Plasticidad del sistema glutamatérgico en la vía olfatoria de roedores sometidos a deprivación sensorial. Estudio del receptor mGluR1a en el bulbo olfatorio

González Barbado, Victoria María

Description

Colecciones : TD. Ciencias biosanitariasDBCP. Tesis del Departamento de Biología Celular y Patología
Fecha de publicación : 2011
[ES] Tesis doctoral sobre la plasticidad del sistema glutamatérgico en la vía olfativa de roedores sometidos a deprivación sensorial.[EN] Doctoral thesis on the plasticity of the glutamatergic system in the olfactory pathway of rodents subjected to sensory deprivation.

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• Sciences et techniques

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Extrait

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y PATOLOGÍA



PLASTICIDAD DEL SISTEMA
GLUTAMATÉRGICO EN LA VÍA OLFATORIA
DE ROEDORES SOMETIDOS A
DEPRIVACIÓN SENSORIAL. ESTUDIO DEL
RECEPTOR mGluR1a EN EL BULBO
OLFATORIO.

-TESIS DOCTORAL-

Mª VICTORIA BARBADO GONZÁLEZ


Salamanca, 2011

PLASTICIDAD DEL SISTEMA
GLUTAMATÉRGICO EN LA VÍA OLFATORIA
DE ROEDORES SOMETIDOS A
DEPRIVACIÓN SENSORIAL. ESTUDIO DEL
RECEPTOR mGluR1a EN EL BULBO
OLFATORIO.

-TESIS DOCTORAL-

Mª VICTORIA BARBADO GONZÁLEZ


Salamanca, Septiembre 2011

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y PATOLOGÍA


PLASTICIDAD DEL SISTEMA
GLUTAMATÉRGICO EN LA VÍA OLFATORIA
DE ROEDORES SOMETIDOS A
DEPRIVACIÓN SENSORIAL. ESTUDIO DEL
RECEPTOR mGluR1a EN EL BULBO
OLFATORIO.


Memoria presentada por Mª Victoria Barbado González para optar al
grado de Doctor por la Universidad de Salamanca
Salamanca, Septiembre 2011

El Director:




Prof. Dr. D. Jesús María García Briñón

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA CELULAR Y PATOLOGÍA






PLASTICIDAD DEL SISTEMA
GLUTAMATÉRGICO EN LA VÍA OLFATORIA
DE ROEDORES SOMETIDOS A
DEPRIVACIÓN SENSORIAL. ESTUDIO DEL
RECEPTOR mGluR1a EN EL BULBO
OLFATORIO.



María Victoria Barbado González




Salamanca, Septiembre 2011

DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
CELULAR Y PATOLOGÍA

Facultad de Medicina. Avda. Alfonso X, el Sabio s/n
37007 - Salamanca
Tel . [phone] Ext. 1854 Fax . [phone]




Jesús María García Briñón, Profesor Titular de Universidad del Departamento de
Biología Celular de la Universidad de Salamanca


HAGO CONSTAR:
Que el trabajo titulado “Plasticidad del sistema glutamatérgico en la vía
olfatoria de roedores sometidos a deprivación sensorial. Estudio del receptor
mGluR1a en el bulbo olfatorio”, ha sido realizado por Dña. María Victoria Barbado
González en el Departamento de Biología Celular y Patología bajo mi dirección y, en mi
opinión, reúne todos los requisitos científicos y formales para ser defendido como
Tesis Doctoral de la Universidad de Salamanca, por lo cual autorizo su presentación.

Para que así conste, lo firmo en Salamanca a 6 de septiembre de 2011.




Fdo.: Jesús María García Briñón

INTRODUCCIÓN pag. 1
LA NEUROTRANSMISIÓN GLUTAMATÉRGICA pag. 6
1. EL GLUTAMATO COMO NEUROTRANSMISOR pag. 6
2. LOS RECEPTORES DE GLUTAMATO pag. 7
3. LOS RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO (mGluRs) pag. 9
4. LOS RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO COMO
RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEÍNAS G pag. 10
5. CLASIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO pag. 13
6. LOS RECEPTORES METABOTRÓPICOS DE GLUTAMATO DEL GRUPO I pag. 17
7. EL RECEPTOR METABOTRÓPICO DE GLUTAMTO TIPO 1 pag. 18
-LA ISOFORMA a DEL RECEPTOR: mGluR1a pag. 20
-DIMERIZACIÓN DEL mGluR1a pag. 21
-EL mGluR1a EN EL ELEMENTO POSTSINÁPTICO DE LA SINAPSIS
GLUTAMATÉRGICA pag. 24
EL SISTEMA OLFATORIO pag. 29
1. ARQUITECTURA DEL BULBO OLFATORIO: DISTRIBUCIÓN
DE CAPAS Y DE TIPOS NEURONALES pag. 31
-CAPA DE FIBRAS DEL NERVIO OLFATORIO (CFNO) pag. 31
-CAPA GLOMERULAR (CGL) pag. 31
-CAPA PLEXIFORME EXTERNA (CPE) pag. 33
-CAPA DE LAS CÉLULAS MITRALES (CCM) pag. 36
-CAPA PLEXIFORME INTERNA (CPI) pag. 37
-CAPA DE LAS CÉLULAS GRANO (CCG) pag. 38
2. ORGANIZACIÓN SINÁPTICA DEL BULBO OLFATORIO pag. 39
2.1. CIRCUITO DE ENTRADA: MAPA TOPOGRÁFICO OLFATORIO pag. 42
2.2. COMPARTIMENTALIZACIÓN DE LOS GLOMÉRULOS pag. 42
2.3. REGULACIÓN RETROINHIBITORIA DEL NERVIO OLFATORIO pag. 43
2.4. MODULACIÓN DE LA SEÑAL AFERENTE OLFATORIA: EL CIRCUITO GLOMERULAR pag. 44
2.5. REGULACIÓN CENTRÍFUGA DEL CIRCUITO GLOMERULAR pag. 47
2.6. MODULACIÓN DE LA SEÑAL EFERENTE OLFATORIA:
EL CIRCUITO INFRAGLOMERULAR pag. 48
2.7. AUTOEXCITACIÓN NO-SINÁPTICA DE CÉLULAS MITRALES pag. 50
2.8. SISTEMA DE ASOCIACIÓN INTRABULBAR pag. 51
2.9. PROYECCIONES A LA CORTEZA OLFATORIA PRIMARIA pag. 52
3. GLUTAMATO EN EL BULBO OLFATORIO pag. 53
4. EL BULBO OLFATORIO COMO REGIÓN EXPERIMENTAL pag. 54

JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS pag. 59

MATERIAL Y MÉTODOS pag. 65
1.– MATERIAL pag. 67
1.1.-ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN pag. 67
2.-MÉTODOS pag. 69
2.1.- PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO pag. 69
2.1.1.- DEPRIVACIÓN OLFATORIA UNILATERAL NEONATAL pag. 69
2.1.2.- MANTENIMIENTO POSTOPERATORIO pag. 70
2.2.- ESTUDIO NEUROHISTOLÓGICO pag. 72
2.2.1.– FIJACIÓN DEL TEJIDO Y SECCIONAMIENTO pag. 72
# PERFUSIÓN pag. 72
# ENCASTRADO/INCLUSIÓN Y OBTENCIÓN DE SECCIONES pag. 74
# TINCIONES pag. 77
Tinción de Nissl sobre secciones de vibratomo pag. 77
Método Inmunohistoquímico pag. 77
Contratinción de azul de toluidina sobre secciones semifinas pag. 81
Contrastado de cortes ultrafinos sobre rejillas pag. 82
Método inmunofluorescente pag. 84
# ANÁLISIS Y DOCUMENTACIÓN pag. 88
Recuento celular y análisis estadístico pag. 88
2.3.–ESTUDIO PROTEÓMICO pag. 90
2.3.1.– OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS pag. 92
# DECAPITACIÓN Y EXTRACCIÓN DE LAS PROTEÍNAS pag. 92
# PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS CELULARES pag. 93
2.3.2.- DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN PROTEÍCA pag. 95
# MÉTODO COLORIMÉTRICO DE BRADFORD pag. 95
2.3.3.- ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA pag. 96
# PREPARACIÓN DE LOS GELES pag. 97
# PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA LA ELECTROFORESIS pag. 98
# ELECTROFORESIS pag. 99
2.3.4.– ELECTROTRANSFERENCIA pag. 99
# VISUALIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS pag. 100
2.3.5.- INMUNODETECCIÓN DE LAS PROTEÍNAS pag. 100
2.3.6.- DENSITOMETRÍA pag. 101

RESULTADOS pag. 103
CONTROL DEL PROCEDIMIENTO DE DEPRIVACIÓN OLFATORIA pag. 106
1.- CARACTERIZACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE LA
EXPRESIÓN DEL mGluR1a EN EL BULBO OLFATORIO pag. 108
ESTUDIO DEL PATRÓN DE EXPRESIÓN DEL mGluR1a.
LOCALIZACIÓN Y DISTRIBUCIÓN pag. 108
Patrón de expresión en la capa glomerular pag. 109
Patrón de expresión en la capa plexiforme externa pag. 114
Patrón de expresión en la capa de las células mitrales pag. 116
Patrón de expresión en las capas inframitrales pag. 119
Características del inmunomarcaje del mGluR1a pag. 120
MODIFICACIONES EN LA EXPRESIÓN DE mGluR1a EN EL
BULBO OLFATORIO EN AUSENCIA DE ESTIMULACIÓN AFERENTE. pag. 122
Efectos de la deprivación en la capa glomerular pag. 123
Efectos de la deprivación en la capa plexiforme externa pag. 128
Efectos de la deprivación en la capa de las células mitrales pag. 131
Efectos de la deprivación en la capa plexiforme interna pag. 131
RESUMEN DEL ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO DE LOS EFECTOS
DE LA DEPRIVACIÓN OLFATORIA SOBRE LA EXPRESIÓN DEL mGluR1a. pag. 133

2.- ESTUDIO DE COLOCALIZACIÓN. CARACTERIZACIÓN
NEUROQUÍMICA DE LAS NEURONAS POSITIVAS A mGluR1a pag. 136
Coexpresión de mGluR1a con VGLUT2.
Caracterización de neuronas glutamatérgicas pag. 136
Coexpresión de mGluR1a con tirosina hidroxilasa, calbindina D-28k
y calretinina. Caracterización de tipos de células periglomerulares. pag. 140
Coexpresión de mGluR1a con neurocalcina y colecistoquinina.
Caracterización de células empenachadas externas, superficiales y medias. pag. 143
RESUMEN DE LA CARACTERIZACIÓN NEUROQUÍMICA
DE LAS NEURONAS POSITIVAS A mGluR1a pag. 146

3.- ANÁLISIS PROTEICO DEL mGluR1a POR ELECTROFORESIS-WESTERN-BLOTTING pag. 147
CONSIDERACIONES TÉCNICAS DEL ANÁLISIS PROTEICO pag. 147
ANÁLISIS PROTEICO EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES pag. 149
ANÁLISIS PROTEICO EN CONDICIONES NATIVAS pag. 151
CONDICIONES DESNATURALIZANTES vs NATIVAS pag. 154

RESUMEN DEL ANÁLISIS PROTEICO DEL mGluR1a pag. 161

DISCUSIÓN pag. 163
DEL ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO pag. 166
POBLACIONES NEURONALES POSITIVAS A mGluR1a pag. 166
mGluR1a en las neuronas de proyecci