7 FACS analyses 2.8 Nucleic acid methods V. Results 1. Tip induces apoptosis and caspase-3 activity in human T cells 2. Caspase activity is not required for proliferation of HVS-transformed human T cells 3. Tip induces cleavage of Slp76 and Carma1
1 1 2 3 11 12 12 12 12 13 14 14 15 16 16 18 20 20 20 20 20 21 21 22 23 25 25 28 28
4. Caspase-3 cleavage is accompanied by processing of caspase-8 and PARP1 and requires tyrosine residue 114 as well as Lck-intercation motifs in Tip 29 5. Tip-induced caspase cleavage requires Src-kinase activity, expression of Lck and Zap70, but not CD45 in Jurkat T cells 30 6. Tip-induced caspase-3 processing is transmitted to neighboring cells 32 7. Tip-induced caspase cleavage proceeds with time 33 8. Tip induces the expression of TRAIL 33 9. Tip-induced caspase-3 processing is not mediated by TRAIL, FasL/Fas, or TNF-α 35 10. Caspase-8 and FADD are required for Tip-induced caspase processing 36 11. Tip induces cleavage of caspase-9 and Bid in Jurkat T cells, but overexpression of Bcl-2 is not sufficient to inhibit Tip-induced caspase cleavage 36 12. Caspase inhibition does not interfere with Tip-induced processing of caspase-3, but blocks cleavage of PARP1 38 13. Tip induces transcription and expression of granzymes 39 14. Tip inhibits ligand-induced death receptor signaling 41 15. Tip-induced downregulation of death receptor surface expression, upregulation of OPG transcription and cFlip expression as well as cFlip processing may contribute to inhibition of DR-signaling 43 VI. Discussion 45 VII. Abbreviations 51 VIII. References 52
Abstract
I. Abstract
1
1. Abstract The T-lymphotropic tumorvirus, Herpesvirus saimiri (HVS), persists in its natural host, the squirrel monkey, without causing disease. In several other New World primate species, infection can cause fatal T-cell lymphoma. HVS subgroup C strains are capable of transforming human T cells to permanent antigen-independent growth in cell culture. The viral oncoprotein Tip is essential for the transforming properties of the virus and its inducible expression leads to T-cell lymphoma in transgenic mice. Tip is also reported to induce cell death in T lymphocytes. This study now shows in transiently transfected Jurkat T cells that induction of apoptosis is restricted to overexpression of Tip. But even Tip levels insufficient to induce apoptosis trigger processing of caspase-8, -3 and PARP1, generally considered as a hallmark of apoptosis. In fact, the proapoptotic proteins TRAIL, granzyme A, and granzyme B are upregulated upon expression of wild-type Tip. However, blocking of caspase or granzyme B activity as well as neutralization of TRAIL, FasL or Fas are not sufficient to inhibit caspase-3 processing. Induction of caspase-3 cleavage depends on tyrosine residue 114 of Tip, which is required for constitutive activation of STAT3, and on multiple Lck interaction sites. Furthermore, expression and activity of Lck as well as expression of caspase-8 and FADD are essential for Tip-mediated caspase processing. Nevertheless, Tip-expressing Jurkat T cells are protected against treatment with death receptor agonists and various other apoptotic stimuli. Tip expression also disrupts death receptor-mediated NF-κB activation. Downregulation of death receptor surface expression and upregulation of decoy receptor expression may contribute to this dysregulation of death receptor signaling. Unlike Tip-expressing Jurkat T cells, HVS-transformed human T cells do not exhibit an apoptotic phenotype, but caspase-8, -3 and PARP1 are still processed. Tyrosine residue 114, but not caspase activity, is essential to induce caspase cleavage in these cells. Furthermore, inhibition of pan-caspase activity cannot block, but rather enhances their proliferation accompanied by reduced cleavage of PARP1. Expression of the cell death mediators FasL, TRAIL, TNF-α, granzyme A, and granzyme B is enhanced in human T cells transformed with wild-type HVS as compared to a tyrosine 114 mutant virus. However, Fas deficiency, neutralization of Fas, FasL, TRAIL, or TNF-αas well as inhibition of perforin and granzyme B activity are not sufficient to block processing of caspase-3 in HVS-transformed human T cells. In conclusion, these observations suggest that the previously reported apoptosis is due to an imbalance caused by overexpression of Tip. At lower concentrations, Tip activates an alternative proteolytic pathway through a mechanism involving Lck, STAT3, FADD and caspase-8. Thereby, the viral oncoprotein induces cleavage of apoptotic caspases. However, this process does not result in cell death, but rather disables death receptor signaling by TRAIL and FasL. Thus, Tip is suggested to utilize components of the death receptor signaling cascades to fine-tune non-apoptotic functions of caspase-3 contributing to T-cell growth, differentiation or effector functions.
Zusammenfassung in deutscher Sprache
2
2. Zusammenfassung in deutscher Sprache Das T-lymphotrope Herpesvirus saimiri (HVS) persistiert in seinem natürlichen Wirt, dem Totenkopfaffen, ohne eine Erkrankung zu verursachen, während die Infektion diverser anderer Spezies von Neuweltprimaten zur Entstehung von fatalen T-Zell Lymphomen führen kann. HVS-Stämme der Subgruppe C können humane T-Zellen in Zellkultur zu kontinuierlichem, Antigen-unabhängigem Wachstum transformieren. Hierfür ist das virale Onkoprotein Tip essentiell. Induzierbare Expression von Tip führt zur Bildung von T-Zell-Lymphomen in transgenen Mäusen. Tip kann allerdings auch Zelltod in T-Lymphozyten induzieren. Wie diese Arbeit anhand transient transfizierter Jurkat T-Zellen zeigt, führt lediglich Überexpression von Tip zur Induktion von Apoptose. Aber auch die Expression subapoptotischer Tip-Mengen führt zur Prozessierung von Caspase-8, -3 und PARP1. Wildtyp-Tip induziert auch eine gesteigerte Expression der proapoptotischen Proteine TRAIL, Granzym A und Granzym B. Allerdings konnte die Prozessierung von Caspase-3 nicht durch Inhibition von Caspase- oder Granzym B-Aktivität oder durch Neutralisation von TRAIL, FasL oder Fas verhindert werden. Auf der Seite von Tip ist die Spaltung von Caspase-3 abhängig von Tyrosinrest 114, der eine konstitutive Aktivierung von STAT3 durch Tip vermittelt, und von mehreren Lck-Bindungsstellen. Außerdem ist die Expression und Aktivität von Lck sowie die Expression von FADD und Caspase-8 notwendig für die Induktion der Caspase-3-Prozessierung. Trotz der konstitutiven Caspase-Spaltung sind Tip-exprimierende Jurkat-T-Zellen vor Todesrezeptor-Agonisten und anderen apoptotischen Stimuli geschützt. Dabei verhindert die Tip-Expression auch die Todesrezeptor-vermittelte NF-κB-Aktivierung. Eine reduzierte Oberflächenexpression von Todesrezeptoren sowie eine erhöhte Expression blockierender Rezeptoren könnten zu dieser abweichenden Signalverarbeitung beitragen. Anders als Tip-exprimierende Jurkat-T-Zellen weisen die HVS-transformierten humanen T-Zellen keinen apoptotischen Phänotyp auf. Dennoch sind auch hier Caspase-8, -3 und PARP1 prozessiert. Der Tyrosinrest 114, aber nicht die Caspase-Aktivität, ist essentiell für die Caspase-Spaltung. Die Hemmung der Pan-Caspase-Aktivität beeinträchtigt die Proliferation der transformierten Zellen nicht, sondern resultiert eher in verstärktem Wachstum, einhergehend mit verringerter Spaltung von PARP1. Die Expression von FasL, TRAIL, TNF-α, Granzym A und Granzym B ist höher in humanen T-Zellen nach Transformation mit Wildtyp-HVS im Vergleich zu einer Tyrosin-114-Mutante. Dennoch kann die funktionelle Inaktivierung dieser Signalmoleküle die Caspase-3-Prozessierung nicht blockieren. Zusammenfassend zeigen diese Beobachtungen, dass die früher beschriebene Apoptose-Induktion auf die Überexpression von Tip zurückzuführen ist. In niedrigeren Konzentrationen aktiviert Tip einen bisher nicht bekannten proteolytischen Signalweg, an dem auch Lck, STAT3, FADD und Caspase-8 beteiligt sind. Dadurch induziert das virale Onkoprotein die Spaltung apoptotischer Caspasen. Dieser Prozess führt selbst nicht zum Zelltod und reprimiert sogar die Wirkung TRAIL und FasL. Somit scheint Tip Komponenten der Todesrezeptor-Kaskaden zu benutzen, um nicht-apoptotische Funktionen von Caspase-3 zu steuern, welche zu Proliferation, Differenzierung oder Effektorfunktionen von T-Zellen beitragen.
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