Two-phase electrophoresis of biomolecules [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Götz Münchow
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Publié le 01 janvier 2009
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Langue English
Poids de l'ouvrage 11 Mo

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Two-Phase Electrophoresis of Biomolecules






Vom Fachbereich Maschinenbau
an der Technischen Universität Darmstadt
zur
Erlangung des Grades eines Doktor-Ingenieurs (Dr.-Ing.)
genehmigte


Dissertation


vorgelegt von

Dipl.-Ing. Götz Münchow

aus Reinbek











Berichterstatter: Prof. Dr. Steffen Hardt (Technische Universität Darmstadt)
Mitberichterstatter: Prof. Dr. Jörg Peter Kutter (Technical University of Denmark)
Tag der Einreichung: 29. Mai 2009
Tag der mündlichen Prüfung: 17. Juli 2009



Darmstadt 2009
D17



TWO-PHASE
ELECTROPHORESIS
OF
BIOMOLECULES



Cells moving around
a gas bubble.





von
Götz Münchow











För miene Familje.

Abstract
Existing microfluidic separation technologies for biomolecules commonly rely on single
phase liquid systems as well as on electrophoresis. But microfluidics also facilitates the
generation of stable, well-controlled and immiscible liquid-liquid two-phase arrangements,
since interfacial forces usually dominate over volume forces. The present work combines
these approaches and reports on protein and cell transport as well as on enrichment and
separation phenomena discovered in various experiments with a novel microfluidic setup for
continuous-flow two-phase electrophoresis. Therefore, phase boundaries of aqueous two-
phase systems are formed within a microchannel in flow direction and the characteristic
partition behavior of proteins and cells is manipulated and tuned by applying an electric field
perpendicular to the phase boundary.
The two immiscible phases which separately are injected into a microchannel are taken from
aqueous polyethylene glycol (PEG) - dextran systems. Different ways are possible to induce
an electric field within a microchannel, but it was found out that electrodes have to be
decoupled from the two-phase flow and especially hydrogels can be utilized as adequate ion
conductors. Thus bubble generation inside the microchannel is prevented and a stable two-
phase flow is guaranteed.
In contrast to macroscopic systems, microfluidic setups allow detailed investigations of local
effects at the phase boundary. The results of the experiments show that the diffusive as well as
the electrophoretic transport behavior of proteins between the laminated liquid phases is
strongly influenced by their partition coefficients. Furthermore, effects of the phase boundary
itself, like electric double layers, are negligible in this case. This derived knowledge helps to
design specific two-phase partition and enrichment procedures combined with electric fields
for future studies.
Besides a detailed examination of the transport behavior of proteins a continuous separation
of proteins from cells is presented. While proteins in presence of an external electric field pass
the boundary and leave the phase they have been initially dissolved in almost completely,
lymphoblastoid cells can be retained, thus allowing a stable and continuous separation of
these two kinds of biomolecules.
And finally, further kinds of fluid combinations such as water and propylene carbonate are
presented, supporting an enrichment of proteins at the phase boundary.


II
Zusammenfassung
Bestehende mikrofluidische Techniken zur Separation von Biomolekülen basieren
üblicherweise auf einphasigen Flüssigkeitssystemen sowie auf Elektrophorese. Da die
Grenzflächenkräfte in der Regel die Volumenkräfte dominieren, ermöglichen die
Gesetzmäßigkeiten der Mikrofluidik aber auch die Erzeugung von stabilen, gut
kontrollierbaren Anordnungen von nicht mischbaren flüssig-flüssig Zweiphasensystemen. Die
vorliegende Arbeit kombiniert die oben genannten Ansätze und beschreibt den Transport von
Proteinen und Zellen sowie Anreicherungs- und Separationsphänomene, die während
unterschiedlichster Experimente in einem neuartigen, mikrofluidischen Aufbau für
kontinuierliche Zweiphasenelektrophorese ermittelt worden sind. Dafür werden Grenzflächen
wässriger Zweiphasensysteme innerhalb eines Mikrokanals in Flussrichtung erzeugt und das
charakteristische Partitionierungsverhalten von Proteinen und Zellen durch ein zusätzliches
elektrisches Feld senkrecht zur Phasengrenze manipuliert bzw. neu eingestellt.
Die zwei nicht mischbaren Flüssigkeitsphasen, jede für sich in den Mikrokanal injiziert,
werden wässrigen Zweiphasensystemen entnommen, die aus Polyethylenglykol (PEG) und
Dextran bestehen. Es bestehen unterschiedliche Möglichkeiten, ein elektrisches Feld im
Mikrokanal zu erzeugen. Es wurde aber ermittelt, dass die Elektroden von dem
Zweiphasensystem entkoppelt werden müssen und besonders Hydrogel als adäquater
Ionenleiter verwendet werden kann. Dadurch ist es möglich, die Bildung von Gasblasen
innerhalb des Mikrokanals zu unterbinden und einen stabilen Zweiphasenfluss zu garantieren.
Im Gegensatz zu makroskopischen Systemen, erlauben mikroskopische Systeme eine
detaillierte Untersuchung von lokalen Effekten direkt an der Phasengrenze. Dabei zeigen die
Ergebnisse der Experimente, dass das diffusive als auch das elektrophoretische
Transportverhalten von Proteinen zwischen den Flüssigkeitslamellen maßgeblich durch deren
Partitionierungskoeffizienten beeinflusst wird. Außerdem sind Effekte, die durch die
eigentliche Phasengrenze verursacht werden, wie z.B. durch eine elektrische Doppelschicht,
in diesem Fall vernachlässigbar. Das durch die vorliegende Arbeit erlangte Wissen hilft dabei,
für unterschiedliche Zielstellungen bestimmte Partitionierungs- und Anreicherungsprozeduren
innerhalb von mit elektrischen Feldern gekoppelten Zweiphasensystemen zu designen.
Neben der detaillierten Untersuchung der Transporteigenschaften der Proteine wird außerdem
eine kontinuierliche Separation von Proteinen und Zellen beschrieben. In diesem Fall
passieren die Proteine bei Vorhandensein eines elektrischen Feldes die Phasengrenze und
verlassen vollständig die Phase, in der sie ursprünglich gelöst waren. Im Gegensatz dazu
werden lymphoblastoide Zellen an der Phasengrenze zurückgehalten, was eine stabile und
kontinuierliche Separation dieser beiden Biomoleküle ermöglicht.
Schließlich werden noch weitere Fluidkombinationen, wie z.B. Wasser - Propylencarbonat,
vorgestellt, die ebenso eine Anreicherung von Proteinen an der Phasengrenze ermöglichen.
III Content

1 Introduction 1
1.1 Microfluidic Technologies 1
1.2 Downscaling Effects 2
1.3 Microfluidic Devices for Chemical Analysis and Separation 4
1.4 Aim and Structure of the Thesis 6
2 Biological Samples 9
2.1 Proteins 9
2.1.1 Protein Separation Methods 11
2.1.2 Protein Enrichment 12
2.1.3 Protein Labeling 12
2.2 Cells 13
2.2.1 Cell Separation Methods 14
2.2.2 Cell Labeling 14
3 Aqueous Two-Phase Systems 17
3.1 Fundamentals 17
3.2 Phase Separation and Diagrams 17
3.3 Preparation of Aqueous Tow-Phase Systems 19
3.4 Ion Distribution and Conductivity 21
3.5 Separation of Biomolecules 21
3.5.1 Hydrophobic Affinity Partitioning 22
4 Electrophoresis 25
4.1 Fundamentals 25
4.2 Proteins 27
4.3 Cells
5 Hydrodynamic Flow in Microchannels 29
5.1 Governing Equations 29
5.2 Non-dimensional Numbers 29
5.3 Two-Phase Flow 30
5.3.1 Liquid-Liquid Flow 30
6 Experimental Setup and Methods 35
6.1 Measurement Setup 35
6.2 Fluidic Setup 36
6.3 Fluidic Connections 37
6.4 Fluorescence Detection 39
6.5 Electric Connections and Electrodes 41
V
7 Fabrication of Microfluidic Chips 43
7.1 Construction and Manufacturing 43
7.2 Electrodes 45
7.2.1 Integrated Electrodes 45
7.2.2 Decoupled Electrodes 49
7.3 Sealing of Channel Network 57
8 Aqueous Two-Phase Flow 59
8.1 Flow Patterns and Flow Stability 59
8.2 Viscosity Adjustment 64
8.3 Phase Separation 66
9 Transport of Biomolecules in Microchannels 69
9.1 Diffusive Transport 69
9.2 Active Transport by Integrated Electrodes 69
9.2.1 Influence of Voltage Shape 73
9.3 Active Transport by Decoupled Electrodes 74
9.3.1 Dialysis Membranes 74
9.3.2 Hydrogels 76
9.3.3 Interface Instabilities 77
9.3.4 Buffer Reservoir 78
10 Diffusive Protein Transport 81
10.1 Introduction 81
10.2 Adapted Microfluidic Setup 82
10.3 Single Phase Diffusion 83
10.4 Diffusion across Phase Boundary 84
10.5 Theoretical Background 84
10.6 Results 86
10.6.1 Diffusion in Single Phase Systems 86
10.6.2 Protein Diffusion Across the Interface 88
10.7 Conclusion 91
11 Active Transport and Enrichment of Proteins 93
11.1 Introduction 93
11.2 Standard Aqueous Two-Phase System 93
11.3 Modified Aqueous Tw99
11.3.1 Effect of PEG-Palmitate 99
11.3.

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