Caracterización funcional de la molécula proapoptótica Bak en el retículo endoplasmático

Klee, Martina

Description

Colecciones : CIC. Tesis del Centro de Investigación del Cáncer
Fecha de publicación : 2008
Bak y Bax son miembros proapoptóticos de la familia Bcl-2 que presentan una alta redundancia funcional. Ambos homólogos constituyen un punto de control crítico en la vía mitocondrial de apoptosis y están localizados tanto en la mitocondria como en el retículo endoplasmático (RE). Mientras que ya se ha establecido que Bak y Bax mitocondriales son suficientes para la inducción de apoptosis por proteínas BH3-only, todavía se desconoce en gran medida el papel de los homólogos reticulares, aunque parecen controlar la apoptosis a través de la regulación de los niveles de calcio.Mediante diferentes ensayos de sobreexpresión hemos determinado dos nuevas actividades de Bak reticular. Por un lado, Bak tiene la capacidad de modular la estructura del RE. La coexpresión de Bak con Bclxl provoca la vacuolización y dilatación acusada de las cisternas reticulares. Un mutante de Bak carente del dominio BH3 es suficiente para inducir este fenotipo, y una versión reticular de Bak?BH3 retiene esta actividad. La expresión de activadores como Bim o tBid en condiciones similares recapitula la dilatación reticular y la vacuolización cuando los receptores de calcio de tipo rianodina están inhibidos. Experimentos con células fibroblásticas embrionarias murinas (MEF) deficientes en Bak y Bax muestran que Bak endógeno media este efecto, mientras que Bax es mayoritariamente irrelevante. Estos resultados, por tanto, constituyen un ejemplo de divergencia funcional entre los dos homólogos multidominio. Por otro lado, hemos demostrado que células MEF que expresan exclusivamente Bak reticular en ausencia de Bax endógeno movilizan citocromo c e inducen apoptosis en respuesta a los efectores BimEL y Puma. De forma sorprendente, calcio es necesario pero no suficiente para mediar la vía de señalización, a pesar de niveles normales de calcio reticular. Nuestros resultados indican que el calcio funciona en coordinación con la maquinaria celular a situaciones del estrés reticular IRE1?/TRAF2 para transmitir señales apoptóticas desde el RE a la mitocondria. Estos datos revelan que moléculas BH3-only requieren Bak reticular para activar una vía de señalización RE-mitocondria capaz de inducir la movilización del citocromo c y apoptosis de forma independiente de la maquinaría mitocondrial canónica dependiente de Bak y Bax en este orgánulo, lo que añade un nuevo nivel de complejidad a la regulación apoptótica.Bak and Bax are functionally-overlapping, proapoptotic Bcl-2 family members that constitute a mitochondrial gateway for multiple death pathways and are naturally localized both to the mitocondria and to the endoplasmic reticulum (ER). While it is generally accepted that mitochondrial Bak or Bax suffice for apoptosis initiated by BH3-only homologues, their functions at the ER are widely unknown, although they seem to control apoptosis through the regulation of calcium levels.By using different overexpression approaches we were able to reveal two new activities of reticular Bak. On one hand, Bak has the capacity of modulating the structure of the ER. Coexpression of Bak and Bclxl provokes extensive swelling and vacuolization of reticular cisternae. A Bak version lacking the BH3 domain suffices to induce this phenotype, and reticular targeting of this mutant retains the activity. Expression of upstream BH3-only activators Bim or tBid in similar conditions recapitulates ER swelling and vacuolization if ryanodine receptor calcium channel activity is inhibited. Experiments with Bak and Bax-deficient mouse embryonic fibroblasts (MEFs) show that endogenous Bak mediates the effect, whereas Bax is mainly irrelevant. These results constitute one example of functional divergence between the two multidomain homologues. On the other hand, we showed that MEFs exclusively expressing endoplasmic Bak in the absence of endogenous Bax undergo cytochrome c mobilization and apoptosis in response to the BH3-only effectors BimEL and Puma. Surprisingly, calcium was necessary but insufficient to drive the pathway, despite normal ER calcium levels. We provide evidence that calcium functions coordinately with the ER-stress surveillance machinery IRE1?/TRAF2 to transmit apoptotic signals from the reticulum to mitochondria. These results indicate that BH3-only mediators rely on reticular Bak to activate an ER-to-mitochondria signaling route able to induce cytochrome c release and apoptosis independently of the canonical Bak,Bax-dependent mitochondrial gateway, thus revealing a new layer of complexity in apoptotic regulation.

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Extrait

TESIS DOCTORAL



Caracterización funcional de la molécula
proapoptótica Bak en el retículo
endoplasmático



Martina Klee


Centro de Investigación del Cáncer
Universidad de Salamanca - CSIC

2008

INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1
1. LA APOPTOSIS ..........................................................................................................................................................2
2. LA MAQUINARIA DE APOPTOSIS............................................................................................................................3
2.1. “RECEPTORES DE MUERTE” Y SUS LIGANDOS3
2.2. PROTEÍNAS ADAPTADORAS ............................................................................................................................3
2.3. LAS CASPASAS..............................................................................................................................................4
2.3.1. Caracterización y estructura...................................................................................................4
2.3.2. Clasificación de las caspasas..............5
2.3.3. Activación de caspasas .........................................................................................................................6
2.3.4. Sustratos de caspasas ..........................................................................................................6
2.3.5. Inhibidores de caspasas........................................................................................................................7
2.4. APAF-1 Y EL APOPTOSOMA7
2.4.1. Apaf-1 ....................................................................................................................................................7
2.4.2. La formación del apoptosoma y la activación de caspasa 9 .................................................................7
2.5. LA FAMILIA BCL-2..........................................................................................................................................8
2.5.1. Clasificación ..........................................................................................................................................8
2.5.2. Modelos de interacción entre miembros de la familia Bcl-2 ................................................................13
2.6. FACTORES APOPTOGÉNICOS........................................................................................................................16
2.6.1. Citocromo c y Smac/DIABLO ..............................................................................................................16
2.6.2. Mecanismo de liberación de factores apoptogénicos de la mitocondria .............................................17
3. TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES EN APOPTOSIS ...........................................................................................17
3.1. VÍAS EXTRÍNSECAS......................................................................................................................................18
3.2. VÍA INTRÍNSECA O VÍA MITOCONDRIAL ...........................................................................................................18
3.3. DIÁLOGO CRUZADO ENTRE VÍAS EXTRÍNSECAS Y VÍAS INTRÍNSECAS ................................................................18
4. EL PAPEL DEL CALCIO EN APOPTOSIS........................................................................................................19
4.1. EL RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO...................................................................................................................19
4.2. LA HOMEOSTASIS DEL CALCIO ......................................................................................................................20
4.3. CALCIO Y APOPTOSIS....21
5. LA FAMILIA BCL-2 Y LA REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS DESDE EL RE ...............................................22
5.1. LA REGULACIÓN DE LA HOMEOSTASIS DEL CALCIO POR LA FAMILIA BCL-2........................................................22
5.2. EL PAPEL DE LA FAMILIA BCL-2 EN APOPTOSIS MEDIADA POR SEÑALES DE CALCIO ...........................................23
6. LA FAMILIA BCL-2 Y LA REGULACIÓN DE SEÑALES DE ESTRÉS DEL RE26
6.1. ESTRÉS DEL RE..........................................................................................................................................26
6.2. LA RESPUESTA A PROTEÍNAS DESPLEGADAS (UPR).......................................................................................26
6.2.1. Cascada de señalización de IRE1.......................................................................................................27
6.2.2. alización de PERK.....27
6.2.3. alización de ATF6......27
6.2.4. Degradación asociada al RE ...............................................................................................................27
6.3. LA IMPLICACIÓN DE LA FAMILIA BCL-2 EN LA UPR..........................................................................................28
6.4. LA APOPTOSIS INDUCIDA POR ESTRÉS DEL RE ..............................................................................................29
6.4.1. Vías mediadas por componentes de la UPR ............................................................................................29
6.4.1.1. La vía de IRE1/TRAF2/ASK/JNK.................30
6.4.1.2. CHOP/GADD153....................................................................................................................................30
6.4.1.3. GADD34 .................................................................................................................................................31
6.4.1.4. TRB3 ......................................................................................................................................................31
6.4.2. Vías mediadas por la familia Bcl-2 ............................................................................................................31
6.4.3. Otros..........................................................................................................................................................32
6.4.4. Activación de caspasas durante la apoptosis inducida por estrés del RE ................................................32
6.4.4.1. La caspasa 12 ........................................................................................................................................33
6.4.4.2. La caspasa 8................................33
6.4.4.3. La caspasa 233
6.4.4.4. La procaspasa 8L y Bap31.....................................................................................................................34
2

OBJETIVOS............................................................................................................. 36

RESULTADOS ........................................................................................................ 38
1. IDENTIFICACIÓN Y ESTUDIO DE UNA NUEVA ACTIVIDAD DE BAK AUSENTE EN EL HOMÓLOGO BAX.....39
1.1. IDENTIFICACIÓN DE UN FENOTIPO DE VACUOLIZACIÓN CELULAR CITO-PLASMÁTICA INDUCIDO POR LA COEXPRESIÓN DE
BAK Y BCL-XL.............................................................................................................................................................39
1.1.1. Experimentos de tiempo-respuesta y cuantificación del porcentaje de células que mostraban el
citoplasma vacuolizado .........................................................................................................41
1.1.2. Determinación del fenotipo de vacuolización en varias líneas celulares.............................................41
1.2. ESTUDIO DE LA RELEVANCIA DE LA MAQUINARIA EJECUTORA DE APOPTOSIS (CASPASAS) Y LA INHIBICIÓN DE MUERTE
CELULAR EN LA GENERACIÓN DEL FENOTIPO .................................................................................................................42
1.2.1. El bloqueo de la apoptosis inducida por Bak mediante inhibidores alternativos a Bcl-XL no es suficiente
para revelar la vacuolización...............................................................................................................................42
1.2.2. El fenotipo de vacuolización causado por Bak y Bcl-XL es independiente de la actividad caspasa .........43
1.3. IDENTIFICACIÓN DE LOS DOMINIOS FUNCIONALES DE BAK IMPLICADOS EN LA GENERACIÓN DE LA VACUOLIZACIÓN.......44
1.3.1. Una versión de Bak carente del dominio BH3 retiene la capacidad de inducir el fenotipo de vacuolización
en ausencia de Bcl-XL..........44
1.3.2. Un mutante de Bak carente de los dominios BH3 y BH1 es incapaz de provocar el fenotipo de
vacuolización.......................................................................................................................................................45
1.4. ESTUDIO DEL ORIGEN SUBCELULAR DE L