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Transcytose à travers la barrière hémato-encéphalique : étude in vitro du transport des lipoproteines de basse densité et du peptide ß-amyloïde, Transcytosis through the blood brain barrier : in vitro studies of the transport of low density lipoprotein and ß-amyloid peptide

De
198 pages
Sous la direction de Laurence Tilloy-Fenart
Thèse soutenue le 03 décembre 2010: Artois
La Barrière Hémato-Encéphalique (BHE) est une interface localisée au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECs). Elle présente des caractéristiques structurales et métaboliques spécifiques restreignant considérablement les échanges entre le sang et le cerveau dans le but de maintenir l’homéostasie du système nerveux central (SNC). La présence de transporteurs et récepteurs au niveau de CECs permet l’apport de nutriments essentiels au fonctionnement cérébral. L’expression de ces propriétés est induite par l’environnement cérébral et notamment par la population astrocytaire. Dans notre laboratoire, la BHE est reconstituée in vitro en co-cultivant des CECs bovines et des cellules gliales primaires de rat reproduisant les principales caractéristiques de la BHE in vivo. Son utilisation a permis de mettre en évidence une voie originale de transcytose (récepteur-dépendante) assurant le transport des lipoprotéines de basse densité (LDL) vers le parenchyme cérébral. Nous avons caractérisé les premières étapes de ce processus et démontré que celles-ci impliquent des structures cellulaires spécialisées comme les cavéoles et les cavéosomes, permettant aux lipoprotéines d’être relarguées intactes vers le compartiment cérébral. Récemment, de nombreux travaux ont placé la BHE au centre des échanges des peptides β-amyloïde (Aβ) entre le sang et le cerveau. Un défaut des mécanismes de transport est suspecté d’être à l’origine de l’accumulation cérébrale de ces peptides responsables de la maladie d’Alzheimer (MA). En utilisant notre modèle in vitro de BHE, nous avons étudié l’implication des CECs dans les échanges de ces peptides. Nous avons démontré l’implication du récepteur « receptor for advanced glycation end-products » (RAGE) dans l’entrée vers le compartiment cérébral des peptides Aβ. Ce transport est spécifique et implique la voie des cavéoles. L’implication de pompes d’efflux telles que la P-glycoprotéine (P-gp) et la « breast cancer resistance protein » (BCRP) dans la restriction de l’influx des peptides Aβ a également été mise en évidence. D’autre part, des résultats préliminaires suggèrent que le récepteur « low density lipoprotein receptor-related 1 » (LRP1) n’est pas impliqué dans l’efflux des peptides Aβ. Ces résultats contribuent à apporter une meilleure compréhension du rôle de la BHE dans la MA et permettent d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques.
-Barrière hémato-encéphalique
-Transcytose
-Cavéoles
-Maladie d'Alzheimer
-Peptide ß amyloïde
-Rage
-P-gp
-Bcrp
-In vitro
The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic interface located at the brain capillary endothelial cells (BCECs) level. This barrier possesses some morphological and enzymatic properties whose aim is to maintain homeostasis of central nervous system (CNS) by firmly reducing the passages between blood and brain. BCECs express carrier-mediated transporters and receptors allowing the income of nutrients that are essential to brain function. These BBB properties come from brain environment and especially from the astrocytic population. In our laboratory, we have developed an in vitro BBB model consisting of a co-culture of bovine BCECs and new-born rat glial cells that closely mimics the in vivo situation. In this in vitro model, an original transcytosis pathway (receptor-dependent) that ensures low density lipoproteins (LDL) transport into the brain parenchyma has been discovered. We have characterized the first steps of this transport and we have shown that involve specialized cellular structures such as caveolae and caveosomes, allowing intact lipoproteins to be released into the brain compartment. Recently, many studies have considered the BBB like a very suitable site for the exchanges of amyloid β (Aβ) peptides between blood and brain. An alteration in the mechanisms of transport is suspected to result in cerebral accumulation of these peptides which are responsible for Alzheimer's Disease (AD). Using our in vitro model, we investigated the involvement of the BCECs in the exchanges of these peptides. Our works show an asymmetrical transport across the BBB suggesting the involvement of specific receptors and transporters. We have demonstrated the involvement of « receptor for advanced glycation end products » (RAGE) in the entry into the brain compartment. This transport is specific and involves the caveolae’s pathway. The involvement of P-glycoprotein (P-gp) and « breast cancer resistance protein » (BCRP) efflux pumps in restricting the influx of Aβ peptides was also highlighted. Moreover, preliminary results suggest that « low density lipoprotein receptor related-1 » (LRP1) is not involved in the efflux of Aβ peptides. These studies help to provide a better understanding of the role of the BBB in AD and allow to consider new therapeutic approaches.
Source: http://www.theses.fr/2010ARTO0404/document
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UNIVERSITÉ D’ARTOIS
U. F. R. des Sciences



THÈSE DE DOCTORAT D’UNIVERSITÉ
EN SCIENCES DE LA VIE




Présentée par
Pietra Candela



TRANSCYTOSE A TRAVERS LA BARRIERE
HEMATO-ENCEPHALIQUE : ETUDE IN VITRO DU
TRANSPORT DES LIPOPROTEINES DE BASSE
DENSITE ET DU PEPTIDE β-AMYLOÏDE




Soutenue le 3 décembre 2010



Composition du jury :


Rapporteurs :
Pr. Brigitte LEININGER-MULLER Faculté de Pharmacie, Nancy, France.
Pr. Ignacio ROMERO The Open University, Walton Hall,
United Kingdom.
Examinateurs :
Faculté de Pharmacie, Paris, France. Dr. Xavier DECLEVES
Université d’Artois, Lens, France. Pr. Romeo CECCHELLI

Directeur de Thèse :
Pr. Laurence Fenart-Tilloy Université d’Artois, Lens, France.

Tuteur de Thèse :
Dr. Fabien GOSSELET Université d’Artois, Lens, France.
1









A Thomas,
un rayon de soleil qui illumine ma vie de tous les jours.


A ma petite île … la Sicile !












Je remercie très sincèrement,

Mme le Professeur Brigitte LEININGER-MULLER et Mr le Professeur
Ignacio ROMERO,
Je vous remercie d’avoir accepté d’être les rapporteurs de cette thèse. Soyez
assurés de mon estime et de mon plus grand respect pour avoir accepté cette lourde
tâche.

Mr le Dr. Xavier DECLEVES,
Je suis très honorée que vous ayez accepté d’être l’examinateur de ce travail.
Votre examen de cette thèse et des travaux qui y sont présentés sera un privilège.
Veuillez agréer toute ma gratitude et mon plus profond respect.

Mr le professeur Roméo CECCHELLI,
Je vous remercie sincèrement de m’avoir accueilli dans votre laboratoire afin
de réaliser mes travaux de recherche, vous m’avez permis de vivre une expérience
très enrichissante. Soyez assuré de ma plus grande reconnaissance.

Mme le Professeur Laurence FENART-TILLOY,
Laurence, je te remercie très sincèrement pour ces trois années de thèse que
j’ai passées à tes côtés. Au cours de ces années, ta grande disponibilité et tes
précieux conseils m’ont permis de travailler dans les meilleures conditions. Ton
soutien et ta présence se sont avérés déterminants pour mener ce travail à terme !
Un grand merci pour tout !

Mr le Docteur Fabien GOSSELET,
Fabien, je tiens à t’exprimer toute ma reconnaissance pour le long suivi de ces
trois années de thèse. Au cours de ces années, ta grande disponibilité, ton
enthousiasme, tes conseils et surtout ta patience m’ont permis d’avancer et de
progresser. Puisses-tu trouver dans ce travail le témoignage de mon attachement, de
mon profond respect et de ma reconnaissance pour tes conseils avisés et ton
soutien précieux. Merci et encore merci !

- 3 -
Alejandra, Barbara, Mélanie, Julien, Johan,
Merci pour votre soutien, votre aide, votre gentillesse, vos blagues ! Sans
vous cette expérience n’aurait pas été la même… Les événements, les fêtes et la
bière que nous avons partagés ont fait qu’à présent vous êtes pour moi bien plus que
des collègues…

Anne-Marie et Marie Christine,
Merci pour votre précieux soutien technique, pratique et moral. Ces années
passées à vos côtés ont été un grand plaisir ...

Ces travaux n'auraient pas été possibles sans les membres du LBHE et de
Cellial Technologies. Je vous suis très reconnaissante pour votre aide, vos conseils
et vos encouragements. Trouvez ici l'expression de ma gratitude et de ma sincère
amitié.

Je tiens aussi à remercier tous les anciens membres du laboratoire pour les
bons moments passés ensemble.

Il ringraziamento più grande va ai miei genitori senza i quali certamente non
sarei la persona che sono. Un infinito grazie per esserci sempre, per sostenermi, per
avermi insegnato ciò che è “giusto” e ciò che è “ingiusto”. Grazie per i vostri consigli,
per le vostre critiche che mi hanno fatta crescere. Grazie per il vostro amore.

Je tiens à remercier ma belle famille qui a toujours été présente lorsque j’en
ai eu besoin. Merci pour vos encouragements, votre soutien et votre amour durant
tout ce temps. Vous êtes beaucoup plus qu’une belle famille !

Desidero ringraziare i miei fratelli, Salvo, Silvia e Marialuisa che in questi
anni anche se da “lontano", mi hanno sostenuto e mi hanno amato.
- 4 -
Ma il ringraziamento più grande va alla mia nonna per tutte le preghiere che
ha fatto per me in tutti questi anni et all’amore che mi ha dato. Ti voglio bene oggi e
sempre !







- 5 -

SOMMAIRE

Page
RESUME ...................................................................................................................... 1
ABSTRACT ................................................................................................................. 2
ABREVIATIONS .......................................................................................................... 3

INTRODUCTION ....................................................................................... 4

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................ 11

Chapitre I La Barrière Hémato-Encéphalique .................................. 12
I.1 Les capillaires cérébraux, support anatomique de la BHE ...................... 14
I.2 La BHE : une barrière physique .................................................................. 16
I.2.1 Le complexe jonctionnel intercellulaire .................................................. 17
I.2.1.1 Les jonctions serrées ................................................................. 18
I.2.1.2 Les jonctions adhérentes ........................................................... 21
I.2.2 Les vésicules et les canaux trans-endothéliaux .................................... 21
I.3 La BHE : une barrière métabolique ............................................................. 22
I.3.1 Les enzymes .......................................................................................... 22
I.3.2 Les pompes d’efflux ............................................................................... 23
I.3.2.1 La P-glycoprotéine (P-gp) .......................................................... 24
I.3.2.2 La Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) .......................... 28
I.3.2.3 Les Multidrug Resistance Associated Proteins (MRP) .............. 30
I.4 Induction des propriétés de la BHE ............................................................ 33
I.4.1 Les astrocytes ........................................................................................ 33
I.4.2 Les péricytes .......................................................................................... 34
I.4.3 La membrane basale ............................................................................. 35
I.4.4 Les neurones ......................................................................................... 36
- 6 -
I.5 Mécanismes de transport au niveau de la BHE ......................................... 37
I.5.1 La diffusion passive ............................................................................... 38
I.5.2 La diffusion facilitée ............................................................................... 38
I.5.3 La transcytose ....................................................................................... 40
I.5.4 Les structures impliquées dans les transports spécialisés .................... 44
I.5.4.1 Les puits recouverts de clathrine ............................................... 44
I.5.4.2 Les cavéoles .............................................................................. 45

Chapitre II Maladie D’Alzheimer et Barrière Hémato-Encéphalique 48
II.1 La Maladie D’Alzheimer .............................................................................. 49
II.1.1 Définition et épidémiologie .................................................................... 49
II.1.2 Caractéristiques neuropathologiques ................................................... 50
II.1.2.1 L’atrophie corticale ................................................................... 51
II.1.2.2 Les dégénérescences neurofibrillaires ..................................... 51
II.1.2.3 Les dépôts amyloïdes ............................................................... 53
II.1.2.3.1 Les plaques séniles .................................................... 53
II.1.2.3.2 L’angiopathie amyloïde cérébrale ............................... 54
II.1.3 Rapport chronologique entre les lésions amyloïdes et les
dégénérescences neurofibrillaires .......................................................................... 55
II.2 Le précurseur du peptide amyloïde : l’APP .............................................. 57
II.2.1 Structure de l’APP ................................................................................ 57
II.2.2 Métabolisme de l’APP ........................................................................... 58
II.2.2.1 La voie non-amyloïdogénique .................................................. 58
II.2.2.2 La voie amyloïdogénique .......................................................... 60
II.2.3 La cascade amyloïde ............................................................................ 61
II.2.4 La théorie vasculaire ............................................................................. 64
II.3 Altération de la perméabilité de la BHE dans la Maladie d’Alzheimer ... 66
II.4 Dégradation des peptides amyloïdes par les cellules endothéliales : les
différentes enzymes impliquées ......................................................................... 67
II.5 Transport des peptides amyloïdes à travers la BHE ............................... 69
II.5.1 Receptor for Advanced Glycation End products (RAGE) ..................... 70
- 7 -
II.4.2 P-glycoprotéine (P-gp) et Breast Cancer Resistence Proteins (BCRP) 72
II.4.3 Low density lipoprotein receptor-related proteins 1 (LRP1) ................. 74
II.4.4 RAGE et LRP1 : Cibles thérapeutiques ................................................ 78
II.6 Clairance des peptides Aβ mediée par immunothérapie ........................ 79
II.6.1 Immunisation active .............................................................................. 79
II.6.2 Immunisation passive ........................................................................... 80

CONCLUSION DE L’ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ............................... 83

TRAVAUX PERSONNELS ..................................................................... 85

I Voie physiologique du transport des LDL à travers la BHE: Transcytose à
travers les cellules endothéliales de capillaires cérébraux in vitro ......................... 88
II Le transport des peptides amyloïdes (Aβ) vers le cerveau à travers les cellules
endothéliales (CECs) de la BHE est médié par le récepteur RAGE et limité par la
P-gp ...................................................................................................................... 105
III Etudes préliminaires : transport des peptides amyloïdes (Aβ) du cerveau vers
le sang à travers la BHE ....................................................................................... 123

DISCUSSION ET CONCLUSION GENERALE .................................... 129
I Caractérisation des structures intracellulaires impliquées dans la transcytose
.............................................................................................................................. 131
II Mise en évidence de l’implication du récepteur RAGE et des pompes d’efflux
P-gp et BCRP dans l’influx des peptides Aβ. ....................................................... 136
III Etudes préliminaires : transport des peptides amyloïdes (Aβ) du cerveau vers
le sang à travers la BHE ....................................................................................... 141

PERSPECTIVES ................................................................................................. 144

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ......................................................... 149
- 8 -

FIGURES

Pages
Figure 1 : Organisation de l’unité neurovasculaire ..................................................... 14
Figure 2 : Comparaison des capillaires cérébraux et périphériques .......................... 15
Figure 3 : Modèle d’interactions entre les principales protéines des jonctions serrées
................................................................................................................................ 17
Figure 4 : Structure de la P-gp humaine dans la membrane plasmique .................... 24
Figure 5 : Structure de la BCRP ................................................................................. 29
Figure 6 : Modèle topologiques membranaires des protéines de la famille MRPs
humain .................................................................................................................... 31
Figure 7 : Schéma représentant les différents processus de transport intervenant
dans la perméabilité d’un capillaire cérébral .......................................................... 37
Figure 8 : Hypothèses de transport du fer au niveau de la BHE ................................ 41
Figure 9 : Modèle d'assemblage de vésicules recouvertes de clathrine au niveau de
la membrane cellulaire lors d’une endocytose dépendante d’un récepteur. .......... 44
Figure 10 : Organisation des lipides rafts et des cavéoles ........................................ 46
Figure 11 : Lésions neuropathologiques de la MA ..................................................... 50
Figure 12 : Atrophie corticale d’un sujet sain en comparaison avec un sujet atteint de
la maladie d’Alzheimer ........................................................................................... 51
Figure 13 : Dégénérescence neurofibrillaire mise en évidence par la technique
d’imprégnation argentique de Bielschowsky .......................................................... 52
Figure 14 : Les plaques seniles ................................................................................. 53
Figure 15 : Angiopathie amyloïde cérébrale dans la MA ........................................... 54
Figure 16 : La voie non-amyloïdogénique .................................................................. 59
Figure 17 : La voie amyloïdogénique ......................................................................... 60
Figure 18 : Hypothèse de la cascade amyloïde ......................................................... 62
Figure 19 : Représentation schématique de deux principaux isoformes du récepteur
RAGE ..................................................................................................................... 71
Figure 20 : Réponse cellulaire après activation du récepteur RAGE par le peptide Aβ
................................................................................................................................ 72
Figure 21 : Représentation schématique du récepteur LRP1 .................................... 75
- 9 -
Figure 22 : Mécanismes d’action des anticorps monoclonaux m266 et m3D6 .......... 81
Figure 23 : Modèle in vitro de Barrière Hémato Encéphalique .................................. 87
Figure 24 : Mise en évidence d’un transport asymétrique dans les cellules
endothéliales des capillaires cérébraux ............................................................... 125
Figure 25 : Expression transcriptionelle du récepteur LRP1 .................................... 126
Figure 26 : Inhibition du récepteur LRP1 par RAP ................................................... 127




TABLEAUX


Pages
Tableau 1 : Exemples de substances transportées par la P-glycoprotéine ............... 26
Tableau 2 : Modulateurs de la P-glycoprotéine ......................................................... 27



DOCUMENTS


Pages
Article 1 : Apical-to- basolateral transport of amyloid β peptides through blood-brain
barrier cells is mediated by the receptor for advanced glycation end-products and
restricted by P-glycoprotein .................................................................................... 92

Article 2 : Density Lipoproteins across the blood brain barrier : transcytosis through
brain capillary endothelial cells in vitro ................................................................. 127
- 10 -