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Publié par | Salamanca |
Publié le | 04 novembre 2008 |
Nombre de lectures | 30 |
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En savoir + Paternité, pas d'utilisation commerciale, partage des conditions initiales à l'identique
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Langue | Español |
Poids de l'ouvrage | 27 Mo |
Extrait
TESIS DOCTORAL
Análisis de la función de
EWS-FLI1 en la patogenia del
Sarcoma de Ewing
David Herrero Martín
Salamanca 2008
D. ENRIQUE DE ÁLAVA CASADO, Doctor en Medicina y Cirugía e Investigador
Científico del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) en el Instituto de
Biología Molecular y Celular del Cáncer (IBMCC, CSIC-USAL) de Salamanca,
CERTIFICA:
Que el trabajo realizado bajo mi dirección por el licenciado en Biología D. DAVID
HERRERO MARTÍN titulado “Análisis de la función de EWS-FLI1 en la patogenia del
Sarcoma de Ewing”, reúne a mi juicio las condiciones de originalidad y contenido requeridas
para que sea presentado ante el tribunal correspondiente y optar al grado de doctor por la
Universidad de Salamanca.
Y para que conste a los efectos oportunos, expido y firmo el presente certificado en
Salamanca, a 4 de Noviembre de 2008.
Firmado Dr. Enrique de Álava Casado
V° B°: Dr. Rogelio González Sarmiento
Catedrático Departamento de Medicina
Tutor del presente trabajo de doctorado.
Este proyecto de tesis ha sido financiado por:
Programa de Formación de Personal Investigador de la Consejería de Educación de la Junta
de Castilla y León (2003-2007)
Fondo de Investigación Sanitaria, mediante los proyectos “Valor patogenético de la expresión
de c-kit en el Tumor de Ewing. Una posible diana terapéutica” (PI020828) y “Patología
Molecular de los sarcomas, con énfasis en el Tumor de Ewing: diseño y validación de nuevas
herramientas diagnósticas y de individualización terapéutica” (PI052524).
La Red de Excelencia de la Comunidad Europea EUROBONET, con el Proyecto Europeo
“Molecular Pathology of Bone Tumors” (FP6-2004-Lifescihealth-5, 018814).
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN 1
1. Sarcomas 2
2. Tumores de la familia del Sarcoma de Ewing 8
3. ARN de interferencia 21
4. EWS 31
5. FLI-1 33
6. Fusiones génicas 36
7. EWS-FLI1 45
8. Contexto celular y origen del Sarcoma de Ewing 55
OBJETIVOS 69
MATERIAL Y MÉTODOS 71
1. Líneas celulares 72
2. Cultivos celulares 76
3. ARN de interferencia 81
4. Métodos de transfección 91
5. Técnicas de detección de proteínas 99
6. Técnicas de detección de ácidos nucleicos 122
7. Hibridación genómica comparada (CGH array) 131
8. Técnicas de análisis de la expresión génica 148
9. Técnicas de interacción ADN-proteínas 154
10. Técnicas de citometría de flujo 157
11. Técnicas in vitro 160
12. Técnicas de inmunohistoquímica 165
13. Modelo animal para el estudio in vivo 170
14. Técnicas de trabajo con células madre mesenquimales 171
humanas adultas
15. Tratamiento estadístico 181
RESULTADOS 182
1. Generación de un sistema estable de interferencia de la fusión 183
EWS-FLI1 del SE
2. Efectos de la inhibición de EWS-FLI1 en la línea de SE, TC71. 190
Caracterización del modelo shARNi.
3. de EWS-FLI1 en otros clones shARNi 198
de TC71. Especificidad de la interferencia.
4. Estudio de los efectos de la interferencia de la fusión EWS-FLI1 202
tipo 3 (10-6) en la línea celular de SE, A4573.
5. Análisis del estatus genómico del clon shARNi 205
6. Estudio de la vía de IGF1/IGF1R 207
7. Análisis de la capacidad de diferenciación del clon shARNi 211
8. Análisis de la expresión génica del clon shARNi 213
9. Validación del análisis de la expresión génica del clon shARNi 220
10. TOPK es una nueva diana directa de EWS-FLI1 implicada en 225
proliferación
11. Estatus de genes sensores y reparadores de daño en el ADN al 235
inhibir TOPK y en el clon shARNi
12. Estudio proteómico del clon shARNi 237
13. La inhibición de EWS-FLI1 frena el desarrollo tumoral en un 245
modelo murino de xenotransplante
14. Génesis del SE. Inducción de la fusión EWS-FLI1 en hMSCs 250
DISCUSIÓN 260
1. Impacto de las fusiones EWS-ets en la biología del Sarcoma de Ewing 261
2. La reducción de forma estable de los niveles de EWS-FLI1 provoca un 264
incremento en la fracción apoptótica, una reducción de la capacidad
migratoria y de transformación oncogénica
3. Análisis de la expresión génica del clon shARNi 267
4. La interferencia de EWS-FLI1 reprime los niveles de IGF1 y 269
sensibiliza a la acción de inhibidores de la vía de transducción de
señales de IGF1-IGF1R
5. Análisis proteómico del clon shARNi 271
6. La inhibición de EWS-FLI1 frena el desarrollo tumoral en un 274
modelo murino de xenotransplante
7. TOPK es una nueva diana directa de EWS-FLI1 involucrada en 276
proliferación y motilidad
8. LRRC48, una diana directa de TOPK 280
9. Otras dianas putativas de EWS-FLI1 282
10. Origen del SE. Células madre mesenquimales 284
CONCLUSIONES 290
BIBLIOGRAFÍA 292
Abreviaturas 347