Microbiologie alimentaire: Techniques de laboratoire

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1 - La qualité. La qualité au laboratoire. Qualité microbiologique de transformation du lait. Les analyses bactériologiques réalisées dans le cadre des systèmes autocontrôles en agroalimentaire. Sécurité alimentaire et HACCP. 2 - Les microorganismes. Manipulations : Les sondes nucléiques : applications en microbiologie alimentaire, Méthodes de recherche, de dénombrement et d'identification de Campylobacter jejuni. Vidas Campylobacter (CAM). Pseudomonas et bactéries aérobies (Acinetobacter, Alcaligenes, Agrobacterium, Flavobacterium, Janthinobacterium, Xanthomonas). Pseudomonadacées, dénombrement des Pseudomonas dans les viandes et produits à base de viande. Enterobacteriaceae et Vibrionaceae. Escherichia coli O157 H7. Salmonella. Le Salmonella 1,2 test et le mucap test (référence BCL010101). Transia Salmonella spp (références SA 0178, SA 0181, SA 0168 et SA 0176). Les agents de la pourriture molle. Les ferments lactiques et bactéries apparentées. Méthodes d'identification des staphylocoques. Staphylococcus à coagulase positive. Biotypage de Staphylococcus aureus et dosage des entérotoxines staphylococciques. Entérotoxines staphylococciques. Recherche de Listeria monocytogenes dans le lait et les produits laitiers. Listeria. Méthodes d'identification des Listeria. Transia Listeria spp (références LI 0681, LI 0689 et LI 0694). Bactéries corynéformes, Brevibacterium linens. Clostridium et Bacillus. Mycobactéries. Anaérobies (techniques de culture). Bifidobacterium : isolement et identification. Système d'identification Biolog. Les champignons. Nutrition soufrée du Saprolegnia monoica. Recombinaison génétique par fusion et transformation de protoplastes. Atlas des champignons utilisés dans les méthodes d'essais microbiologiques normalisés (NFX41-500). Clé de détermination des groupes et genres des moisissures importantes dans les industries agroalimentaires. Geotrichum candidum. Les levures. Détermination de l'activité antifongique de produits de traitements des bois en phase liquide. Recherche des mycotoxines dans les produits laitiers. Recherche des virus entériques. Conservation des souches. 3 - Quelques problèmes physiologiques. Manipulations : Etude de l'adhésion de microorganismes Ñ surfaces solides par sédimentation. Corrosion des aciers inoxydables par des produits de nettoyage et/ou de désinfection en industrie agroalimentaire. Méthode d'obtention d'un biofilm expérimental sur une surface dite ÒouverteÓ. Quelques notions sur l'hygiène. Contrôle des populations microbiennes. Sensibilité des microorganismes aux antibiotiques. Etude de la croissance bactérienne par bioluminescence : dosage de l'ATP. Microbiologie et impédancemétrie. Utilisation d'une norme Afnor dans le cas de validation d'un produit en hygiène alimentaire. 4 - Microbiologie de l'environnement et des produits alimentaires transformés. Manipulations : Eaux polluées. Equivalent demande chimique en oxygène par chimiluminescence. Les eaux de mer et eaux douces, suivi sanitaire. Le contrôle microbiologique des eaux. Dénombrement des bactéries aquatiques et tests de toxicité. Les fermentations utilisées dans la production d'aliments fermentés. Boissons non alcoolisées. Analyse microbiologique des vins. Maîtrise d'un ensemencement de bactéries lactiques dans le vin. Microbiologie du lait et des produits laitiers. Préparation de yaourt. Préparation des beurres. Analyse de fromages - Isolement et identification de levures. Etude de Penicillium roquefortii. Dosage de l'aspartyl protéinase de Penicillium roquefortii. Analyse des croûtes de fromage. Microbiologie des viandes. Etude du saucisson sec. Analyse physicochimique des viandes fermentées. Analyse de la lipolyse, de la protéolyse et de l'activité acidifiante des microorganismes responsables de la fermentation des produits carnés. Analyse microbiologique des céréales et des légumineuses. Analyse des produits végétaux. Etude des levains de panification. Fabrication de laits fermentés de soja et de produits de type fromage à pâte fraîche et à pâte molle. Fabrication du miso.

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Jean Paul Larpent. coordonnateur
Microbiologie alimentaire
Techniques
de laboratoire
is/inlmm
TEC
DOC Lavoisier MICROBIOLOGIE
ALIMENTAIRE
TECHNIQUES
DE LABORATOIRE
Coordonné
par
Jean-Paul Larpent
1/oi'Oi.viVrl
TEC
LONDRES DOC NEW YORK
PARIS
11, rue Lavoisier
F 75384 Paris cedex 08 Chez le même éditeur
• Mémento technique de microbiologie
e
J.-P. Larpent, M. Larpent-Gourgaud, 3 édition, 1997.
• Microbiologie alimentaire
Collection « Sciences et techniques agroalimentaires »
-Tome 1, « Aspects microbiologiques de la sécurité et de la qualité des aliments »,
eC.-M. Bourgeois, J.-F. Mescle, J. Zucca, coordonnateurs, 2 édition, 1996.
- Tome 2, « Aliments fermentes et fermentations alimentaires »,
e
C.-M. Bourgeois, J.-P. Larpent, coordonnateurs, 2 édition, 1996.
• Les Listeria
J.-P. Larpent, 1995.
• Les probiotiques en alimentation animale et humaine
J.-P. Larpent, N. Château, M.-I. Castellanos, J.-L. Larpent, 1994.
• Microbiologie industrielle
Collection « Sciences et techniques agroalimentaires »,
J.-Y. Leveau, M. Bouix, coordonnateurs, 1993.
• Technique d'analyse et de contrôle dans les industries agroalimentaires
Tome 3, « Le contrôle microbiologique »,
e
C.-M. Bourgeois, J.-Y. Leveau, coordonnateurs, 2 édition, 1991.
DANGER
LE
PHOTOCOPILLAGE
TUE LE LIVRE
© TECHNIQUE & DOCUMENTATION, 1997
ISBN: 2-7430-0155-0
Toute reproduction ou représentation intégrale ou partielle, par quelque procédé que ce soit, des pages publiées
dans le présent ouvrage, laite sans l'autorisation de l'éditeur ou du Centre Français d'Exploitation du droit de copie
(3, rue Hautefeuille - 75006 PARIS), est illicite et constitue une contrefaçon. Seules sont autorisées, d'une part, les
reproductions strictement réservées à l'usage privé du copiste et non destinées à une utilisation collective, et,
d'autre part, les analyses et courtes citations justifiées par le caractère scientifique ou d'information de l'œuvre dans
laquelle elles sont incorporées (Loi du I" juillet 1992-art. L 122-4 et L 122-5 et Code Pénal art. 425). LISTE DES AUTEURS
Avoyne Christèle Bervas Elisabeth
Ingénieur microbiologiste Chercheur, Université Biaise Pascal,
AES Laboratoire Complexe scientifique des Cézeaux
er
Route de Dol - BP 54 Bat. 1 cycle Biologie C
35270 Combourg 63177 Aubière Cedex
Bal-Fontaine Maurice Biokar Diagnostics
Ancien directeur du laboratoire central Z.I. n° 2
Idéval, 12 allée Monge
2, rue du Velay 60000 Beauvais
63800 Cournon
BioMérieux
Bannari Souad 69280 Marcy-l'étoile
Chercheur, laboratoire de
microbiologie. Université Biaise Pascal Boulangé-Petermann Laurence
Complexe scientifique des Cézeaux Ingénieur section corrosion, er
Bat. 1 cycle Biologie C Centre de recherches Ugine Savoie
63177 Aubière Cedex 73403 Ugine Cedex
Barbalat Christian
Bozio Jean-Yves
Directeur du laboratoire municipal
Directeur du laboratoire municipal
Parc Technologique de la Pardieu
60, rue Baujan
10, rue Louis Rosier,
72000 Le Mans
63000 Clermont-Ferrand
Bracq Emmanuelle, Inra Bariller Jérôme
Laboratoire de Recherches fromageres Asept, Ingénieur en microbiologie
36, rue de Salers rue des Docteurs Calmette et Guérin
15000Aurillac BP49
53020 Laval Cedex
Breton André
Professeur, Université Biaise Pascal Bellon-Fontaine Marie-Noëlle
Laboratoire de Microbiologie Chargée de recherche, Inra,
erBat 1 cycle Biologie C Laboratoire de génie de l'hygiène
63177 Aubière Cedex et des procédés alimentaires,
25, avenue de la République
91300 Massy Butin Michel
Pharmacien biologiste - Responsable
de la division microbiologie - AES Bertrand Didier
Laboratoire Docteur Ingénieur
Route de Dol Laboratoire Municipal,
BP54 60, rue Baujan
72000 Le Mans 35270 Combourg IV MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Callon Cécile Delarras Camille
Chercheur, Laboratoire de Maître de conférences, IUT
microbiologie. Université Biaise Pascal département biologie appliquée
Complexe scientifique des Cézeaux 29287 Brest Cedex
er
Bat. 1 cycle Biologie C
Desmasures Nathalie 63177 Aubière Cedex
ATER, Laboratoire de microbiologie
alimentaire, Carpentier Brigitte
Université de Caen
Chargé de Recherches au CNEVA
Esplanade de la Paix Lerpac
14032 Caen Cedex 22, rue Pierre Curie
BP 332 Desmazeaud Michel
94709 Maisons-Alfort Cedex Directeur recherches Inra,
78350 Jouy-en-Josas
Champiat Dominique
Dragacci Sylviane Ingénieur CD Life
Unité toxines microbiologiques BP 2029
69616 Villeurbanne CNEVA
43, rue Dantzig
75013 Paris Chouette Paulette-Jacqueline
Chef de service qualité.
Dromigny Eric
Société des eaux de Volvic
Maître de conférences,
Usine du Chancet
HIDAOA École nationale vétérinaire
63530 Volvic
de Nantes, CP 3013,
44087 Nantes Cedex 03
Coiffier Odile
Maître de conférences, LU .P. Agro­ Durand-Poussereau Michel
alimentaire, Chercheur laboratoire de biologie
Esplanade de la Paix cellulaire fongique
14032 Caen Cedex Université Lyon I, CGMC, bât. 405
43, bd 11 novembre 1918
69622 Villeurbanne Cedex Copin Marie-Pierre
Docteur Ingénieur,
Fèvre Michel Conseiller scientifique produits
Professeur microbiologie Europe 3M,
Université Lyon I, CGMC, bât. 405 3, rue Danton
43, bd 11 novembre 1918 92245 Malakoff Cedex
69622 Villeurbanne Cedex
Cotton-Reymond Pascale Gauthier Sylvie
Maître de conférences laboratoire
Chercheur université Biaise Pascal
de biologie cellulaire fongique,
Complexe scientifique des Cézeaux
Université Lyon I, CGMC, bât. 405 erBat. 1 cycle Biologie C
43, bd 11 novembre 1918
63177 Aubière Cedex
69622 Villeurbanne Cedex
Germonville Alain
Crozier Alain Assistant technique Gist-Brocades,
Docteur en microbiologie. L'Oréal Food Specialities Divisions,
1, avenue Eugène Schueller BP239
59472 Séclin 93600 Aulnay-sous-Bois Liste des auteurs V
Guéguen Micheline Magnol Isabelle
Maître de conférences, Université Remplaçante assistante qualifiée
de Caen Basse-Normandie, de laboratoire,
IBBA, Microbiologie alimentaire, Laboratoire municipal,
Esplanade de la Paix Parc technologique de la Pardieu,
14032 Caen Cedex 10 rue Louis Rosier
63000 Clermont-Ferrand
Guilloux-Benatier Michèle
Maître de conférences Institut Mangin Irène
universitaire de la vigne et du vin Chercheur post-doctoral, Laboratoire
« Jules Guyot », de microbiologie alimentaire,
Laboratoire d'oenologie Université de Caen,
BP138 Esplanade de la Paix
21004 Dijon Cedex 14032 Caen Cedex
Hermant Agnès Manuel Sébastien
Technicienne l'Oréal, Ingénieur microbiologiste AES
1, avenue Eugène Schueller Laboratoire
93600 Aulnay-Sous-Bois Route de Dol
BP54
35270 Combourg Jacquet Marc
Directeur commercial, Gist-Brocades
15, rue des Comtesses Martinet Pascal
BP239 Responsable des laboratoires
59472 Seclin Cedex d'entomologie, de mycologie
et d'écotoxicologie, Société Cecil
Kodjo Angéli Avenue Frédéric Mistral
Maître de conférences Unité de BP16
microbiologie, Immunologie, ENVL, 38670 Chasse-Sur-Rhône
1 avenue Bourgelat
Masson Florence 69280 Marcy-l'Étoile
Chercheur Inra Theix,
Lafarge Véronique 63122 Saint-Genès-Champanelle
Ingénieur IESIEL, CNEVA - Paris
43, rue de Dantzig Michaux Odile
75015 Paris Technicienne de formation et
de recherche, Université Biaise Pascal,
Larpent Jean-Paul Laboratoire de Microbiologie
Complexe scientifique des Cézeaux Professeur, Université Biaise Pascal,
erBat. 1 cycle Biologie C Laboratoire de Microbiologie
63177 Aubière Cedex Complexe scientifique des Cézeaux
er
Bat. 1 cycle Biologie C
63177 Aubière Cedex Montel Marie-Christine
Chargé de recherches Inra Theix
Larpent-Gourgaud Monique 63122 Saint-Genès-Champanelle
Maître de conférences, Uuniversité
Poumeyrol Martine Biaise Pascal
Complexe scientifique des Cézeaux Docteur Vétérinaire, CNEVA - Paris
er
Bat. 1 cycle Biologie C 43, rue de Dantzig
63177 Aubière Cedex 75015 Paris VI MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Reynaud Alain Sorin Marie-Laure
Directeur du laboratoire des services Pharmacien, Responsable
vétérinaires du laboratoire Diffchamb,
BP42-Marmilhat 8. rue Saint-Jean-de-Dicu
69007 Lyon 63370 Lempdes
Tailliez Patrick
Rigard Gisèle
Ingénieur de recherches, Unité
Professeur lycée Sidoine Appolinaire
de recherches laitières Inra,
20, avenue Jean Richepin
78350 Jouy-en-Josas
63000 Clermont-Ferrand
Terrot Claude
Romond Charles Directeur Industrie et environnement
Professeur université Lille II - Faculté BioMéricux
des sciences pharmaceutiques et 69280 Marcy-l'étoile
biologiques
3, rue du Docteur Laguesse Thétas Jean-Louis
59045 Lille Cedex Ingénieur commercial. Société UCB
Pharma
21, rue de Neuilly
Romond Marie-Bénédicte
BP314
Maître de conférences, Université Lille II 92003 Nanterre Cedex
Faculté des sciences pharmaceutiques
et biologiques
Thiaudière Mylène
3, rue du Docteur Laguesse
Ingénieur microbiologiste de Brest
59045 Lille Cedex
Tourdot-Maréchal Raphaëlle
Rossignol Xavier Maître de conférences, Institut
Idéval, Service recherche universitaire de la vigne et du vin
rue Chomaget « Jules Guyot » Laboratoire d'œnologie
BP22 BP 138
43101 Brioude 21004 Dijon Cedex
Vayssier Yves
Schwartzbrod Louis
Professeur, IUT biologie appliquée,
Professeur de virologie
24, rue Docteur Embaquès
Centre collaborateur OMS
32000 Auch
« microorganismes » in Wastewater
Université Henri Poincaré - Nancy I
Veau Patrick
5, rue Albert Lebrun
Docteur es Sciences Texel
BP 403
BP10
54001 Nancy Cedex
86220 Dangé-Saint-Romain
Sesquès Martine Vernozy-Royaud Christine
Docteur es Science, Responsable Maître de conférences,
du laboratoire de microbiologie École nationale vétérinaire de Lyon,
alimentaire LIAL, unité HIDAOA,
38, rue de Salers 1, rue Bourgelat
15000Aurillac 69280 Marcy-FÉtoile AVANT-PROPOS
Certains micro-organismes ont toujours été utilisés par l'homme, qui les a par­
fois domestiqués pour la fabrication d'aliments dits fermentes. D'autres, au
contraire, ont toujours été redoutés et sont les agents de maladies et d'épidémies
diverses, ainsi que les responsables d'altérations importantes des produits ali­
mentaires.
Cet ouvrage tente de combler l'absence d'ouvrages de travaux pratiques desti­
nés :
-aux chercheurs et techniciens chargés, au sein des laboratoires de contrôles
officiels ou des industries privées, de protéger la santé publique ;
-aux chercheurs et techniciens des services publics et privés qui tentent d'ex­
ploiter au mieux les potentialités des micro-organismes en maîtrisant les trans­
formations biochimiques microbiennes des produits ;
-aux enseignants, chercheurs et étudiants des universités scientifiques, des
facultés de médecine et de pharmacie, des écoles d'ingénieurs à vocation bio­
logique, des IUT et des BTS ;
-aux enseignants de l'enseignement secondaire et technique qui assurent une
formation très complète pour les bacheliers des séries professionnelles et tech­
nologiques.
Bien entendu, il était impossible de rassembler dans un volume, aussi impor­
tant soit-il, toutes les techniques utilisées dans le domaine des industries agroali­
mentaires. Néanmoins, après un exposé sur la qualité au laboratoire et dans les
industries, la notion de sécurité alimentaire, avec la méthode HACCP et les sys­
tèmes d'autocontrôlés, les auteurs ont étudié les principales techniques de
recherche, de dénombrement et d'identification des principaux micro-orga­
nismes importants dans les industries agroalimentaires : Campylobacter, Pseu-
domonas et bactéries apparentées, Enterobacteriaceae et Vibrionaceae, les
ferments lactiques et apparentés, Staphylococcus et Listeria, les bactéries cory-
néformes dont Brevibacterium linens, les Clostridium et les Bacillus, les myco-
bactéries, les bactéries anaérobies, Bifidobacterium, les levures et les
champignons. La recherche des mycotoxines et des virus fait l'objet de deux
chapitres importants.
La troisième partie de l'ouvrage est centrée sur quelques problèmes physiolo­
giques influant sur l'hygiène industrielle : problème des biofilms et de la corro­
sion microbienne, contrôle des populations microbiennes, dosage des
antibiotiques et des antiseptiques, suivi du développement microbien par impé-
dancemétrie ou ATPmétrie. VIII MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
La quatrième partie de l'ouvrage donne quelques exemples de produits ali­
mentaires dont l'analyse microbiologique est nécessaire pour assurer leur
inocuité ou leur valeur organoleptique (produits fermentes) : eaux, boissons
alcoolisées ou non, lait et produits laitiers, viandes et produits carnés, produits
végétaux fermentes (algues, pain, soja), conserves, plats cuisinés.
Les annexes donnent des renseignements sur les normes officielles Afnor, Iso,
Fil ... et des informations diverses sur les critères microbiologiques.
La rédaction de ces séances de travaux pratiques ou de « démonstrations » se
veut aussi précise matériellement que possible. L'indication de certains types de
matériels utilisés n'implique pas que d'autres modèles ou marques ne soient pas
satisfaisants, mais nous avons seulement précisé ceux que nous avons employés.
Nous tenons à remercier très sincèrement tous les auteurs qui, pour leur part,
ont pris en charge un ou plusieurs chapitres dont ils étaient spécialistes. Ce livre
n'aurait pas pu voir le jour sans ces multiples coopérations.
Nous remercions tout particulièrement les diverses sociétés qui ont bien voulu
nous autoriser à reproduire les techniques d'utilisation de nombreux appareils.
Leur intérêt pour cet ouvrage a permis d'exposer les techniques les plus
modernes déjà utilisées dans les laboratoires industriels.
Jean-Paul Larpent TABLE DES MATIERES
Première partie
La qualité
Chapitre 1 La qualité au laboratoire 3
M. BALFONTAINE
Qualité microbiologique de transformation du lait 13 Chapitre 2
X. ROSSIGNOL
Chapitre 3 Les analyses bactériologiques réalisées
E. DROMIGNY dans le cadre des systèmes autocontrôles
en agroalimentaire 25
Chapitre 4 Sécurité alimentaire et HACCP 37
J.BARILLER
Deuxième partie
Les micro-organismes
Manipulation 1 Les sondes nucléiques. Applications
A. KODJO en microbiologie alimentaire 61
Manipulation 2 Méthodes de recherche, de dénombrement
E. DROMIGNYt d'identification de Campylobacter jejuni 78
Manipulation 3 VIDAS Campylobacter (CAM) 104
bloMÉRIEUX
Manipulation 4 Pseudomonas et bactéries aérobies {Acinelobacter,
J.-P. LARPENT Alcaligenes, Agrobacterium, Flavobacterium,
Janthinobacterium, Xanthomonas) 111
Manipulation 5 Pseudomonadacées, dénombrement des Pseudomonas
M. POUMEYROL dans les viandes et produits à base de viande 128
Manipulation 6 Enterobacteriaceae et Vibrionaceae 133
O. COIFFER, M.-P. COPIN, M. LARPENT-GOURGAUD,
M. POUMEYROL, V. LAFARGE
Manipulation 7 Escherichia co/i 0157 H7 167
M.-P. COPIN X MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Manipulation 8 Salmonella 173
M.-P. COPIN
Manipulation 9 Le Salmonella 1,2 test et le mueap test
S. MANUEL,M. BUTIN, (référence BCL01010I) 181
C. AVOYNE
Manipulation 10 Transia Salmonella spp (références SA 0178 ,
M.-L. SORIN SA 0181, SA0168 et SA 0176)5
Manipulation 11 Les agents de la pourriture molle 194
J.-P. LARPENT
Manipulation 12 Les ferments lactiques et bactéries apparentées 199
M. LARPENT-GOURGAUD, O. MICHAUX, J.-P. LARPENT. N. DESMASURES,
M. DESMAZEAIID, I. MANGIN, FI. MASSON, M.-C. MONTÉE, P. TAILLIEZ, bioMÉRiEux
Manipulation 13 Méthodes d'identification des Staphylocoques 256
C. VHRNO/Y-ROZAND
Manipulation 14 Staphylococcus à coagulase positive 267
M . POUMEYROL, V . LAKARGE
Manipulation 15 Biotypage de Staphylococcus uitreus
M. SESQUÈS, M.-L. SORIN et dosage des enterotoxines staphylococciques 276
Manipulation 16 Enterotoxines staphylococciques 287
M.-P. COPIN
Manipulation 17 Recherche de Listeria monocytogenes dans le lait
M. LARPENT-GOURGAUD, et les produits laitiers 294
O. MICHAUX
Manipulation 18 Listeria 306
M.-P. COPIN
Manipulation 19 Méthodes d'identification des Listeria 31
S. MANUEL. M. BUTIN,C. AVOYNE
Manipulation 20 Transia Listeria spp.(références LI 0691 , LI 0689
M.-L. SORIN et LI 0694) 318
Manipulation 21 Bactéries corynéformes, Brevibacterium linens 326
J.-P. LARPENT
Manipulation 22 Clostridium et Bacillus 33
M . POUMEYROL
Manipulation 23 Mycobactéries 364
J.-P. LARPENT
Manipulation 24 Anaérobies (techniques de culture) 371
M.-B. ROMOND, C. ROMOND Table des matières XI
Manipulation 25 Bifidobacterium : isolement et identification 383
M. B.ROMOND
Manipulation 26 Système d'identification Biolog 391
S. MANUEL, M. BUTIN, C. AVOYNE
Manipulation 27 Les champignons 397
J.-P. LARPENT
Manipulation 28 Nutrition soufrée du Saprolegnia monoica 408
J.-P. LARPENT
Manipulation 29 Recombinaison génétique par fusion
P. COTTON REYMOND, et transformation de protoplastes 410
M . DURAND-POUSSEREAU, M . FÈVRE
Manipulation 30 Atlas des champignons utilisés dans les méthodes
J.-P. LARPENT d'essais microbiologiques normalisés (NFX 41-500)... 41 9
Manipulation 31 Clé de détermination des groupes et genres des
A. BRETON moisissures importantes dans les industries
agroalimentaires 441
Manipulation 32 Geotrichum candidum9
M.GUEGUEN
Manipulation 33 Les levures 465
C. CALLON
Manipulation 34 Détermination de l'activité antifongique de produits
P. MARTINET de traitements des bois en phase liquide 473
Manipulation 35 Recherche des mycotoxines
S. DRAGACCI dans les produits laitiers 481
Manipulation 36e des virus entériques 490
L. SCHWARTBROD
Manipulation 37 Conservation des souches 512
G. RIGARD
Troisième partie
Quelques problèmes physiologiques
Manipulation 38 Étude de l'adhésion de micro-organismes -
M.-N. BELLON-FONTAINE surfaces solides par sédimentation 521
Manipulation 39 Corrosion des aciers inoxydables par des produits
L. BOULANGÉ- de nettoyage et/ou de désinfection en industrie
PETERMANN agroalimentaire 524
Manipulation 40 Méthode d'obtention d'un biofilm expérimental
B. CARPENTIER sur une surface dite « ouverte » 530 XII MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Quelques notions sur l'hygiène 535 Manipulation 41
J.-P. LARPENT
Manipulation 42 Contrôle des populations microbiennes 540
J.-P. LARPENT
Manipulation 43 Sensibilité des micro-organismes
J.-P. LARPKNT aux antibiotiques 549
Manipulation 44 Étude de la croissance bactérienne
par bioluminescence : dosage de l'ATP 554 M. LARPKNT-GOURGAUO
Manipulation 45 Microbiologie et impédancemétrie 562
A. HERMANT, A. CROZIKR,
bioMérieux
Manipulation 46 Utilisation d'une norme Afnor dans le cas
M. LARPKNI-GOURGAUD de validation d'un produit en hygiène alimentaire 598
Quatrième partie
Microbiologie de l'environnement
et des produits alimentaires
Manipulation 47 Eaux polluées 615
J. Y. Bo/.io, D. BERTRAND
Manipulation 48 Équivalent demande chimique en oxygène
D. CHAMPIAT par chimiluminescence 634
Manipulation 49 Les eaux de mer et d'eau douce, suivi sanitaire 637
C. DEI.ARRAS
Manipulation 50 Le contrôle microbiologique des eaux 660
Cn. BARBAI.AT, I. MAGNOL
Manipulation 51 Dénombrement des bactéries aquatiques
D. CHAMPIAT, et tests de toxicité 673
J.-P. LARPENT
Manipulation 52 Les fermentations utilisées dans la production
J.-P. LARPENT d'aliments fermentes 684
Manipulation 53 Boissons non alcoolisées 69
J.-P. LARPENT, P.-J. CHOUETTE
Manipulation 54 Analyse microbiologique des vins... 700
R. TOURDOT-MARÉCHAL, M. GUILLOUX-BENATIER
Manipulation 55 Maîtrise d'un ensemencement de bactéries
M. GUII.LOUX-BENATIER, lactiques dans le vin 700
R. TOURDOT-MARÉCHAL Table des matières XIII
Manipulation 56 Microbiologie du lait et des produits laitiers 704
J.-P. LARPENT, M.-P. COPIN, A. GERMONVILLE,
M. JACQUET, J.-L. THÉTAS, bioMÉRiEux
REVUE PAR M . BALFONTAINE
Manipulation 57 Préparation de yaourt 806
Y. VAYSSIER
Préparation des beurres 810 Manipulation 58
V. LAFARGE
Manipulation 59 Analyse de fromages - Isolement et identification
C. CALLON de levures 812
Manipulation 60 Étude de Pénicillium roquefortii 832
J.-P. LARPENT, P. VEAU
Manipulation 61 Dosage de l'aspartyl protéinase
de Pénicillium roquefortii9 E. BRACQ
Manipulation 62 Analyse des croûtes de fromage 851
J.-P. LARPENT
Microbiologie des viandes 860 Manipulation 63
J.-P. LARPENT
Manipulation 64 Étude du saucisson sec 871
S. BANNARI. J.-P. LARPENT, M. LARPENT-GOURGAUD, O. MICHAUX
Manipulation 65 Analyse physicochimique des viandes fermentées 878
M.THIAUDIÈRE
Manipulation 66e de la lipolyse, de la protéolyse et de l'activité
S. BANNARI, J.-P. LARPENT. acidifiante des micro-organismes responsables
M. LARPENT-GOURGAUD, de la fermentation des produits carnés 907
O. MICHAUX
Analyse microbiologique des céréales Manipulation 67
J.-P. LARPENT et des légumineuses 912
Manipulation 68 Analyse des produits végétaux3
J.-P. LARPENT
Manipulation 69 Étude des levains de panification5
J.-P. LARPENT, E. BERVAS
Manipulation 70 Fabrication de « laits fermentes » de soja et de produits
J.-P. LARPENT, S. GAUTHIER de type « fromage » à pâte fraîche et à pâte molle 929
Manipulation 71 Fabrication du miso 939
J.-P. LARPENT, S. GAUTHIER
Manipulation 72 Analyse microbiologique des conserves 947
J.-P. LARPENT, M. LARPENT-GOURGAUD XIV MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Manipulation 73 Contrôle bactériologique des coquillages
C. DW.ARRAS (production et consommation) 961
Manipulation 74ee des algues marines
C. DKI.ARRAS alimentaires et des algues marines micronisées 973
Manipulation 75 Analyse bactériologique d*un plat cuisiné 988
A. RHYNAUD
Annexes
Normes d'après Afnor 1005
Exemples de milieux proposés pour les analyses normalisées 1013
Critères microbiologiques de certains produits alimentaires 1020
Analyse microbiologique des produits agroalimentaires8
Adresses utiles 1033
Bibliographie5
Index 1041 Première partie
LA QUALITE Chapitre
1
LA QUALITÉ AU LABORATOIRE
Maurice Bal-Fontaine
1. Qualité ?
Le terme qualité a toujours été très utilisé dans les laboratoires, mais actuellement
il n'est pas toujours employé avec le sens qu'on lui donnait auparavant, et il semble
qu'il y ait parfois confusion.
Le sens originel est le même, mais l'objet sur lequel porte la qualité a changé. Au
sens ancien, si l'on peut dire, il s'agit de la qualité des produits fabriqués, de leur
conformité bactériologique et chimique avec la législation, avec le souci d'innocuité.
Le laboratoire par ses analyses est garant de la qualité du produit fabriqué. Le labo­
ratoire était chargé du « contrôle qualité ».
Mais actuellement, le terme qualité est appliqué à ce que fait le laboratoire et à la
fiabilité de ses analyses.
Autour de ce mot qualité gravitent d'autres termes, tels que RNE, Cofrac, accrédi­
tation, certification, normes Iso 9 000.
1.1 Définitions
Quelques définitions, tirées de la norme Iso/DIS 8402 (le X 50-120).
• Qualité
« Ensemble des propriétés et caractéristiques d'un produit ou d'un service qui lui
confèrent l'aptitude à satisfaire des besoins exprimés ou implicites [...] Les besoins
sont habituellement traduits en propriétés et caractéristiques de critères spécifiés. Les
besoins peuvent comporter des aspects d'aptitude à l'emploi, de sûreté, de disponibi­
lité, de fiabilité, de maintenabilité des aspects économiques et relatifs à l'environne­
ment [...] Le terme qualité n'est pas utilisé pour exprimer un degré d'excellence dans 4 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
un sens comparatif ; il n'est pas utilisé non plus dans un sens quantitatif pour des éva­
luations techniques... »
• Système qualité
« Ensemble de l'organisation, des responsabilités, des procédures, des processus
et des moyens nécessaires pour mettre en œuvre le management de la qualité ».
• Manuel qualité
« Document énonçant la politique qualité et décrivant le système qualité d'un
organisme ».
1.2 Le système qualité
D'après ces définitions, nous comprenons que parler qualité dans un laboratoire
entraîne tout un environnement de procédures et de moyens. Ceci est décrit dans le
Manuel qualité du laboratoire.
L'accréditation est la « procédure par laquelle un organisme faisant autorité
reconnaît formellement qu'un organisme ou un individu est compétent pour effec­
tuer des tâches spécifiques ».
La certification est « la procédure par laquelle une tierce partie donne une assu­
rance écrite qu'un produit, un processus ou un service est conforme aux exigences
spécifiées ».
13 Le Cofrac
Le Comité français d'accréditation a été mis en place en juin 1994, prenant la
suite du Réseau national d'essais (RNE) et du Bureau national de métrologie (BNM
- Fretac), mais qui s'élargit vers d'autres sections.
Le RNE, créé en 1979, comprenait une commission sectorielle « Essais et ana­
lyses des produits agroalimentaires » depuis 1988. Peu après le Programme 59
« Analyses microbiologiques des produits agroalimentaires » voyait le jour.
Demander l'accréditation Cofrac est une démarche volontaire mais tend à devenir
une obligation, car beaucoup de demandeurs d'analyses l'exigent. La démarche qua­
lité peut s'effectuer sans la démarche de demande d'accréditation Cofrac. Le Cofrac
exige une formalisation de tout ce qui est fait au laboratoire : c'est la mise sous assu­
rance qualité. Il faut apporter la preuve qu'un certain nombre de moyens sont mis en
place pour donner confiance. Un audit est fait pour s'assurer :
- de l'indépendance et de l'impartialité du laboratoire ;
- que les moyens matériels et humains sont adaptés ;
- que les méthodes utilisées sont fiables et reconnues ;
- et que l'assurance qualité est mise en place selon la norme européenne EN 45001
« Critères généraux concernant le fonctionnement des laboratoires d'essais ».
Ces critères généraux sont repris dans un document du Cofrac qui les précisent
(doc. 1 002), et le programme 59 ajoute des exigences spécifiques, par exemple l'ap-La qualité 5
plication de la norme NF V 08-002, décembre 1985, Iso 7218 en cours de révision
(projet 1994) « Microbiologie alimentaire - Directives générales pour les examens
microbiologiques ».
2. Exigences à satisfaire
Les principes généraux de l'obtention de la qualité sont dans la norme européenne
EN 45001, cités plus haut.
Le but d'un laboratoire est l'analyse ; les résultats de cette analyse doivent corres­
pondre à ce qui est réellement dans l'échantillon analysé.
On peut énumérer les différents facteurs pouvant agir sur la correspondance entre
le résultat des analyses et la qualité réelle du produit :
- la conservation de l'échantillon dès sa réception ;
- la non contamination lors des manipulations ;
- l'utilisation de méthodes reconnues ;
- utilisées par un personnel compétent ;
- avec des produits et consommables tels qu'ils n'influencent pas le résultat ;
- du matériel en bon état et fiable ;
- la maîtrise de l'organisation.
Tout cela ne peut être atteint que par la volonté de la direction qui donne les
moyens.
Explicitons tout cela. Les paragraphes suivants peuvent être des amorces de cha­
pitres d'un Manuel qualité.
2.1 Gestion
La maîtrise de cette organisation est décrite dans le Manuel qualité, éventuelle­
ment précisé dans un Plan qualité. Le Manuel qualité s'applique à l'ensemble du
laboratoire, alors que le Plan qualité se consacre à une section Chimie, ou bien
Microbiologie, etc.
Si dans un laboratoire on pense facilement aux méthodes d'analyses, on associe
rarement la qualité avec l'organisation interne du laboratoire.
Cette organisation entraîne un certain nombre de documents. On vient de parler
du Manuel, du Plan, mais il y a aussi les procédures (décrivant qui fait quoi, où,
quand, comment...), des modes opératoires, et aussi les enregistrements, preuves de
ce qui a été fait et par qui.
Les documents qu'entraînent le fonctionnement du laboratoire sont archivés et le
laboratoire doit maîtriser cette action. Par exemple, apporter la preuve qu'il y a
6 mois, c'était tel milieu utilisé dans telle analyse alors que maintenant est choisi un
autre milieu. 6 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Un moyen efficace de contrôler l'efficacité de cette gestion est, partant d'un
résultat ancien, de pouvoir tout retrouver : aussi bien les méthodes d'analyses, les
milieux utilisés (avec les références du fabricant), les preuves de sa stérilisation à
l'autoclave, les délais réels d'incubation des boîtes, le relevé des températures de
l'étuve ce jour-là, etc.
2.2 Locaux
Ils doivent être suffisamment spacieux pour un maintien aisé des zones de travail
en ordre et propres. Vingt mètres carrés sont recommandés par analyste.
Leur conception doit s'inspirer de la « marche en avant », appliquée dans les
usines agroalimentaires, évitant le croisement des circuits. Mais, même dans la
construction de nouveaux laboratoires, il est très difficile de l'appliquer. Il faut alors
définir, un aménagement « spatio-temporel » : ce qui ne peut être séparé dans l'es­
pace l'est dans le temps, en étudiant très attentivement le circuit des flux propres,
contaminés, des déchets.
Des salles séparées pour la réception, l'analyse, les lectures évitent des contami­
nations croisées.
L'aménagement des pièces elles-mêmes prend en compte, par exemple, la hauteur
des placards (jusqu'au plafond pour éviter les nids à poussière).
Il faut privilégier les surfaces lisses ou arrondies : sols, murs, plafonds, paillasses,
facilement nettoyables, joints. Les tuyauteries ne sont pas apparentes, non seulement
pour ne pas être recouvertes de poussières, mais aussi pour éviter les condensations.
Les portes et fenêtres fermant hermétiquement évitent les courants d'air.
Les aspérités, les divers rebords de matériaux sont à proscrire, pour limiter le
dépôt de poussières.
Des filtres sont placés pour les systèmes de ventilation.
Si le mobilier est facilement amovible (placards, étuves sur roulettes), le net­
toyage en est facilité.
Il faut prévoir l'entretien régulier aussi bien du lavage des sols (journalier) que du
lessivage des murs (annuel, par exemple).
23 Le matériel
Il faut distinguer essentiellement le matériel de mesure et celui d'analyse.
Le matériel de mesure (thermomètres, masses, chronomètres, matériel de
volumes) doit être contrôlé et raccordé à des étalons dont la traçabilité est assurée.
Le laboratoire se doit d'organiser sa métrologie pour le raccordement de ses appa­
reils.
Beaucoup de laboratoires de microbiologie n'étaient pas familiers avec ce terme
de métrologie et au raccordement d'étalons. La qualité 7
Voici la définition de la métrologie d'après la norme NF X 07-001 :
« Domaine des connaissances relatives au mesurage.
Note : la métrologie embrasse tous les aspects aussi bien théoriques que pratiques
se rapportant aux mesurages quel que soit le niveau d'exactitude de ceux-ci et quels
que soient les domaines de la science et de la technologie. »
Selon sa politique financière ou en personnel, son organisation interne, il peut :
- être lui-même un SMH (service de métrologie habilité) ;
- confier le soin d'étalonnage, de vérification de son matériel à un organisme
habilité ;
- faire étalonner ses étalons, et lui-même alors fera des étalons de travail avec les­
quels il vérifiera son parc de matériel de mesure ;
- faire procéder à ce travail par un organisme non habilité mais ayant des étalons
raccordés (mais le Cofrac acceptera très difficilement ce cas).
Le matériel d'essai doit être suivi et ses caractéristiques contrôlées. Des docu­
ments plus ou moins élaborés le permettent. On pourra créer des fiches signalétiques
donnant ses caractéristiques, des « fiches de vie » sur lesquelles seront reportées les
interventions, les contrôles, vérification ou autres qui ont été effectués sur lui. Une
fiche de prescription précisant les opérations à effectuer avec leur périodicité peut
être adjointe. Une seule fiche suffit à les remplacer selon les usages de chacun.
Le matériel est vérifié régulièrement. Sur ce matériel est inscrit la date de la der­
nière vérification et celle de la prochaine.
La précision et les incertitudes de chaque moyen de mesure sont déterminées et
connues. Les tolérances du matériel d'essai sont fixées.
Ainsi, on ne demande pas la même précision pour des thermomètres utilisés dans
un four à cendres à 550 °C ou dans une étuve pour Escherichia coli. Dans le premier
cas, une sonde graduée tous les 5 degrés et précise à ± 5 °C conviendra, mais pour le
second, un thermomètre gradué à 0,2 et précis à 0 3 sera nécessaire.
Les différentes températures seront enregistrées soit manuellement, soit à l'aide
d'un enregistreur.
Des procédures décrivent les différentes opérations d'étalonnage, de vérification,
de contrôle ou d'entretien et sont portées à la connaissance des utilisateurs.
2.4 Le personnel
Le personnel doit être compétent et la formation joue un rôle important. Avant de
manipuler, une « habilitation » doit être prévue.
Il doit connaître les risques envers l'environnement et envers lui-même Une for­
mation sécurité sur ce sujet est indispensable.
L'effectif doit être suffisant pour réaliser les analyses correctement. 8 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Les postes du laboratoire sont définis : « qui fait quoi » ; en particulier la respon­
sabilité de chacun des postes est bien précisée. Le travail de chaque poste est déli­
mité, sa responsabilité envers le matériel utilisé aussi.
Comprend-il le nettoyage journalier, l'entretien hebdomadaire, les vérifications, les
étalonnages ? À moins que les emplois du temps permettent facilement de retrouver
l'opérateur, celui-ci est amené à « parapher » souvent des relevés d'enregistrement.
La confidentialité des résultats : ceux-ci ne doivent être communiqués qu'au
demandeur. Aussi, la confidentialité est une obligation pour le personnel, mais se
retrouve aussi dans la transmission des résultats ; établir des règles pour le
téléphone : qui peut transmettre, à qui et dans quelles conditions.
Un responsable qualité doit être nommé. Les relations fonctionnelles et opération­
nelles sont à établir clairement.
2.5 Les consommables
Il faut définir les règles du choix des fournisseurs ainsi que celles de réception,
d'étiquetage, de contrôle, de conservation, de délai d'utilisation.
2.6 Les analyses
Les méthodes normalisées ou internes sont suivies à la lettre.
Pour s'assurer de la fiabilité des analyses qu'il fait, le laboratoire procède à des
contrôles internes et participe à des chaînes d'analyses.
En interne, des tests dits négatifs (absence de contamination dans les milieux uti­
lisés) et de fertilité (aptitude à la croissance des germes) sont menés systématique­
ment. S'y ajoutent des analyses en double, deux personnes sur le même produit par
exemple, ou le même produit partagé en deux et analysé par la même personne
l'ignorant.
2.7 Les échantillons
Les échantillons sont parfaitement identifiés, conservés comme il convient avant
analyse.
À leur réception, leur état est vérifié et la faisabilité des analyses contrôlée. Des
règles d'acceptabilité sont prévues ainsi que la conduite à tenir en cas de non confor­
mité.
Souvent le prélèvement n'est pas effectué par le laboratoire ni sous sa responsabi­
lité, cependant il se doit de donner les conseils techniques sur la manière de l'effec­
tuer et de l'envoyer.
2.8 Traçabilité
La norme Iso/DIS 8402 la définit ainsi : La qualité 9
« Aptitude à retrouver l'historique, l'utilisation ou la localisation d'une entité au
moyen d'identifications enregistrées. »
La traçabilité est délicate à mettre en place. Plus haut, la formule « qui fait quoi »
a été utilisée, et ici, c'est son application : « qui a fait et avec quoi ? ». À partir d'un
ancien rapport d'analyse, il faut pouvoir remonter à l'enregistrement de l'échantillon
et suivre son analyse, les personnes y ayant participé, les méthodes utilisées, les pro­
duits consommés, etc.
2.9 Anomalies, dérogations, réclamations et mesures correctives
Penser que, ayant pris toutes les précautions nécessaires, il ne peut jamais y avoir
de déviations, d'accidents, relève de l'utopie. Il faut donc aussi faire en sorte de maî­
triser et de remédier à ces dysfonctionnements.
Les réclamations venant des clients ou d'autres services rappellent qu'il peut y
avoir des failles. Des anomalies peuvent être détectées, et certaines situations peu­
vent amener à prendre des dérogations. Tout ceci doit faire l'objet de documents
écrits, sur lesquels on rappellera la date, les faits et l'action menée.
Des procédures décriront le traitement des anomalies, dérogations, réclamations.
Des audits internes sont effectués à des fréquences déterminées, pour examiner si
les dispositions décrites dans le Manuel qualité ou les procédures sont suivies.
Une Revue système, par l'étude des dérogations, anomalies, réclamations permet­
tra de vérifier l'adéquation de ce qui est mis en place avec le but du laboratoire et
l'assurance qualité et d'être à l'origine de certaines évolutions.
3. Aspect international
Dans les échanges internationaux, pour garantir les consommateurs sans que
chaque pays revérifie ce qui a déjà été analysé ailleurs, il faut la confiance provenant
d'un processus « tierce partie » d'évaluation des laboratoires ayant réalisé les ana­
lyses, telle qu'une accréditation. La confiance ne peut exister que s'il existe des cri­
tères communs d'appréciation. Des accords de reconnaissance entre organismes
nationaux peuvent exister après des audits réciproques sur leur manière de procéder
aux accréditations. C'est ainsi qu'une dizaine de pays ont signé un accord multilaté­
ral pour reconnaître l'équivalence de leurs systèmes d'accréditation. Citons la
France, l'Angleterre, la Suède, l'Italie, la Norvège, l'Espagne, mais il y en a d'autres
et le mouvement continue.
Des organismes internationaux tels que l'ILAC (International Laboratory Accré­
ditation Conférence) et européen, le EAL continuant le Western European Testing
Laboratory Accréditation Coopération, ont été créés pour harmoniser et favoriser les
échanges. Ils étudient les implications commerciales des accréditations, leur pratique
et le fonctionnement des laboratoires. Ces instances élaborent des guides qui servent
de base aux exigences nationales. 10 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
4. BPL
Le terme « bonnes pratiques de laboratoire (BPL) » est souvent utilisé aussi, mais
là encore, comme pour le mot qualité, il y a ambiguïté. Le Cofrac, en plus de son
activité en accréditation, effectue les « inspections BPL ». Et le Groupe interministé­
riel des produits chimiques (Gipc) utilise les résultats pour prononcer la « reconnais­
sance BPL » d'un laboratoire. Ce référentiel BPL concerne la réalisation d'études
non cliniques pour l'évaluation des effets sur l'homme, les animaux et l'environne­
ment, effectuées à des fins réglementaires sur tous les produits chimiques autres que
les médicaments et certains produits visés par le code de la santé. Le domaine de ces
laboratoires se situe dans la toxicologie, la microbiologie, etc.
Les BPL portent par exemple sur la réalisation, la planification, l'enregistrement,
le rapport des résultats, l'archivage des brouillons, etc. C'est donc un terme « offi­
ciel » qui a un sens précis.
Dans Les bonnes pratiques de fabrication, qui est le référentiel pour les fabricants
de médicaments, il y a un chapitre concernant les bonnes pratiques de laboratoire. Le
terme a sans doute été validé par la FDA (Food and Drug Administration) qui a
publié dans Fédéral Rcgister, le 22 décembre 1978, « Non clinical laboratory stu-
dies, good laboratory practice régulations). L'OCDE a lui aussi préconisé les
« OECD principles of good laboratory pratices » dans l'annexe 2 de la décision du
conseil de l'OCDE adoptée le 12 mai 1981. Et des instructions ministérielles fran­
çaises y font référence.
5. Note sur les normes
Lorsqu'on veut rechercher un micro-organisme se pose la question de la
méthode : chacun sait que deux méthodes proposant la même recherche risquent fort
de ne pas donner le même résultat. Comme la réglementation fixe des teneurs mini­
males ou maximales, une méthode officielle est préconisée en même temps et obli­
gatoirement appliquée par les services officiels.
Mais on trouve ou on trouvait quantités de méthodes : arrêtés officiels, méthodes
Afnor ou Iso, ou de certains corps de métiers (Fédération internationale de laiterie,
ou Centre technique de la salaison et des conserves de viandes, par exemple). À cela
vient s'ajouter que chaque laboratoire a souvent mis au point sa propre méthode. La
Communauté Européenne préconise aussi des méthodes. Il y a donc pléthore d'orga­
nismes proposant des méthodes.
Heureusement des coordinations ont été créées tant au plan national, qu'européen
et international.
Au plan international, souvent des normes ont été un moyen de protectionnisme,
mais les différents accords commerciaux internationaux luttent contre cette ten­
dance. La qualité 11
5.1 Plan international
L'Iso a été créée en 1926, sous le nom alors de Fédération internationale des asso­
ciations nationales de normalisation.
Il y a aujourd'hui environ 90 pays membres de cette organisation. Elle est compo­
sée de comités techniques (TC) avec de nombreux sous-comités. Ainsi le Comité
Iso/TC 34 « Produits agricoles et alimentaires » a un sous-comité 5 « Lait et produits
laitiers » et un sous comité 6 « Viandes et dérivés ».
Le siège de l'Iso est à Genève. Les langues officielles en sont l'anglais, le fran­
çais et le russe.
Les normes ont un numéro chronologique d'édition.
Un pays, même membre de l'Iso, n'est pas obligé d'adopter une norme Iso.
Les membres de l'Iso ont établi un code avec classe et sous-classe qui apparaît
maintenant sur toutes les normes nationales et internationales des membres de l'Iso,
permettant de classer less par grands groupes sur lesquels tous les pays se
sont mis d'accord et qui s'ajoute à la première numérotation : c'est le code ICS.
5.2 Plan européen
L'Europe a mis en place, en 1961, le CEN pour harmoniser les normes d'analyses
en Europe. Les langues officielles sont l'anglais, l'allemand et le français. Quand le
CEN officialise une norme, chaque pays membre doit alors la faire sienne et aban­
donner sa norme traitant du même sujet l'application est donc différente de celles
des normes Iso.
53 Plan national
Certes une méthode normalisée d'analyse n'est pas d'emploi obligatoire pour un
industriel. Cependant il semble difficile de ne pas la pratiquer, si l'on veut parler le
même langage que les autres analystes.
Sur le plan national, le 6 janvier 1988, un protocole d'accord a été signé entre
l'Afnor (Association française de normalisation) et la DGCCRF (Direction générale
de la concurrence, de la consommation et de la répression des fraudes) pour l'har­
monisation des méthodes d'analyse. C'est ainsi que maintenant, les Arrêtés officiels
renvoient aux normes Afnor quand elles existent pour le sujet concerné.
L'Afnor a été créée en 1926. C'est une association privée dotée d'un statut offi­
ciel. Elle est chargée, entre autres rôles, de coordonner toutes les activités de norma­
lisation.
Elle participe au Comité européen de normalisation (le CEN) et à l'Organisation
internationale de normalisation (Iso).
Avant, chaque commission sectorielle éditait les normes qu'elle estimait néces­
saires, ce qui fait que par exemple on avait une norme coliformes pour le lait, une
autre pour la viande, une autre pour la gélatine, etc. Maintenant au fur et à mesure de 12 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
l'édition de normes, la tendance en microbiologie est de favoriser les normes dites
« horizontales », de préférence aux verticales. C'est-à-dire que la méthode s'ap­
plique à tous les produits, sauf démonstration que c'est vraiment indispensable d'en
éditer une autre pour le produit concerné.
Un autre travail actuel de la commission Microbiologie alimentaire est de mettre
au point des méthodes de routine, dont la principale différence d'avec les autres
méthodes est souvent de n'utiliser qu'une boite par dilution.
Pour la classification des normes, l'Afnor utilise les lettres de l'alphabet, chaque
lettre s'appliquant à un champ particulier. Ainsi, les normes V concernent l'agricul­
ture, l'agroalimentaire. Des sous-groupes sont distingués par deux chiffres : ainsi les
V 04 concernent les produits laitiers et la viande, alors que les V 08 portent sur la
microbiologie agroalimentaire en général. Les normes commençant par V 45 traitent
des produits de la pêche. Trois chiffres supplémentaires permettent un classement
individuel de la norme
Pendant un temps, l'Afnor indiquait si la norme était identique ou équivalente à la
norme internationale correspondante. Maintenant dans une tendance vers une plus
grande uniformisation internationale, l'Afnor si elle accepte une norme Iso l'intègre
dans son recueil et l'appelle par exemple norme NF Iso 7218, reprenant le numéro
de la norme Iso, et l'ancienne appellation V 08-002, devient alors l'Indice de classe­
ment ou le.
Pour les normes européennes, la référence devient NF EN avec le numéro CEN.
Mais le CEN s'efforce aussi de prendre les normes Iso quand elles existent. Une
norme Iso devenue norme européenne donc française peut avoir une référence un
peu compliquée, car rappelant sa généalogie.
Exemple, la norme NF EN 29002, Iso 9002, Indice de classement X 50-132,
« Systèmes qualité - Modèle pour l'assurance de la qualité en production et installa­
tion », sans compter le code ICS ! Chapitre
2
QUALITÉ MICROBIOLOGIQUE
DE TRANSFORMATION DU LAIT
Xavier Rossignol
Sous le terme générique de qualité, plusieurs points ou définitions sont sous
entendus. Il est donc important et primordial de définir ce que l'on cherche et de tra­
cer son objectif.
L'objectif étant établi, nous pouvons remonter dans la technologie et marquer les
points sensibles ou carrefours qui risquent de dévier de l'objectif final souhaité.
L'analyse des risques n'est pas le sujet traité (cf. HACCP).
1. Définition de la qualité
Sous ce terme, trois définitions peuvent être sous entendues :
1.1 Qualité technique
La démarche due est d'assurer au produit une garantie jusqu'à sa DLUO
(date limite d'utilisation optimale) suivant un cahier des charges précis. Le rôle du
technicien est de repérer et d'identifier les causes de dégradations du fromage lors de
sa conservation et de sa commercialisation.
Le fait de repérer et d'identifier permet de remonter la technologie afin d'évaluer
les risques associés aux différents stades du process de fabrication.
Le process est une source de risques mais l'élaboration d'un fromage provient
d'une matière première qui répond à des critères qualitatifs souvent différents du
transformateur.
Toutefois, la qualité d'un produit ne se borne pas à sa non-dégradation, l'aspect
sanitaire est un aspect important qui souvent n'est pas en relation avec la qualité
technique. 14 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
1.2 Salubrité alimentaire
La législation définit des critères bactériologiques suivant le produit. Le rôle du
transformateur est de garantir les critères légaux en vigueur. Ces critères concernent
les bactéries pathogènes (ex. : Listeria) et les bactéries d'indicatrices de contamina­
tion fécale (ex. coliformes).
Ces deux types de contaminations identifient le risque. En effet, les bactéries
d'indication de contamination fécale traduisent le degré d'hygiène dans l'élaboration
du produit tandis que les bactéries pathogènes traduisent la maîtrise du process.
Nous distinguons dans le pouvoir pathogène deux types de « mécanismes » :
- la toxinogénèse ;
- la virulence.
12.1 La toxinogénèse
C'est le processus de production d'une toxine, sécrétée par la bactérie à l'endroit
où elle se trouve. Nous distinguons deux types de toxines :
- les exotoxincs ;
- les endotoxines.
1.2.1.1 Les exotoxines
Elles sont libérées par le micro-organisme dans le milieu. Produites par les
bacilles à Gram + (ex. : Clostridium botulinum), ce sont des protéines solubles, sou­
vent thermolabiles avec un pouvoir pathogène élevé. Elles sont responsables d'in­
toxication
1.2.1.2 Les endotox i nés
Responsables des toxi-infections, ce sont des parties constituantes du corps
microbien. Produites par les bacilles à Gram- (ex. : Salnionellci). Elles sont formées
de glucides, lipides, polypeptides. Elles sont thermostables et ont un pouvoir toxique
modéré.
1.22 La virulence
C'est l'aptitude propre à certains germes à se répandre dans l'hôte et à s'y multi­
plier malgré les défenses que l'hôte a opposées (ex. : pneumocoques).
Les qualités technique et sanitaire sont indissociables même s'il n'existe pas de
relation directe entre elles.
Le terme général de la qualité est défini suivant des normes.
13 Définition de la qualité par Iso NFX 50-120
« Ensemble de propriétés et caractéristiques d'un produit ou service qui lui
confère l'aptitude à satisfaire des besoins exprimés ou implicites ». La qualité 15
Dans le cadre microbiologique, cette norme englobe les deux points cités plus
haut à savoir la réponse à un besoin exprimé par le marché (conservation, distribu­
tion, commercialisation...) et des besoins implicites ou sous-entendus à savoir la
non-toxicité du produit.
2. Connaissance de la matière première
La qualité microbiologique (souvent sanitaire) de la matière première est détermi­
née sur des critères généraux pouvant satisfaire globalement toutes les filières de
l'industrie laitière.
Le niveau de qualité du lait reflète l'état bactériologique de celui-ci chez le pro­
ducteur à un moment donné. La qualité du lait arrivant en début de process est aléa­
toire et peu précise car les délais des moyens de contrôle sont trop longs par rapport
aux délais de traitement du lait.
En conséquence, trois paramètres sont à prendre en compte pour repérer et identi­
fier l'état microbiologique du lait à l'entrée de l'usine. L'objectif de cet état des
lieux permet de trier le lait en fonction des critères recherchés d'évaluation du risque
de dégradation et sanitaire du produit.
2.1 Provenance
La provenance du lait permet par rapport à un historique de données d'appréhen­
der son état. En effet, un lait provenant d'un bassin laitier où se situe l'usine possède
en fonction des saisons un caractère qualitatif d'une relative constance (méthode
d'élevage identique, ramassages réguliers...). Un lait provenant de l'extérieur de
cette zone est complètement inconnu car aucune donnée historique ne permet de le
qualifier. De plus si ces données étaient connues celles-ci seraient erronées par les
conditions de mélange, de traitements physiques, de transports...
2.2 Conditions d'acheminement à l'usine
Ce critère est très important surtout pour des laits extérieurs, la connaissance des
paramètres suivants peut permettre d'évaluer et de repérer l'état qualitatif :
- température du lait au « dépotage » ;
- acidité ;
- mélange de différentes zones de ramassage ;
- existence de stockages intermédiaires ;
- existence de traitements physiques (ex. : traitement thermique) ;
- âge moyen.
2 3 Âge
Le lait étant un très bon milieu de culture, le développement microbien est étroite­
ment lié à l'âge du lait : c'est-à-dire au temps écoulé entre la traite et sa transforma-16 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
tion. Les conditions de traite et de ramassage couplées à l'âge du lait peuvent faire
varier fortement l'état bactériologique.
2.4 L'état physique et bactériologique
Cet état est la résultante de la provenance, des conditions d'acheminement à
l'usine et de l'âge du lait.
Le transformateur face à tous ces paramètres inconnus ou mal évalués a recours à
des procédés technologiques adaptés aux critères du produit recherché.
3. Connaissance du process : maîtrise
Le process employé dans l'élaboration d'un produit doit permettre la maîtrise des
risques de contaminations ou de recontaminations tant de la matière mise en œuvre
que du produit. Cette maîtrise du risque se situe à quatre niveaux :
3.1 Le matériel
Le matériel doit être adapté à la technologie employée et à l'objectif final recher­
ché. Exemple :
-Mal utilisé, il est le siège de contaminations d'ordre hygiénique (nettoyage...)
et d'ordre sanitaire (couple temps température mal adapté ou non respecté...).
- Peu maîtrisé (ex. : manque de sonde pH, de sondes température...), la qualité du
produit par rapport aux critères établis est aléatoire et imprévisible.
- Mal adapté, ex. : conditionnement d'un produit fragile (produits frais) en atmo­
sphère non contrôlée.
3.2 L'environnement
Des règles simples et provenant du bon sens permettent de limiter la recontamina­
tion du produit en phase d'élaboration. En partant du principe que plus la matière est
transformée plus celle-ci est propre, une marche en avant du processus s'impose.
Le produit ne doit pas être en contact avec d'autres productions plus recontami­
nante (ex. : séparer la fabrication d'un fromage au lait cru d'un fromage pasteurisé
ou commencer par lan du fromage en lait pasteurisé pour finir par la fabri­
cation d'un fromage au lait cru si les ateliers ne sont pas séparés).
Les sous produits résultants de la transformation, souvent source de recontamina­
tions doivent être évacués et stockés dans un endroit éloigné de l'atelier (lactosérum
par exemple).
L'atelier doit répondre à des normes spécifiques d'hygiènes (carrelage, points
d'eau...).
L'élaboration d'un fromage fait appel à différents process schématisés comme
suit : traitement du lait, transformation du lait, salage ou conditionnement, affinage
ou stockage. Afin d'éviter les risques de recontaminations dans la succession des La qualité 17
étapes, un cloisonnement de chaque étape doit être réalisé (on ne fait pas tout dans le
même atelier !).
33 Le personnel
Celui-ci doit être formé, sensibilisé et motivé sur l'hygiène. Il doit connaître les
points faibles du process et de la technologie afin d'être encore plus vigilant. Il doit
être formé au matériel et à son environnement pour que la technologie réalisée soit
conforme à l'objectif fixé et attendu.
3.4 La technologie
Celle-ci doit être établie en fonction de l'évaluation des risques du produit qui
sont dépendants « des besoins exprimés et implicites ». La maîtrise de la transforma­
tion de la matière première est importante mais non suffisante car dans l'élaboration
d'un produit laitier, l'industriel a besoin d'adjuvants ou d'auxiliaires de fabrication.
Cette « matière secondaire » peut être une source de contamination ou de recontami­
nation. Lorsque celle-ci subit des traitements adéquats et prévus dans la technologie
le risque est réduit surtout si les points cités plus haut sont appliqués. Il est envisa­
geable que certains auxiliaires ou adjuvants ne puissent pas supporter la technologie
(ex. : traitement thermique des enzymes coagulantes). Des contrôles supplémentaires
doivent être réalisés sur les lots mis en œuvre. Généralement cela est possible car les
résultats bactériologiques sont connus avant l'utilisation de cette matière secondaire.
Si ce n'est pas le cas, la technologie doit être modifiée pour minimiser les risques
microbiologiques (techniques et sanitaires) en fonction des critères recherchés.
La technologie employée doit répondre à l'objectif souhaité. Il n'est pas rare de
modifier une technologie afin de réduire les risques sanitaires (Listeria) et/ou de
satisfaire une demande commerciale (ex. : augmentation de la DLUO).
Une technologie n'est jamais fixée, elle fluctue en fonction de l'évolution de la
consommation et des critères bactériologiques légaux.
Une technologie doit être adaptée au produit à fabriquer. Pour cela une connais­
sance du produit est nécessaire et impérative.
4. Connaissance du produit
Par rapport au sujet traité, la connaissance du produit se focalise sur son aptitude
à développer une croissance microbienne ou à favoriser tel ou tel agent d'altération
ou sanitaire. Enfin de déterminer un niveau de population qui répond à nos préoccu­
pations de qualités (définies au préalable). Cette « écologie » microbienne dépend
des facteurs suivants :
4.1 « Autoprotection »
Aptitude du produit à limiter une croissance microbienne. Dans ce domaine, nous
distinguons deux niveaux : 18 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
4.1.1 Physicochimique
pH, a„. Les pH acides et les aw basses réduisent voire inhibent le développement
microbien. a est déterminée par : w
- l'extrait sec (ES) du produit. Les poudres de lait ne favorisent pas le développe­
ment microbien ;
- la teneur en sel : le sel est depuis longtemps connu comme un moyen efficace
de conservation (inhibition du développement microbien).
Le pH acide inhibe le développement bactérien mais réduit aussi l'activité enzy-
matique. Les enzymes sont issues de la lyse bactérienne. Cet aspect sera évoqué au
paragraphe 5.
4.12 Bactériologique
Dans un produit, tel que le fromage coexistent les germes qui proviennent de la
matière première et des ferments lactiques apportés. Ces ferments sont indispen­
sables dans l'industrie laitière pour :
- la coagulation et l'arôme ;
- l'égouttage des fromages ;
- la fabrication du beurre.
Des interactions favorables (synergie) ou défavorables (antagonisme) intervien­
nent. La maîtrise de ces interactions permet d'assurer au produit une protection dite
lactique.
- Une bonne activité des ferments lactiques empêche le développement des
germes de gonflement (coliformes).
- Une bonne activité des streptocoques lactiques favorise le démarrage des lacto-
bacilles qui prennent le relais dans l'acidification de certains produits
(yaourt...).
- Une bonne activité protéolytique des lactobacilles dans les pâtes cuites favorise
le développement des bactéries propioniques.
- Certaines bactéries produisent des substances bactériostatiques.
- Let de ferments lactiques se traduit par des modifications du
milieu (pH, potentiel redox, diminution des teneurs en lactose...) ou favorise
l'implantation d'autres groupes de germes utiles dans la protection du produit
(le développement des microcoques favorise l'implantation des Corynebacteria
sur la croûte du fromage).
Dans le cas des desserts ou produits assimilés l'ensemencement en ferments lac­
tiques n'est pas recherché, il n'existe pas de protection lactique ni de protection phy­
sique. Pour remédier à ce manque, le choix d'une technologie adaptée a donc été
nécessaire : emploi de la stérilisation, ingrédients stérilisés, conditionnement sous
ambiance stérile, emballage étanche aux micro-organismes. La qualité 19
4.2 Composition
L'autoprotection physicochimique et bactériologique est la résultante de la com­
position du produit. Cette composition répond à des critères organoleptiques et com­
merciales. Elle dépend de la technologie et du process employé.
Généralement, la composition d'un produit (physicochimique et bactériologique)
n'est pas suffisante pour assurer au cours du temps une garantie sanitaire et de non
altération. C'est pourquoi les points 4.3, 4.4, 4.5, 4.6 dépendent étroitement de la
composition du produit.
43 Emballage
L'emballage sera d'autant plus sophistiqué que le produit a un niveau d'auto-pro­
tection faible.
4.4 Durée de vie souhaitée
La durée de vie du produit est dépendante du niveau de population de germes et
de leur faculté à se développer.
4.5 Chaîne du froid dans l'entreprise
Un produit à faible protection (desserts) ou à population microbienne très élevée
doit être stockée au froid le plus rapidement possible pour éviter le développement
de germes indésirables (germes acidifiants, levures, germes pathogènes...) ou à acti­
vité excessive des ferments lactiques qui altérerait le produit du point de vue organo-
leptique (yaourt...). De plus un stockage prolongé dans l'entreprise réduit le temps
de commercialisation pour une DLUO donnée.
4.6 Circuit de distribution
Si la maîtrise de la chaîne du froid à l'extérieur de l'entreprise n'est pas certaine,
il faut repérer et identifier les causes supplémentaires de dégradation afin d'évaluer
des risques supplémentaires au niveau de la matière première, du process et de la
technologie.
Un plan qualité dans l'élaboration d'un produit laitier dépend beaucoup plus du
devenir du produit hors de l'entreprise que du produit lui-même. C'est pourquoi, le
chapitre suivant sera développé.
5. Relations matières premières - process - produit
Tout au long des quatre sous parties précédentes a été situé le cadre dans le lequel
les critères qualitatifs définis évoluent pour un produit donné.
Nous définissons ainsi qu'il n'existe pas de règle universelle pour gérer la qualité
d'un process. 20 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
La connaissance approfondie du produit génère le plan minimum et incontournable
du suivi qualité (technologique et sanitaire) de la matière première et du process.
5.1 Identifier le risque produit
L'identification du risque produit vise à prévoir la croissance, la survie ou la des­
truction des micro-organismes importants dans les aliments afin de préciser le temps
pendant lequel la sécurité et la qualité microbiologique sont garantis.
5.1.1 Altération
Généralement, la prévision de la microbiologie prédictive détermine une DLUO
du produit (déterminée par des tests au laboratoire : recherche des causes de vieillis­
sement accéléré d'un produit). Face à la pression du marché, cette DLUO est déter­
minée par le dialogue commercial. Le technicien est chargé de garantir la fraîcheur
du produit en évitant une prolifération microbienne. Pour cela, il doit :
- connaître la source des micro-organismes constituants le produit :
- lait
- levains
- contamination
-caractériser leur environnement (t °C,pH,a , pression osmotique...) ; w
- identifier le ou les micro-organismes qui limitent la durée de vie du produit. La
population la plus importante dans un groupe donné n'est pas toujours respon­
sable d'une dégradation excessive ;
- évaluer le potentiel enzymatique de son produit et l'origine ;
- fixer le niveau de contamination tolérable en un point de la chaîne en fonction
de la tolérance en bout de chaîne.
5.12 Sanitaire
Le niveau sanitaire est généralement établi par la réglementation. Cet aspect
législatif est souvent donné pour une denrée alimentaire sortie usine. Depuis
quelques années, la vie « commerciale » du produit est de plus en plus longue, c'est
pourquoi, ces normes doivent être garanties jusqu'à la DLUO du produit. Cela pose
le problème de la pertinence de la méthode employée pour rechercher un germe
(absence dans 25 g ou dans 1 g, fiabilité, précision...). En effet, le technicien n'étant
plus maître de son produit à l'extérieur de l'entreprise, il doit se reposer sur la fiabi­
lité de l'analyse microbiologique afin d'assurer à la denrée alimentaire un niveau
sanitaire optimal à DLUO.
5.2 Connaître les sources de contaminations et leurs implications
sur l'altération du produit et sur la salubrité du produit
Dans cette situation, le technicien doit passer en revue toutes les causes possibles
d'altération de son produit en répondant oui ou non à toutes les questions posées. Le La qualité 21
but de cette démarche est de créer une check-list des raisons susceptibles de dégra­
der son produit. À cette liste, il positionne les points possibles dans l'élaboration de
son process responsables de ses préoccupations. Le technicien doit préciser à quel
moment l'état microbiologique du produit a été élaboré afin de pouvoir le cas
échéant remonter à un point précis du process et non à la source.
53 Préciser la nature des micro-organismes
Il faut dans cette démarche différencier les agents d'altération, de contamination
et pathogènes car le raisonnement ne peut être global. Il est spécifique à chaque
agent.
53.1 Agents d'altération
Plutôt liés à la technologie ou recette employée (association de ferments non per­
tinente, activité fermentaire trop élevée...) et à la matière première (présence de spo-
rulés, stock enzymatique important (psychrotrophes).
53 2 Agents de contamination
Plutôt liés au process et à la matière première : hygiène (coliformes, entérobacté-
ries...).
533 Agents pathogènes
Plutôt liés à la matière première et à la manipulation humaine. Souvent un process
favorise la prolifération de l'agent mais il ne contamine que rarement sauf si les pro­
blèmes d'hygiène sont importants.
5.4 Évaluer les facteurs de développement de contamination
Ce point est important car il définit le comportement du produit hors le site de
production.
5.4.1 Par rapport à la matière première
Un développement important des psychrotrophes dans le lait (âge avancé, froid
entre 6 °C et 9 °C, lait peu chargé en ferment lactique...) entraîne l'apparition d'un
stock de lipases et de protéases thermorésistantes important. Le produit issu de ce
lait peu devenir rance ou être amer alors que toutes les conditions microbiologiques
voulues sont atteintes. La charge en sporulés doit être connue car son niveau de
population ou la température de stockage du produit induisent un développement de
ces germes. Si le lait doit être travaillé en cru (absence de traitement thermique)
celui-ci doit être exempt de pathogènes...
5.4.2 Par rapport au process
Le process et/ou la technologie doit être raisonné pour éviter la prolifération d'un
agent de contamination soit par voie biologique (occupation du milieu, acidification 22 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
rapide, traitement thermique, hygiène maîtrisée...) soit par le process proprement dit
(matériel adapté à la technologie).
5.4.3 Par rapport au produit
La composition physicochimique et bactériologique permet de prévoir des moyens
de contrôles pour repérer et identifier les causes de dégradations. Globalement, plus le
produit est fragile (a élevée, taux de sel faible, pH élevé, population microbienne w
apportée et revivifiable faible...), plus les points de contrôle sur toute la chaîne seront
importants, plus le process et la technologie seront complexes. La fragilité du produit se
caractérise par son aptitude à développer un germe ou un groupe de germes pathogènes
ou non au cours de temps. C'est la combinaison induite ou voulue entre la physicochi­
mie du milieu et le niveau de population de germes sélectionnés qui assureront à la den­
rée une confiance sanitaire et un bon maintien organoleptique au cours de sa DLUO. Un
dépassement de la DLUO et/ou une chaîne du froid fluctuante aura peu d'incidence sur
le produit si celui-ci allie composition et bactériologie adaptées.
5.4.4 Par rapport au circuit de distribution
Deux paramètres essentiels sont à connaître : les conditions de stockage de la den­
rée et le circuit de distribution. Ces données permettront de repérer et d'identifier
d'autres facteurs.
6. Exemple sur fromage frais
6.1 Description produit
- lait concentré pasteurisé emprésuré ;
- pas de flore sélectionnée apportée ;
- pH = 6,60 ;
- matière sèche : 30 % ;
- faiblement salé (< 1 %).
6.2 Détermination des risques
Produit fragile par sa composition :
- lait concentré : riche en facteurs de croissance ;
- lait emprésuré : traitement thermique modéré afin de pouvoir coaguler ;
- pH : élevé : aucune protection acide et activité enzymatique élevée ;
- EST faible : a élevée ; w
- teneur en sel négligeable : pression osmotique faible ;
- absence de flore sélectionnée : pas de protection lactique (occupation de
milieu).
Nous sommes en présence d'un produit extrêmement fragile. Sa DLUO ne devra
pas dépasser 30 jours et le plan de contrôle tout au long de la chaîne doit être sévère. La qualité 23
Une recontamination très légère peut atteindre un niveau très élevé en fin de cycle
de produit. La maîtrise de la qualité sera l'aptitude à limiter la croissance de la flore
apportée par le lait et à éviter toute recontamination (hygiène et manipulation
humaine).
63 Étude de schéma de fabrication
Pour tracer une technologie, il faut préciser la nature des micro-organismes sus­
ceptibles d'altérer le produit et les sources de contamination. Les facteurs de déve­
loppement des germes dans notre exemple sont tous réunis. Nous distinguons :
63.1 Agents d'altération
Nature Risques Moyens
Flore importante Protéolyse, Lait faiblement chargé en germes (tri par l'âge
Acidification, du lait et par la connaissance des zones de col­
Exsudation lecte).
Pasteurisation + traitement thermique en cours
de process.
Vérification population produit.
Matières secondaires : faiblement chargée en
germes et/ou traitement thermique à appli­
quer.
Chaîne du froid : sévère (dans et hors l'entre­
prise).
Rancissement Type de micro-organismes dans le lait, charge Activité
enzymatique Protéolyse en psychrotropes faibles (tri, âge du lait, tem­
pérature stockage).
Thermorésistants Gonflement Tri du lait sur la charge en Clostridium tyro-
(Sporulés) butyricum et des matières secondaires sur ce
critère.
Utilisation de la bactofugation.
Stockage du produit en cours d'élaboration
limité voire inexistant.
Chaîne du froid : sévère (dans et hors entre­
prise).
Retour produit Traitement thermique du produit avant embal-Levures et
Goût de moisi lage. moisissures
Emballage sous enceinte contrôlée. e stérile et operculage contrôlé. 24 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
63 2 Agents de contamination
Moyens Nature Risques
Entérobactéries Protéolyse Traitement thermique.
Mauvais goût Recontamination par le process ou l'eau.
Hors critères Contrôle du nettoyage et de la désinfection.
légaux Nettoyage avant le départ du process et en
cours du process. Si le risque est important,
augmenter les fréquences de nettoyage et de
désinfection en cours de process.
Respecter la marche en avant.
Limiter le contact du produit avec tous les
agents extérieurs (air, eau, personnel...).
Gonflement Contrôle de l'hygiène. Coliformes
Mauvais goût Matériel adapté (absence de zones non acces-
hors normes sibles aux produits de nettoyage...).
Sensibilisation du personnel sur l'hygiène.
633 Agents pathogènes
Nature Risques Moyens
Tous définis sur ce Sanitaires Choix des matières (tri).
type de produit Contact produit-personnel : inexistant.
Traitements thermiques bien appliqués sur la
matière première et au cours du process pour
les adjuvants (sel...).
Aucune tolérance admissible. Chapitre
3
LES ANALYSES BACTERIOLOGIQUES
RÉALISÉES DANS LE CADRE
DES SYSTÈMES AUTOCONTRÔLES
EN AGROALIMENTAIRE
Éric Dromigny
Il existe à l'heure actuelle deux sortes d'autocontrôlés en agroalimentaire condui­
sant à la réalisation d'analyses bactériologiques :
-L a première sorte correspond à l'autocontrôlé bactériologique des denrées ali­
mentaires d'origine animale, comprenant des analyses bactériologiques des ali­
ments, ou « analyses de routine », telles qu'elles doivent être réalisées dans le
cadre de l'arrêté ministériel du 21 décembre 1979, fixant les critères microbio­
logiques de certaines denrées alimentaires.
Ce type d'autocontrôlé (ou contrôle réalisé par le producteur) est fondé sur la
vérification de la conformité de l'aliment à des critères microbiologiques, détermi­
née par voie d'arrêtés ministériels et interprétés dans le cadre de plans d'interpréta­
tion.
-L a deuxième sorte correspond à l'autocontrôlé hygiénique et de conformité
devant être réalisé dans les entreprises agroalimentaires, dans le cadre général
de la directive CEE concernant l'hygiène des denrées animales ou d'origine ani­
male.
À côté de dispositions concernant les bonnes pratiques de fabrication et d'hy­
giène, les textes réglementaires français pris pour transposition de cette directive
imposent aux professionnels d'avoir recours à certaines analyses bactériologiques,
notamment pour vérifier la conformité de la fabrication aux règles d'hygiène. 26 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
1. Bases réglementaires des autocontrôles
1.1 L'autocontrôlé bactériologique des denrées alimentaires
d'origine animale
Deux arrêtés ministériels principaux définissent les conditions de l'autocontrôlé
bactériologique des denrées alimentaires d'origine animale :
- l'arrêté ministériel du 21 décembre 1979 ;
- l'arrêtél du 30 mars 94.
/./. / L'arrêté ministériel du 21 décembre 1979
Son titre est : Critères microbiologiques auxquels doivent satisfaire certaines den­
rées animales ou d'origine animale.
erDans l'article 1 de cet arrêté ministériel, il est précisé que :
- Pour être reconnues propres à la consommation, les denrées animales ou d'ori­
gine animale, ci-après énumérées, doivent satisfaire aux critères microbiolo­
giques fixés au présent arrêté et vérifiés selon les dispositions décrites en
annexe.
En outre, elles doivent être exemptes de micro-organismes ou toxines dangereux
pour la santé publique.
Ces denrées animales ou d'origine animale sont les suivantes (pour ne citer que
les principales) :
- Viandes de boucherie ;
-Viandes hachées à l'avance, viandes cuites, produits de charcuterie, quenelles,
plats cuisinés à l'avance, potages déshydratés ;
- Viandes de volaille ;
- Produits de la pêche ;
- Ovoproduits, pâtisseries, crèmes pâtissières ;
-Laits fermentes (yaourts, kefir) laits gélifiés, fromages frais pasteurisés, crèmes
fraîches pasteurisées, glaces et crèmes glacées, caséines et caséinates ;
- Conserves à base de denrées animales ou d'origine animale ;
- Semi-conserves à base de denrées animales ou d'origine animale ;
- Graisses animales.
Pour ces denrées animales ou d'origine animale, le producteur devra donc vérifier
la conformité de son produit aux critères énoncés dans l'annexe de cet arrêté minis­
tériel. Pour cela, les méthodes utilisées seront obligatoirement celles qui figurent
aussi dans cette annexe.
De plus, les résultats devront être interprétés grâce à un plan d'interprétation,
figurant aussi en annexe. La qualité 27
1.12 L'arrêté ministériel du 30 mars 94
Il est relatif aux critères microbiologiques auxquels doivent satisfaire le lait et les
produits laitiers.
Il est construit à la manière de l'arrêté ministériel du 21 décembre 1979, mais les
critères seront différents sur certains points car ils seront adaptés aux produits laitiers.
1.2 L'autocontrôlé hygiénique et de conformité
Les bases de cet autocontrôle ont été jetées par la directive CEE 93/43, dite la
directive hygiène, car son champ d'application est la mise en place de mesures d'hy­
giène pour les denrées animales ou d'origine animale, pour assurer la sécurité de ces
denrées.
À côté de ces mesures, ce texte met en place un système d'autocontrôlé fondé sur
l'analyse des risques et des points critiques pour leur maîtrise (ARPCM) et sur la
mise en place de procédures de sécurité.
Nous donnerons ici les éléments mis en place par la directive hygiène accompa­
gnés d'un bref commentaire.
12.1 Extrait de la directive hygiène
Les entreprises du secteur alimentaire identifient tout aspect de leurs activités
qui est déterminant pour la sécurité des aliments et elles veillent à ce que des procé­
dures de sécurité appropriées soient établies, mises en œuvre, respectées et mises à
jour en se fondant sur les principes suivants qui ont été utilisés pour développer le
système HACCP (analyse des risques, points critiques, pour leur maîtrise) :
- analyser les risques alimentaires potentiels d'une opération menée dans le cadre
des activités d'une entreprise du secteur alimentaire ;
- mettre en évidence les niveaux et moments (les « points ») de l'opération où des
risques peuvent se présenter ;
- établir quels points parmi ceux qui ont été mis évidence sont déterminants pour
la sécurité alimentaire (les « points critiques ») ;
- définir et mettre en œuvre des procédures de vérification et de suivi efficaces au
niveau de ces points critiques ;
et
-revoir périodiquement, et à chaque modification de l'opération menée dans le
cadre de l'entreprise secteur alimentaire, l'analyse des risques alimentaires, les
points de contrôle critiques, ainsi que les procédures de vérification et de suivi.
122 Commentaires des dispositions de la directive hygiène
Ces dispositions ont été prises dans le cadre de la CE, le législateur considérant
que la libre circulation des denrées alimentaires est une condition préalable essen­
tielle de l'achèvement du marché intérieur. 28 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Elles font référence au système « HACCP » mais sans le rendre obligatoire : on
s'est seulement inspiré des principes du système « HACCP » pour établir les diffé­
rentes étapes de l'autocontrôlé
La nature des risques analysés est sanitaire car ce principe implique la confiance
dans le niveau de sécurité des denrées alimentaires destinées à la consommation
humaine mises en libre circulation, et en particulier dans leur niveau d'hygiène, à
tous les stades de la préparation, de la transformation, de la fabrication, du condi­
tionnement, du stockage, du transport, de la distribution, de la manutention et de la
vente ou mise à disposition au consommateur.
Les risques sanitaires sont une préoccupation majeure, et il importe d'assurer la
sécurité et la salubrité des denrées animales ou d'origine animale.
2. L'autocontrôlé bactériologique des denrées alimentaires
d'origine animale : réalisation
Nous ne séparerons pas ici les éléments relatifs à l'arrêté ministériel du
21 décembre 1979 de ceux relatifs à l'arrêté ministériel du 30 mars 94, sauf pour
détailler les éléments les plus spécifiques concernant les produits laitiers.
Les éléments que nous présentons ici sont volontairement simplifiés pour faire
ressortir les éléments principaux.
2.1 Principe
2.1.1 Recherche ou dénombrement de bactéries pathogènes
Les bactéries pathogènes (c'est-à-dire capables de provoquer une maladie chez le
consommateur des denrées animales ou d'origine animale) recherchées ou dénom­
brées à l'heure actuelle sont essentiellement les Salmonella, les anaérobies sulfito-
réduetcurs 46° C (pour Clostridium perfringens : bacilles Gram +s stricts,
commensaux de l'intestin, telluriqucs, réduisant les sulfites en sulfures. Ils existent
sous forme sporulée très résistante) et Staphylococcus aureus pour l'ensemble des
denrées animales ou d'origine animale. Dans le cas particulier des produits laitiers,
on recherchera aussi Listeria monocytogenes et on dénombrera les Streptocoques
P-hémolytiques
2.12 Dénombrement de bactéries tests d'hygiène générale
Les recherches de bactéries pathogènes étant insuffisantes pour dépister les fautes
d'hygiène, un certain nombre de tests indicateurs de l'hygiène générale de l'aliment
ont été mis en place. Ce sont :
-l e dénombrement de l'ensemble des micro-organismes aérobies cultivant à
30 °C (appelés souventy7ore totale) ;
- let de bactéries tests de contamination fécale dites Coli formes
fécaux. La qualité 29
En effet, une contamination fécale fera toujours soupçonner la présence de patho­
gènes, tels que Salmonella ou E. coli ou des virus intestinaux.
Ce sont des Entérobactéries fermentant le lactose avec production de gaz à 44° C.
E. coli leur est parfois préféré car plus spécifique de la microflore fécale. Pour les
produits de la mer, on dénombre aussi les Streptocoques fécaux (Entérocoques).
Les Streptocoques fécaux sont des commensaux de l'intestin de recherche plus
difficile que les Coliformes mais qui résistent mieux dans le milieu extérieur que les
Coliformes, notamment en milieu salé. Les Coliformes, eux, sont des Entérobacté­
ries fermentant le lactose avec production de gaz à 37 °C. Ils sont significatifs de
contamination par l'environnement.
22 Méthodes
L'ensemble de ces méthodes est normalisé pour assurer la reproductibilité des
résultats.
22.1 Prélèvement
Il doit bien sûr être stérile. Le transport se fera au froid pour limiter les multipli­
cations.
5 échantillons par lot de denrées animales ou d'origine animale seront prélevés,
quelle que soit la taille du lot.
222 Préparation de l'aliment
Chaque échantillon subira des dilutions successives de façon à permettre le
dénombrement.
Pour un aliment liquide comme l'eau ou le lait, on procédera directement.
Pour un aliment solide comme la viande, on procédera au broyage de l'aliment
solide dans un liquide stérile pour le mettre en suspension.
223 Milieux utilisés
Les dénombrements effectués et la technique utilisée sont définis dans l'arrêté
ministériel.
Recherche ou dénombrement Milieux utilisés
Micro-organismes aérobies Gélose pour dénombrement ou PCA
(30 °C) (dénombrement direct)
Streptocoques fécaux Bouillon de Rothe et Litsky
Gélose de Slanetz (pour les surfaces)
Anaérobies sulfitoréducteurs à 46 °C Milieu Tryptone Sulfite Cvclosérine
Staphylococcus aurens Milieu de Baird-Parker
Salmonella Enrichissement sur bouillon au sélénite ou au tétra-
thionate. Isolement sur gélose au vert brillant et
rouge de phénol et une autre gélose éventuellement. 30 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Nous ne donnerons que quelques exemples de milieux dans le tableau précédant,
en rappelant au préalable que ces milieux sont pour la plupart sélectifs et permettent
d'orienter l'identification des bactéries recherchées.
23 Résultats et interprétation
Les résultats sont interprétés en fonction de critères et selon des plans d'interpré­
tation. Nous ne présentons ici que les critères les plus importants.
23.1 Critères
AM 21 décembre 1979 Micro- Coliformes Coliformes S.aureus Anaérobies Salmonelle
organismes fécaux sulfito- dam 25 g 30 "C
aérobies réducteurs
30 °C 46 T
'g /g /g 'g 'g
2 Carcasses ou coupes de demi- 500(3) Absence
gros, réfrigérées ou congelées ( 1 )
Pièces conditionnées sous vide ou 50000 100 2 Absence -
non. réfrigérées ou congelées ( 1 ) (31
Portions unitaires conditionnées 300 100 10 Absence
réfrigérées ou congelées et
portions unitaires du commerce
de détail réfrigérées ou congelées (2)"
( 1 ) Le prélèvement est effectué en profondeur, après cautérisation de la surface.
(2) Let concerne profondeur plus surface sans cautérisation.
(3) Seules les tolérances de caractère analytique sont acceptées (plan à deux classes).
Viandes hachées à l'avance ou 500000 50 £.co/i 100n = 5 I0n = 5 Absence
à la demande (AM 28/9/1989) (M = 30liq) C= l C = l
Plats cuisinés à 1 avance. 300000 1000 10 100 30 Absence
escargots préparés, pièces de (2)
viandes cuites tranchées ou non
Produits de charcuterie crus,
hachés :
- » Soumis à dessiccation et 300 50 Absence 100
à consommer en l'état
Ar après cuisson - - 1000 1000 100 Absence
Produits de salaison crus salés 50 Absence "(3) 1000 500
" et/ou séchés, tranchés ou non
Produits de charcuterie cuits, 300000 1000 100 30 Absence 10
tranchés ou non quenelles (2)(3)
Jambon cuit entier 10000 10 Absence Absence Absence Absence
Potages déshydratés 300000 1000 10 100 30 Absence
( 1 ) Tolérance prévue en annexe comprise.
(2) Pour les pâtes farcies du type ravioli, cannelloni, lasagne, les quenelles et les plats cuisinés auxquels est incorporé du fromage, ce critère
doit être interprété.
(3) Pour les produits de charcuterie conditionnés sous pellicule plastique et sous vide, le critère relatif aux micro-organismes aérobies 30 °C
soit 300 000 par gramme ne s'applique qu'au stade de la fabrication (usine). La qualité 31
AM 21 décembre 1979 Micro­ Coliformes Coliformes 5.aureus Anaérobies Salmonelle
30 °C fécaux sulfito- dans 25g organismes
réducteurs aérobies
46 °C 30 "C
1% /g /g 'g *
Volailles entières réfrigérées, *Abs. dans
» » - •• • ' congelées ou surgelées *C = 1 25 g (musc, pect.)
Rôtis, escalopes et paupiettes 500000 1000 500 30 - Abs.dans 1 g
crus, panés ou non (1)
Rôtis cuits, entiers ou tranchés et 300000 10 100 10 Abs.dans -
paupiettes cuites ou précuites 25 g
Viande crue séparée 1000000 5000 100O 100 Abs.dans 1 g -
mécaniquement (U
Viande cuite séparée 300000 10 100 30 Abs. dans -
mécaniquement 25 g
Viande crue séparée Abs.dans
mécaniquement traitée par 25 g
u rayonnements ionisants (2) (3) 1 10000 50 10
(1) (2) (3) (Arrêté du 5 mars 1985, art. 2) « Seules les viandes crues séparées mécaniquement répondant aux critères miaobiologiques les
rendant propres à la consommation , à l'exception de ceux visant les salmonelles, pourront être traitées par rayonnement ionisant conformé­
ment aux dispositions réglementaires en vigueur. »
Pour les produits laitiers, ces critères présentent des différences :
Teneur en Arrêté Ikteria Sahnonella S. aureus (7) Coliformes Strepto­ Teneur en
ministériel germes a monocyto- spp. (6) 30 "C (7) coques germes à
30 mars 1994 gènes 0-hémolytiques 21 "C(7) 30 °C
(6) (8)
dans 25 g dans 25 g /ml /ml dans 0,1 ml /ml /ml
Lait cru de Absence m = 100 m =100 Absence <50000
vache dest. à n = 5C = 0 M = 500 M=1000 n = 5C = 0 (3)
cons. en l'état n=5C= 2 n=2C= 2
Lait pasteurisé Absence Absence m = 0 m =
n=SC= 0 n=5C=0 M = 5 50000
n=5C= l M = 10m
n=5
C = 1 (4)
Lait stérilisé < 10 pour
0,1ml
E. coli
Fromages Absence Absence
à pâte dure dans 1 g n=5C= 0
au lait traité n=5C= 0
thermiquement 32 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Arrêté Listeria Salmonella S. aurais (7) Conformes Strepto­ Teneur en Teneur en
ministériel monocvlo- spp. (6) 30 "C(7) coques germes à germes à
30 mars 1994 geirn (5 hémolvtiimes 2PCI7I 30 °C
16) (8)
dans 25 g dans 25 g /ml /ml dans 0.1 ml /ml /ml
_ Fromages Absence Absence m=IOO m=IOO m=IOO0O
à pâte molle n=5C= 0 n=5C= 0 M=IO00 M = I000 M = l0m
au lait traité n = 5C = 2 n = 5 C = 2 n = 5
thermique ment C = 2
Pourdre de lait Absence m =10 m = 0
n=10C = 0 M= 100 M=I 0
n=5C= 2 n=5C= 2
- _ _ -Produits Absence Absence m = 0
liquides à base dans 1 g n=5C= 0 M = 5
de laits traités n=5C= 0 n=5C= 2
thenniquement
et fermentes
En particulier, ces critères comprennent Listeria monocytogenes, qui comme pour
les Salmonelles, s'exprime par : absence dans 25 g ou ml de produit.
232 Plans d'interprétation
Les plans d'interprétation sont au nombre de deux : le plan d'interprétation à deux
classes est destiné aux critères Salmonelles et Listeria monocytogenes. Cela veut
dire que si un seul échantillon sur 5 contient des Salmonelles (ou Listeria monocyto­
genes pour les produits laitiers), l'ensemble du lot n'est pas satisfaisant.
ABSENCE DE PRÉSENCE DE
SALMONELLES DANS 25 g SALMONELLES DANS 25 g
ou Listeria monocytogenes ou Listeria monocytogenes
LOT SATISFAISANT LOT NON SATISFAISANT
PLAN D'INTERPRÉTATION À DEUX CLASSES
Le plan d'interprétation à trois classes comprend une classe intermédiaire (lot
acceptable) si deux échantillons au plus donnent des résultats supérieurs à 3 fois le
critère mais inférieur à 10 fois le critère.
On dit que C = 2 (m étant la valeur du critère présentée dans le tableau précé­
dent). La qualité 33
3 m 10m = M 1000m = S m
lou2 5 échantillons 1 ou 2 ou 3 ou 4 ou 5
échantillons échantillons
ACCEPTABLE
SATIS­ 3 ou 4 ou 5 échantillons NON SATISFAISANT CORROMPU
FAISANT OU
TOXIQUE
Une quatrième classe (lot corrompu ou toxique) correspond à un dénombrement
supérieur ou égal à 1 000 fois le critère (1 000 m).
3. Autocontrôle hygiénique et de conformité
Plusieurs arrêtés ministériels ont été pris pour transposition de cette directive, ou
ont intégré l'analyse des risques et des points critiques pour leur maîtrise (ARPCM)
sous une forme plus ou moins développée.
L'arrêté ministériel qui l'intègre de la façon la plus complète est l'arrêté ministé­
riel du 9 mars 1995 relatif à la remise directe des denrées animales ou d'origine ani­
male au consommateur.
3.1 L'arrêté ministériel du 9 mai 1995, chapitre VII, article 17
Le texte de cet article est reporté ici, avec des commentaires, de façon à préciser
les principales étapes de cette démarche.
Contrôles et vérifications, art. 17. : COMMENTAIRES
Les responsables des établissements men­ 1- Principe
tionnés à l'article 1 doivent procéder, cha­
C'est un système d'autocontrôlés
cun en ce qui le concerne, à des contrôles
avec vérifications de la conformité
réguliers pour vérifier la conformité des
aux dispositions réglementaires
aliments aux dispositions du présent arrêté
concernant :
et lorsqu'ils existent, aux critères micro­
- le produit alimentaire ;
biologiques réglementaires auxquels ils
- son transport et son stockage ; doivent satisfaire.
- les bonnes pratiques d'hygiène et
Ces contrôles doivent notamment s'assurer notamment le nettoyage et la désin­
de l'état des produits à réception et por­ fection ;
ter sur les conditions de conservation,
- et les critères microbiologiques
ainsi que sur les méthodes de nettoyage et
réglementaires.
de désinfection. 34 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Pour établir la nature et la périodicité de 2- Mode opératoire
ces contrôles, ils doivent :
Sur la base du système ARPCM
• identifier tout aspect de leurs activités (HACCP) :
qui est déterminant pour la sécurité des
1- identification des éléments et
produits mentionnés à l'article I
facteurs de la sécurité du produit
• et veiller à ce que des procédures de
2- élaboration de procédures de
sécurité appropriées soient établies, mises
sécurité
en œuvre, respectées et mises à jour
Le tout est inspiré des principes du
• en se fondant sur les principes utilisés
système « HACCP »
pour développer le système d'analyse des
a- pour nous, il s'agit essentielle­risques et des points critiques pour leur
ment du risque sanitaire lié à la maîtrise, dit système « HACCP », en par­
production des denrées animales ticulier :
ou d'origine animale
- analyser et évaluer les risques alimen­
P- = voir y- <-'ar c'est surtout la taires potentiels aux différentes étapes du
sécurité qui est visée. processus, de mise en vente et, s'il y a
lieu, d'élaboration ; y- points critiques = sécurité de
l'aliment = absence réelle de dan­- mettre en évidence les points des
ger + conditions et organisation étapes où des risques alimentaires peu­
propres à créer un tel état vent se présenter ;
- identifier parmi les points qui ont été 5- véritables options de maîtrise
mis en évidence ceux qui sont détermi­ (= solutions aux risques identifiés
nants pour la sécurité alimentaire, + vérifications de l'efficacité)
appelés « points critiques » ; e- cette démarche n'est pas faite
- définir et mettre en œuvre des moyens une fois pour toutes, mais doit être
de maîtriser ces points et des procé­ périodiquement reprise.
dures de suivi efficaces ;
- revoir périodiquement, et notamment
en cas de modification des opérations, les
procédures établies ci-dessus.
11 s'agit bien d'un système obligatoire, pour lequel des preuves doivent être
conservées (obligation de moyens).
Comme nous venons de le voir, le législateur impose un système d'autocontrôlé
fondé sur une démarche en cascade : il faut commencer par deux démarches préa­
lables, fondées elles-mêmes sur la démarche relative au système « HACCP » :
• identifier tout aspect des activités qui est déterminant pour la sécurité des
produits
• veiller à ce que des procédures de sécurité appropriées soient établies, mises
en œuvre, respectées et mises à jour.
Ces deux démarches préalables doivent permettre de définir la nature et la pério­
dicité des contrôles réguliers de conformité que le professionnel doit mettre en
place, ce qui peut être résumé ainsi : La qualité 35
• En se fondant sur les principes utilisées pour développer
le système d'analyse des risques et des points critiques
pour leur maîtrise dit système « HACCP », en particulier :
-Analyser et évaluer les risques - Définir et mettre en œuvre des moyens
alimentaires potentiels aux différentes de maîtriser ces points et des procédures
étapes du processus, de mise en vente de suivi efficaces ;
et, s'il y a lieu, d'élaboration ;
- Mettre en évidence les points - Revoir périodiquement, et notamment
des étapes où des risques alimentaires en cas de modification des opérations,
peuvent se présenter ; les procédures établies ci-dessus.
- Identifier parmi les points qui ont été
mis en évidence ceux qui sont
déterminants pour la sécurité
alimentaire, appelés « points critiques ».
• Identifier tout aspect de leurs • Veiller à ce que des procédures
activités qui est déterminant pour de sécurité appropriées soient
la sécurité des produits mentionnés établies, mises en œuvre,
à l'article 1 respectées et mises à jour
Nature Périodicité CONTRÔLES RÉGULIERS
pour vérifier
la conformité des aliments
Aux critères microbiologiques régle­Aux dispositions du présent arrêté.
mentaires auxquels ils doivent
satisfaire, lorsqu'ils existent.
= S'assurer de l'état des produits à réception et porter
sur les conditions de conservation, ainsi que sur les méthodes
de nettoyage et de désinfection. 36 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
3.2 Éléments d'application de l'arrêté ministériel du 9 mars 1995
Pour appliquer ces éléments, il sera nécessaire au producteur d'identifier les élé­
ments essentiels des risques sanitaires liés à sa production, en particulier les risques
de:
-Contamination des denrées animales ou d'origine animale par des germes
pathogènes, comme par exemple les salmonellcs ou Listeria monocytogenes.
On s'intéressera principalement aux matières premières mais aussi aux contami­
nations par les manipulateurs ou l'environnement des denrées animales ou d'origine
animale.
- Multiplication des microflores pathogènes.
C'est essentiellement les paramètres de cette multiplication que l'on suivra, et
notamment les couples temps-température.
On repérera surtout les maintiens prolongés ou répétés à température tiède.
Les autres paramètres (pH, a ...) seront aussi relevés. w
- Survie des microflores pathogènes.
Tout réside ici dans l'efficacité des barèmes appliqués (couple temps-température
pour le chauffage, dose d'irradiation pour les traitements ionisants).
Il faudra donc en faire des relevés systématiques.
Conclusion
Le professionnel se doit donc de mettre en place deux systèmes d'autocontrôlé.
Le premier correspond à une obligation d'effectuer des analyses microbiologiques
des aliments. Le deuxième est plus large et repose surtout sur une identification des
ponts critiques de sa production.
L'ensemble des ces autocontrôles permet d'assurer avec une quasi-certitude la
salubrité des produits. Chapitre
4
SECURITE ALIMENTAIRE
ET HACCP
Jérôme Bariller
La qualité se définit généralement comme « l'ensemble des caractéristiques d'une
entité qui lui confèrent l'aptitude à satisfaire des besoins exprimés ou implicites »
(norme Iso 8402 1995).
Pour un produit alimentaire, elle peut se décrire par la règle des 4S :
• Satisfaction
Le produit alimentaire doit satisfaire le consommateur au niveau des sens : aspect,
goût, odeur... ; du prix ; de sa régularité, etc.
• Service
Dans ce critère, on pense à la praticité d'utilisation du produit, à son type de
conditionnement et à son mode de distribution.
• Santé
Devenu très important dans notre société et soutenu par d'importantes campagnes
médiatiques, ce critère se traduit par le besoin d'une nourriture plus nature et appa­
remment plus saine :
- produits biologiques, sans conservateur, sans pesticide ;
-s plus riches : produits diététiques, produits enrichis en vitamines et en
minéraux, etc.
• Sécurité
La sécurité alimentaire se définit comme étant la maîtrise de la santé et de la sécu­
rité du consommateur par :
- l'absence de contaminants naturels ou exogènes ; 38 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
- l'absence de pathogènes ;
-e d'additifs à risque toxique.
Si les deux premiers critères et une partie du troisième sont explicites c'est-à-dire
demandés ouvertement par le consommateur, ce sont bien souvent des arguments de
vente pour les industriels de l'agroalimentaire. Le quatrième portant sur la sécurité et
une partie du troisième attrait à la santé (règle d'étiquetage et d'information du
consommateur) est implicite : nous ne nous posons même pas la question, lors de
l'achat d'une denrée alimentaire, si celle-ci va nous rendre malade.
De ce fait, le critère « sécurité du consommateur » est placé sous le couvert de la
loi pour contraindre les industriels au respect de la santé publique.
Comment garantir la sécurité du consommateur ?
Jusqu'à une dizaine d'année environ, nous étions à l'ère du contrôle qualité avec
ses excès : nous fabriquions et contrôlions uniquement la conformité du produit fini
à des critères internes et réglementaires ; par exemple laé des produits à
l'arrêté du 21 décembre 1979 relatif aux critères microbiologiques auxquels doivent
satisfaire les denrées animales ou d'origine animale. Si les résultats étaient corrects
la marchandise pouvait être vendue. Les limites de ce système sont nombreuses :
- pour des produits à courte durée de vie, les résultats des contrôles pouvaient inter­
venir une fois les produits distribués avec les conséquences que cela pouvait avoir ;
- la faible représentativité des résultats des contrôles au regard de la production
entière ;
-l e fonctionnement « stressé » de l'entreprise dans la crainte d'un contrôle
positif;
- les pertes importantes pour l'entreprise.
Il a fallu trouver une solution.
Au lieu de contrôler uniquement les produits finis, essayons de maîtriser chacune
des étapes de fabrication ainsi que l'environnement de production. Dans ce cas et à
fortiori le produit fini sera conforme. C'est l'apparition de l'assurance qualité avec-
utilisation d'outils de maîtrise préventive de la sécurité alimentaire : le HACCP
(Hazard Analysis Critical Control Point) que nous présenterons ci-après.
1. Le contexte réglementaire de la sécurité alimentaire
En terme de sécurité alimentaire, la réglementation est principalement horizontale
avec quelques spécifications par filière.
Le droit alimentaire par la loi de 1905 sur les fraudes et falsifications en matière
de produits ou de services dite « loi d'hygiène alimentaire » fait état de loyauté des
transactions avec apparition des termes « sain, loyal et marchand ».
La loi du 21 juillet 1983 relative à la sécurité des consommateurs, dans son article
premier, dit : « Les produits et les services doivent, dans des conditions normales La qualité 39
d'utilisation ou dans d'autres conditions raisonnablement prévisibles par le profes­
sionnel, présenter la sécurité à laquelle on peut légitimement s'attendre et ne pas
porter atteinte à la santé des personnes »
De nombreux décrets, arrêtés, circulaires permettent l'application de ces lois.
Au niveau européen, deux directives principales déjà ou en cours d'adaptation
dans le droit français :
La directive cadre 89/397 relative au contrôle officiel des denrées alimentaires a
pour objet la protection de la santé des consommateurs et des intérêts économiques
des entreprises. Elle établit les règles générales concernant le contrôle officiel par les
autorités nationales de la conformité des denrées, de la conformité des matériaux et
objets destinés à entrer en contact avec les, des dispositions assurant la pro­
tection des consommateurs contre les risques sanitaires et les fraudes résultant d'un
étiquetage inexact.
La directive 93/43 sur l'hygiène des denrées alimentaires est très importante en
terme de sécurité alimentaire. Elle a pour fonction de protéger la santé du consom­
mateur en harmonisant les règles d'hygiène alimentaire qui doivent être respectées
pour : la production, la transformation, la fabrication, le conditionnement, le stoc­
kage, le transport, la distribution, la manutention et la vente au consommateur final,
des denrées alimentaires. Trois points principaux :
« Les entreprises du secteur alimentaire doivent :
- identifier tous les aspects de leurs activités qui sont déterminants pour la sécu­
rité des aliments ;
- veiller à ce que les procédures de sécurité appropriées soient : établies, mises
en œuvre, respectées et mises à jour ;
- veiller sur les procédures de sécurité en se fondant sur les principes qui ont été
utilisés pour développer le système HACCP (analyse des risques, points cri­
tiques pour leur maîtrise) ».
« Les entreprises du secteur alimentaire doivent respecter les règles d'hygiène
spécifiées »
« Elaboration et utilisation de guides de bonnes pratiques en matière d'hygiène »
Cette directive est entrée en application le 14 décembre 1995. L'arrêté du 9 mai
1995 réglementant l'hygiène des aliments remis directement au consommateur est
une transposition directe de la directive 93/43 dans le droit français avec un champ
d'application plus restreint.
2. Le système HACCP
2.1 Historique
Il existe de nombreuses techniques, basées sur l'idée simple qu'il vaut mieux pré­
venir que guérir, et qui sont déjà utilisées dans l'industrie chimique, (Hazard and 40 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Operability Study ou HAZOP), nucléaire et aéronautique. C'est à partir d'elles
qu'est né aux Etats-Unis le système HACCP, à la fin des années 60, lorsque la finne
Pillsbury accepta de fabriquer des aliments pour les astronautes et voulut le faire en
s'entourant préventivement d'un maximum de précautions.
En 1971 : présentation du concept à la conférence nationale sur la sécurité ali­
mentaire aux USA
En 1975 : les experts de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) recomman­
dent le système HACCP
En 1980 : les experts de l'OMS et de l'ICMSF (Commission internationale pour
la définition des caractéristiques microbiologiques des aliments) décrivent les prin­
cipes et les définitions
En 1983 : l'OMS Europe accepte le système HACCP comme outil dans l'inspec­
tion des aliments
En 1984 : le National Research Council recommande le système HACCP
Enfin, en 1993 : Publication des principes d'HACCP par la commission du Codex
Alimentarius et élaboration de la Directive 93/43 CEE relative à l'hygiène des den­
rées alimentaires, dite « directive hygiène », qui recommande l'utilisation de
HACCP avec obligation d'identifier les risques pour la santé du consommateur au
cours de la vie du produit, et de les maîtriser.
2.2 Définition et objectif
HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) se traduit par « l'analyse des
dangers - maîtrise des points critiques ». C'est un outil de prévention de la sécurité
alimentaire.
HACCP décrit un système de maîtrise des étapes de la vie d'un produit (des
matières premières au produit fini et jusqu'à l'utilisation par le consommateur) pour
assurer la sécurité alimentaire.
HACCP est une approche systématique et rationnelle de la maîtrise des dangers
microbiologiques, physiques et chimiques dans les aliments.
HACCP est un système qui permet d'identifier le ou les dangers spécifiques, de
les évaluer et d'établir les mesures préventives ainsi que les actions de maîtrise.
23 . Vocabulaire
Comme tout système, HACCP a défini un vocabulaire. Voici quelques définitions :
Action corrective Procédure à suivre quand une déviation a lieu et que la
(corrective action) surveillance révèle que le CCP n'est pas maîtrisé.
Critère Paramètre ou exigence correspondant à une ou plusieurs
(criterion) caractéristiques, physiques, chimiques, microbiologiques
•< de l'opération ou du produit. La qualité 41
Danger Tout facteur biologique (micro-organismes, toxines,
(hazard) etc.), chimique (lubrifiant, additif, conservateur, etc.) ou
physique (corps étranger, insecte, cheveu, etc.) qui peut
entraîner un risque inacceptable pour la santé et la sécu­
rité du consommateur ou la qualité du produit.
Gravité (severity) Importance d'un danger.
Déviation (déviation) Non respect des limites critiques d'un CCP.
Critères ou paramètres qui doivent être respectées pour Limite critique
(critical limit) assurer que la maîtrise est effective.
Ensemble des techniques, des méthodes, des actions, qui Mesure préventive
(préventive action) devrait permettre d'éliminer le danger ou de réduire le
risque à un niveau acceptable.
Document qui décrit les procédures formalisées à suivre Plan HACCP
(HACCP plan) en accord avec les principes généraux du système
HACCP.
Point critique de maîtrise Tout point, lieu, personnel, opération ou protocole pour
(Critical Control Point - CCP) lequel la perte de la maîtrise peut entraîner un risque
inacceptable pour la qualité du produit. Il s'agit de tout
produit, étape ou opération pour lequel la maîtrise doit
être assurée et tout danger peut être éliminé, prévenu ou
réduit à un niveau acceptable.
Risque (risk) Estimation de la probabilité d'apparition d'un danger.
Surveillance Séquence planifiée d'observations ou de mesures conçue
(monitoring) pour obtenir des données précises dans le but de vérifier
le respect des limites critiques
Vérification Méthodes, procédures et essais complémentaires utilisés
(vérification) pour déterminer si le système HACCP est appliqué et qu'il
donne sur le plan de la sécurité, les résultats escomptés.
2.4 Principe
Le système HACCP comprend les sept principes généraux suivants :
1 Identification des dangers à tous les stades de la vie du produit, depuis la culture ou
l'élevage en passant par sa transformation éventuelle jusqu'à l'utilisation plausible
du produit par le consommateur.
Évaluation de la probabilité d'apparition des dangers et description des mesures pré­
ventives.
2 Identification des points critiques pour leur maîtrise ou Critical Control Point - CCP. 42 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
3 Établissement des limites critiques de maîtrise des CCP.
4 t et mise en place des procédures de surveillance des CCP.
5 Établissement et mise en place des actions correctives appropriées et immédiates
lorsque les résultats de la surveillance indiquent qu'une opération n'est pas maîtri­
sée pour un CCP et donc que les critères ne sont pas respectés.
6 Établissement d'un système d'enregistrement qui documente le plan HACCP.
7 t des procédures de vérification et de validation du système HACCP.
2.5 Les étapes de mise en place
La mise en place d'HACCP est définie dans un planning comprenant treize
étapes :
1. Réunir une équipe HACCP ;
2. Définir le champ de l'étude ;
3. Décrire le produit (fini et matière première) et identifier l'usage attendu ainsi
que les utilisateurs du produit ;
4. Élaborer un diagramme de fabrication ;
5. Vérifier sur place le diagramme de fabrication ;
6. Conduire une analyse de dangers : identification des dangers, appréciation du
risque et description des mesures préventives ;
7. Déterminer les points critiques pour la maîtrise ou CCP ;
8. Établir les limites critiques pour chaque CCP ;
9. Établir un système de surveillance de chaque CCP ;
10. Mettre en place des actions correctives ;
11. Établir un système d'enregistrement et de documentation ;
12. Vérifier et valider le fonctionnement du système HACCP ;
13. Révision du système HACCP.
Les étapes 1 à 5 sont des étapes préalables à la mise en place de HACCP.
2.5.7 Réunir une équipe HACCP
La mise en place d'HACCP nécessite une connaissance précise de l'outil de pro­
duction. C'est pourquoi, elle ne doit pas être réalisée pas un individu seul mais par
une équipe. De plus, cette équipe doit être pluridisciplinaire, collective et non hiérar­
chique. Elle comprend généralement :
- Le directeur de l'usine ou du site, pour coordonner les actions et être le garant
de la disposition des moyens financiers. Il n'assiste généralement pas à l'en­
semble de la démarche mais intervient lors de la prise de décisions et avant la
mise en application des diverses actions. La qualité 43
- Le responsable de production, pour préparer le diagramme de fabrication et vali­
der la mise en application des diverses décisions en fonction de la capacité de
production. Il est assisté, dans cette fonction, par les agents de maîtrise ainsi que
les opérateurs eux-mêmes dans la connaissance précise de l'outil de production.
-L e responsable de la maintenance et de l'entretien, pour connaître l'état de
l'équipement, le suivi minimum et les conséquences de son état de fonctionne­
ment sur la sécurité du produit.
- Le responsable qualité, pour l'intégration de la démarche dans l'esprit qualité de
l'entreprise. Il sera souvent l'animateur de lae HACCP.
- Le responsable du laboratoire de microbiologie et/ou de physicochimie, pour
apporter le maximum d'information relatif au produit fabriqué.
-Tout spécialiste d'un domaine particulier de compétence, pour éclaircir l'avan­
cée de l'étude : responsable achats, chef produit, service logistique, transport,
expert, etc.
Au sein de l'équipe, nous devons retrouver l'ensemble des compétences
suivantes :
- Connaître les principes d'HACCP.
- Savoir construire un diagramme de fabrication.
- Comprendre les types de dangers qui peuvent apparaître et les méthodes de pré­
vention possibles.
- Connaître les bonnes pratiques de fabrication.
- Savoir identifier les CCP.
- Savoir communiquer.
- Savoir auditer.
-Avoir les bases en statistique.
- Connaître les techniques de résolution de problèmes.
- Savoir former et informer.
La mise en place d'HACCP s'accompagne d'une formation des opérateurs et
d'autres personnes au système HACCP pouvant comprendre les points suivants :
- Qu'est-ce que HACCP ?
- Pourquoi doit-on mettre en place HACCP ?
- Qui est impliqué dans la mise en place du système ?
- Quels seront les changements dans la façon quotidienne de travailler ?
- L'importance des points critiques.
-e de la sécurité alimentaire.
- Compréhension des bonnes pratiques de fabrication et de l'assurance qualité.
Le travail en équipe permet de progresser plus rapidement et plus efficacement.
L'ensemble des décisions est défini et accepté par tous. Le succès de l'HACCP est le
succès de l'équipe. 44 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
2.52 Définir le champ de l'étude
Il est très important de borner l'application de l'étude pour éviter de « s'éparpiller »
lors de l'analyse des dangers. Le champ de l'étude est défini par rapport :
- au couple produit/processus de fabrication (un produit, une ligne de fabrication
dans un environnement donné) ;
- à la nature des dangers à considérer : physiques, chimiques et/ou microbiolo­
giques ;
- à l'application des exigences spécifiques : processus, traitement, conditionne­
ment, stockage, expédition, transport, livraison, distribution.
Ce champ de l'étude est déterminé en se rapportant aux dangers connus en
matière de sécurité alimentaire du type de produit fabriqué (ex fromage au lait cru :
le danger principal à étudier concerne la présence de Listeria monocytogenes). La
connaissance du ou des dangers inhérents à la santé du consommateur s'acquiert par
collectes d'informations : données épidémiologiques, cas existants, fragilité et sensi­
bilité du produit, données bibliographiques... Il est défini le plus généralement en
regard du produit posant le plus de difficulté en matière de qualité.
253 Décrire le produit alimentaire et son usage prévisible
Pour posséder un maximum d'information, le produit étudié doit être décrit de
manière très complète en commençant par les matières premières et les ingrédients.
On pensera :
- à la composition chimique ;
- à la préparation et aux traitements subis ;
- aux caractéristiques sanitaires ;
- à l'emballage et au conditionnement ;
- au stockage en tenant compte de la durée de stockage prévisible et attendue ;
- aux modalités normales et raisonnablement attendues d'utilisation ;
- aux instructions d'utilisation ;
-etc.
25.4 Réaliser un diagramme de fabrication
Cette étape suppose seulement de suivre le processus de fabrication depuis la ou
les matières premières au travers des différentes opérations jusqu'à l'utilisation plau­
sible du produit par le consommateur. Il suffit ensuite de présenter cela sous forme
de diagramme.
Il existe différentes façons de présenter le diagramme de fabrication ; optez pour
la façon la plus simple mais la plus complète tout en restant compréhensible par
tous. Il faut faire attention au diagramme de fabrication type issu de modèle ou de
guide de fabrication standardisé. Il correspond très rarement à la réalité. La qualité 45
Le diagramme de fabrication va apporter à l'équipe plusieurs informations :
-l a connaissance pleine et entière des différentes étapes de fabrication. Il faut
préciser les caractéristiques des opérations utiles pour la démarche : barèmes
temps-température, conditions particulières... ;
- le nombre total d'étapes spécifiques : le nombre d'opérations, le nombre de
stockage, le nombre de transport... permettant de focaliser sa réflexion sur ce
qui va être le sujet à risque (exemple : un nombre d'attente trop élevé) ;
- une réflexion sur l'utilité de certaines pratiques ou usages ;
- la liste des opérations où il peut y avoir une augmentation, une réduction ou une
stabilisation des contaminants microbiologiques, physiques et chimiques.
2.55 Vérifier un diagramme de fabrication
Le diagramme de fabrication va constituer la colonne vertébrale de l'analyse des
dangers - points critiques pour leur maîtrise. La vérification sur le terrain constitue
une contrepartie indispensable. La « visite » de l'usine permet de prendre en compte
des insuffisances et des lacunes du diagramme de fabrication réalisée en salle avec
l'équipe HACCP. Tout se passe comme prévu, mais... ! Cette vérification doit per­
mettre également :
- d'étudier les différents flux de circulation matière, matériels et personnels ;
- de visualiser « pratiquement » l'ensemble des étapes de fabrication pour chacun
des membres de l'équipe ;
- de se rendre compte de la réalité au quotidien : propreté, ordre, conception des
locaux, nettoyabilité des équipements...
Dès que besoin au cours de l'étude, il convient d'envisager le déplacement de
l'équipe sur le terrain.
25.6 Conduire une analyse de dangers
Trois parties importantes : (1) identification des dangers et des causes associées,
(2) évaluation du risque, (3) établissement des mesures préventives.
2.5.6.1 Identification des dangers et des causes associées
Selon les besoins de l'étude, l'analyse des dangers peut se faire sous deux
formes :
- Une analyse rapide étape par étape en listant les principales causes. Cette façon
de procéder a l'avantage de progresser très vite à la mise en place de l'HACCP
avec maîtrise des principaux dangers mais n'est pas suffisamment exhaustive.
-Un e analyse plus complète conduisant à identifier l'ensemble des causes des
dangers traités. Cette seconde façon, qui peut faire suite à la première, peut
revêtir la forme suivante :
- Existe t-il un danger de... à cette étape de fabrication ? pour répondre à cette
question analysons les causes : 46 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
- Qu'est-ce qui peut entraîner le danger de... à cette étape de fabrication ? Pour
ne rien omettre comme cause, la règle des 5M est efficace : Les dangers sont
associés généralement à 5 éléments : Matériel, Main-d'œuvre, Milieu,
Matière, Méthode.
Cette recherche des causes peut se faire en utilisant d'autres outils : le « brainstor-
ming », l'analyse fonctionnelle, l'AMDEC... Les causes peuvent ainsi être classées
en cause primaire, secondaire voire tertiaire.
Cette phase doit rester très pragmatique. L'erreur est de rentrer dans trop de
détails entraînant une lourdeur préjudiciable à la suite de l'application du système
HACCP.
2.5.6.2 Évaluation du risque
Une fois les causes recensées et les dangers identifiés, il convient de hiérarchiser
ces dangers permettant de prioriser ensuite certaines actions et de les approfondir ou
non : c'est l'analyse des risques. Cette hiérarchisation ne peut se faire que semi-
quantitativement et fait appel au ressentiment de l'équipe.
À chacune des étapes, on peut classer chaque danger uniquement en fonction des
avis : ce danger découlant d'une ou d'un ensemble de cause a un risque fort, moyen
ou faible (le risque étant la probabilité d'apparition du danger). On peut évaluer le
risque en tenant compte de 3 points : la fréquence d'apparition de la cause (F), la
gravité du danger associé à cette cause (G) et la probabilité de non-détection de la
survenue de la cause (P). Une note peut être attribuée à chaque point.
Pour répondre à cette question, des recherches et études complémentaires peuvent
être déclenchées.
2.5.6.3 Établissement des mesures préventives
Devant chaque danger identifié, il faut établir et mettre en place des mesures pré­
ventives, c'est-à-dire des actions visant soit à éliminer le danger soit à réduire le
risque en jouant sur la fréquence, la gravité ou la probabilité de non-détection des
causes. L'importance et l'ampleur de ces mesures préventives sont reliées au risque.
À la fin de cette étape nous arrivons à un tableau de la forme :
Nom de l'entreprise Ligne de fabrication : Produit : Date: Page:
ÉTAPE DANGERS CAUSES F Mesures préventives Études ou recherche
Primaires xG complémentaire
Secondaires xP
Tertiaires
déjà en place à envisager La qualité 47
2J5.7 Déterminer les CCP
Le but de l'identification des CCP est de définir pour ces points particulièrement
déterminants, en compléments des mesures préventives, des mesures de surveillance
particulières.
Les CCP sont spécifiques d'une opération, d'un procédé ou d'un produit.
Un CCP doit permettre la maîtrise d'un danger ; si tel n'est pas le cas, ce n'est pas
un CCP.
Un arbre de décision (à utiliser de façon judicieuse) peut aider dans l'identifica­
tion des CCP :
Q1. Existe-t-il un danger à cette étape de fabrication '
• i
ce n'est pas un CCP STOP* non oui
Q2. Des mesures préventives sont-elles prises pour Modifier l'étape, le procédé
le ou les dangers identifiés ? ou le produit
La maîtrise de cette étape est-elle
nécessaire pour la sécurité du produit ? oui non oui
ce n'est pas un CCP STOP* non
Q3. Cette étape élimine-t-elle ou réduit-elle l'arrivée
oui du ou des dangers à un niveau acceptable ?
04. La contamination par le ou les dangers identifiés peut-elle
intervenir ou augmenter jusqu'à un niveau inacceptable ?
ce n'est pas un CCP STOP* oui non
05. La ou les étapes suivantes peuvent-elles éliminer le ou les dangers
identifiés ou réduire leur réalisation à un niveau acceptable ?
Point critique
non pour la maîtrise
ce n'est pas un CCP STOP* oui
' Ce n'est pas un CCP. Passer à l'étape suivante. 48 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
25.8 Etablir les limites critiques, une surveillance
et des actions correctives
Dans la pratique, ces 3 étapes se trouvent en étroite corrélation :
- Les limites critiques fixent le niveau de maîtrise d'un CCP. Ce sont des critères
qui indiquent si une opération est maîtrisée pour un CCP particulier. Le plus
couramment, ces critères sont des valeurs accompagnées de tolérances. Par rap­
port aux dangers microbiologiques, les critères de maîtrise les plus fréquem­
ment utilisés comprennent la température, le temps, l'humidité, la viscosité, le
pH, la fréquence de nettoyage et désinfection, la concentration en produit désin­
fectant...
- Un plan de surveillance va définir les moyens, méthodes et les fréquences pour
évaluer et assurer le respect des limites critiques. Elle doit être simple et facile à
mettre en œuvre. Il existe deux types de surveillance :
- La surveillance en continu : c'est la plus efficace car elle permet d'agir en
temps réel. Ce type de surveillance doit être envisagé en priorité.
- La surveillance discontinue doit se faire par rapport à une fréquence définie.
Elle peut revêtir la forme d'une check-list des différents points de sur­
veillance.
- Les actions correctives doivent être définies et mises en place dès que la perte
ou l'absence de maîtrise d'un CCP est détectée c'est-à-dire dès que les tolérances
sont dépassées. Les actions correctives sont d'ampleur variable selon l'écart
constaté. On peut travailler en déviation mineure, intermédiaire et majeure afin de
réagir rapidement. Les actions correctives définissent le devenir du produit non-
conforme et doivent permettre le retour aux conditions normales de production.
Il faut définir des priorités d'action :
- l'action immédiate nécessite une correction ou une amélioration instantanée ;
-n différée avec planification de sa mise en œuvre.
Nom de l'entreprise : Ligne de fabrication : Produit : Date : Page
SURVEILLANCE
N° l'étape Limites Quoi Comment Fréquence Qui Actions
0 CCPn critiques correctives
25.9 Établir un système de documentation
L'ensemble des travaux HACCP doit rentrer dans un système documentaire per­
formant permettant une gestion facile, souple et compréhensible par tous.
Cette documentation comprend : La qualité 49
- l'étude elle même avec la phase de conception (étapes 1 à 10) et la phase de
vérification et révision (étapes 12 et 13) ;
-de s documents descriptifs : présentation générale du système, plan et manuel
sécurité...
- des documents opérationnels : règles et dispositions qui découlent du plan à
appliquer : procédures, instructions...
- des documents démonstratifs : les preuves de l'application : les enregistrements.
Cet ensemble documentaire nécessite d'être lui-même maîtrisé par des règles pra­
tiques de rédaction, d'approbation et visa, d'identification et codification, de diffu­
sion contrôlée, de mise à jour, de modification, de classement et d'archivage.
La documentation HACCP doit être une composante de la documentation qualité
existante dans l'entreprise.
25.10 Vérifier et valider le système HACCP
Il est impératif de prévoir une :
-Vérification que le système est efficient : c'est le respect pratique des consignes
établies. Cette vérification peut se faire par un audit d'application du système
HACCP, par l'examen des déviations...
-Vérification que le système est efficace : c'est la validation de l'étude. Cette
vérification peut prendre les formes suivantes :
- analyses des déviations et des actions correctives ;
-s renforcées de produits intermédiaires ou des produits finis ;
- tests approfondis au niveau des CCP ;
- essais de validation des valeurs fixées comme limites critiques (ex : barèmes
de pasteurisation) ;
- analyses approfondies des réclamations clients.
Les modalités de vérification doivent être formalisées (procédures, documents
d'enregistrement...).
25.11 Revue du système HACCP
L'objectif de la revue est de s'assurer que le système HACCP est toujours adapté.
Il faut prévoir une revue systématique à intervalle régulier et une revue à chaque
fois qu'une situation nouvelle apparaît par exemple :
- la non validation de l'efficacité du système en place ;
- une modification de matières premières ;
- unen des processus de production (conditions, équipements,...) ;
- une modification des conditions d'utilisation des consommateurs ;
- un changement de standards ;
- de nouvelles informations scientifiques ou épidémiologiques. 50 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Comme pour la vérification, les modalités de la revue doivent être formalisées
(procédures, documents d'enregistrement,...).
• Tableau de synthèse associé au diagramme de fabrication permettant de rassembler les
composantes de HACCP.
Surveillance
Dangers procédures/ Actions Vérification
chimique fréquence/ conect. pRK'édures
N° physique Mesures Limites personne personne Enregis­ personne
étape CCP biologique préventives critiques responsable responsable trement responsable
1. Oui ou 1.
2. Non
3.
etc.
3. HACCP - certification ISO et BPF
L'élaboration de guide de bonnes pratiques de fabrication (BPF) et leur applica­
tion sont demandées par la directive CEE 93/43 relative à l'hygiène des denrées ali­
mentaires. Les Bonnes pratiques hygiéniques de fabrication sont un ensemble de
règles d'hygiène concernant la conception des locaux, l'environnement de fabrica­
tion, le comportement du personnel, les flux de circulation... visant à produire dans
de meilleures conditions d'hygiène. Il est indispensable de les connaître et de les
transposer à son activité et de les respecter.
HACCP est un outil de sécurité alimentaire qui fait référence aux BPF dans les
mesures préventives.
La mise sous assurance-qualité d'une entreprise conformément aux normes de la
série Iso 9000 permet à l'entreprise de structurer et de formaliser son organisation
pour régulariser et maintenir un niveau de qualité préalablement définie. Dans cette
démarche, l'entreprise peut utiliser HACCP dans la maîtrise de ces procédés et de la
qualité de ses produits. HACCP et certification Iso sont deux démarches complé­
mentaires (voir tableau ci-après) et synergiques.
• Synthèse des relations entre Iso 9002 (version 1994) et HACCP
ISO 9002 HACCP
Responsabilité de la direction (§4.1) Déclaration de politique générale sur la maî­
-Objectifs qualité trise de la sécurité alimentaire
- Action de prévention des non-conformités
- Vérification de la mise en œuvre La qualité 51
ISO 9002 HACCP
Achats (§4.6) - Description du produit
- Évaluation des sous-contractants (§4.6.2) - Analyse des dangers, mesures préventives
- Données d'achat (§4.6.3) - Détermination des CCP
- Vérification du produit acheté -Limites critiques, surveillance, actions
correctives
- Système documentaire et vérification
Maîtrise des processus (§4.9) - Diagramme de fabrication
- Identifier less - Identification des CCP
- Équipements et environnement adéquats - Limites critiques, surveillance, actions
pour la production correctives
- Maîtrise des paramètres des processus et - Système documentaire
caractéristiques produits
-Manutention, stockage, conditionnement,
préservation et livraison (§4.15)
Contrôles et essais (§4.10) -CC P
- Maîtrise des équipements de contrôle, de - Validation
mesure et d'essai (§4.11) - Surveillance
- État des contrôles et des essais (§4.13) - Système documentaire et vérification
Maîtrise du produit non conforme (§4.13) - Surveillance, actions correctives
Actions correctives et préventives (§4.14) - Vérification
Maîtrise des enregistrements relatifs à la - Système documentaire
qualité (§4.16)
Audits qualité internes (§4.17) - Vérification
Formation (§4.18) - Mesures préventives
- Action correctives
4. Conclusions
Les industriels du secteur alimentaire n'ont pas attendu l'arrivée de l'HACCP
pour maîtriser leur outil de production. HACCP leur permet de formaliser l'en­
semble des actions entreprises, d'avoir une démarche logique, cohérente et efficace
et surtout de raisonner en préventif.
HACCP est un outil de maîtrise préventive de la sécurité alimentaire. Comme tout
outil, il a un mode d'emploi (qui est présenté ci-dessus) et n'est pas non-plus la
panacée universelle. La façon d'utiliser l'outil aura des conséquences sur le résultat
et surtout sur l'obtention des objectifs préalablement définis en terme de sécurité ali­
mentaire. 52 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Beaucoup d'industriels utilisent la force de cet outil pour, outre garantir la sécu­
rité du consommateur, progresser en matière de qualité des produits. Ils lui recon­
naissent deux principaux avantages : c'est un outil de terrain qui développe l'esprit
d'équipe et qui renforce la connaissance de l'outil de production.
Une limite de HACCP dans son utilisation est qu'il peut devenir rapidement un
outil inefficace voire mauvais pour l'entreprise s'il est mal utilisé : surabondance de
CCP conduisant à une démotivation de l'équipe, utilisation pas assez pragmatique,
multiplication des causes...
Une limite dans les principes du système HACCP se trouve dans l'analyse quanti­
tative des risques qui n'en ait qu'à ces balbutiements et qui nécessite un travail
important de recherche et d'étude. S'agissant des dangers microbiologiques, les
outils disponibles s'appellent microbiologie prévisionnelle, challenge-tests et ana­
lyse d'exposition du produit à certaines conditions...
Pour conclure, dans l'application de l'HACCP, il faut avant tout garder son esprit
« du bon sens » et utiliser la démarche d'une manière cartésienne (basée sur la rai­
son) plutôt que platonicienne (basée sur les définitions de terme).
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LES MICRO-ORGANISMES Manipulation
1
LES SONDES NUCLÉIQUES :
APPLICATIONS EN MICROBIOLOGIE
ALIMENTAIRE
Angéli Kodjo
1. Introduction
L'essor de la technologie de l'ADN au cours des dernières décennies a permis la
naissance et la mise au point d'une technique d'analyse biologique de conception
tout à fait nouvelle : l'hybridation moléculaire. Cette technique permet d'identifier
de manière spécifique des fragments de matériel génétique (séquence d'acide ribo-
ou désoxyribonucléique) appartenant à des cellules, des virus, des bactéries ou des
parasites.
Après quelques notions de rappel et de définition, cet article se fixe pour objectif
d'exposer les principales méthodes d'utilisation des sondes à l'aide de quelques
exemples pratiques.
1.1 Rappel
Pour bien comprendre la notion de sonde nucléique, il convient de rappeler que
chaque espèce vivante est caractérisée par un ensemble génétique dont l'unité fonc­
tionnelle, le gène, désormais considéré comme une séquence de nucléotides est porté
soit par un acide désoxyribonucléique ou ADN, soit par un acide ribonucléique ou
ARN. La séquence des nucléotides au sein de l'ADN ou de l'ARN est caractéris­
tique de chaque espèce et peut par essence constituer une clef que l'on peut utiliser
pour son identification. L'utilisation des sondes nucléiques est justement l'une des
possibilités offertes par les techniques de génie génétique.
Exception faite du génome des Parvoviridae et de celui du bactériophage M 13,
l'ADN, est toujours une longue molécule constituée de 2 chaînes antiparallèles, 62 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
complémentaires et enroulées en double hélice. Chaque chaîne est un polymère dont
le maillon élémentaire, le nucléotide, est composé d'un sucre qui est le désoxyribose
(d), d'une des 4 bases suivantes : adénine (A), thymine (T), guanine (G) et cytosine
(C) et d'un groupement phosphate. Ces nucléotides sont sous forme native triphos-
phorylés (TP), on reconnaît ainsi le dATP, le dTTP, le dGTP et le dCTP ; le mélange
de ces 4 nucléotides est habituellement désigné sous le vocable de dNTPs. Les
nucléotides sont reliés entre eux par des liaisons phosphodiesters 3' —> 5' engageant
le groupement phosphate et le sucre. Cet enchaînement régulier constitue ce que l'on
appelle le squelette sucre-phosphate commun à toutes les molécules d'ADN. À l'in­
verse, l'ordre des bases greffées sur le sucre côté interne de la chaîne est spécifique à
chaque molécule. La cohésion des 2 brins est assurée, à l'image d'une fermeture
éclair, par les liaisons hydrogène que forment les bases entre elles selon la règle
d'appariement suivante : adénine et thymine engagent 2 liaisons hydrogène tandis
que cytosine et guanine forment une liaison plus stable grâce à 3 liaisons hydrogène.
Les principales propriétés de cette molécule sont les suivantes :
-elle peut être découpée en de nombreux petits fragments double brin par l'ac­
tion d'un très grand nombre d'enzymes appelées endonucléases ou enzymes de
restriction agissant comme des ciseaux ;
- le double brin peut être défait par rupture des liaisons hydrogène sous l'action
d'agents physiques ou chimiques dits dénaturants permettant l'obtention de
simples brins (ouverture de la fermeture éclair) ;
-enfin, placés dans des conditions favorables, les brins dénaturés peuvent à nou­
veau se réapparier selon la règle A - T ; G - T.
1.2 Le concept de sonde d'acide nucléique : définition
On définit ainsi une sonde nucléique comme étant un fragment d'ADN (ou
d'ARN) capable de reconnaître dans un échantillon biologique une séquence nucléo-
tidique complémentaire à la sienne et de former avec celle-ci une molécule double
brin ou duplex stable au cours d'une réaction dite d'hybridation. Actuellement, plu­
sieurs procédés sont disponibles pour obtenir diverses catégories de sondes (fleure I).
La formation des duplex peut être mise en évidence en marquant préalablement la
sonde par une molécule facilement détectable (isotopes radioactifs, haptènes ou molé­
cules fluorescentes ou luminescentes...).
13 Méthodes de marquage des sondes
Le marquage d'une sonde repose sur l'incorporation d'une molécule marqueur
dans la séquence nucléotidique. Cette incorporation doit respecter le plus possible
les contraintes stéréochimiques de la sonde afin de ne pas gêner la formation des
duplex.
Selon le type de marqueur incorporé, on distingue le marquage isotopique ou
radioactif communément appelé marquage chaud (le produit obtenu est souvent
appelé sonde chaude) et le marquage non isotopique ou froid et dont le produit est
une sonde froide. Les micro-organismes 63
Fragment d'intérêt = sonde
ADN
Isolement d'un fragment Production d'un fragment
d'ADN d'ADN par amplification
génique en chaîne (PCR)
Synthèse chimique d'une courte Clonage par génie génétique dans divers
séquence = sonde oligonucléoti-vecteurs, (phages, plasmides, cosmides...)
dique
Transcription d'un fragment d'ADN clone
par ARN pol (SP6, T7, T3 pol) = Ribosonde
Figure 1 • Méthodes d'obtention des sondes.
13.1 Marquage isotopique
Au cours de ce marquage, plusieurs types de radio-isotope s peuvent être incorpo­
125 35 3
rés dans la sonde. Selon les objectifs visés, 4 types de radio isotopes ( 1, S, H,
32 32
P) peuvent être incorporés dans la sonde. Il faut retenir que le P reste le plus uti­
lisé en raison de sa très forte émission énergétique. Plusieurs méthodes enzyma-
tiques permettent de catalyser l'incorporation de ces nucléotides dans les sondes.
• La Nick Translation ou translation de césure, ou déplacement de coupure, la plus
efficace de ces méthodes, permet d'introduire plusieurs molécules marqueurs dans
la sonde, elle convient particulièrement au marquage des sondes longues. Cette
méthode consiste en l'utilisation d'une petite quantité de DNase qui réalise au
hasard des coupures dans la sonde, secondairement une ADN polymérase répare
ces coupures à l'aide de nucléotides libres dont certains sont radiomarqués. L'acti­
vité spécifique de la sonde ainsi marquée est très élevée.
•Le marquage 5' terminal ou 3' terminal utilise respectivement une nucléotide
kinase T4 ou une nucléotidyl transférase pour catalyser l'accrochage du radio-iso­
tope soit à l'extrémité 5' soit à l'extrémité 3'. Dans ce cas, une seule molécule mar­
queur est fixée à la sonde dont l'activité spécifique sera faible. Cette méthode ne
convient qu'aux sondes courtes ou oligonucléotidiques.
• Marquage par extension d'oligonucléotides non spécifiques ou « random labeling »
utilise une mixture de 6 ou 9 nucléotides (respectivement désignés hexanucléoti-
diques ou nonanucléotidiques). Ces derniers vont se fixer de façon aléatoire sur la
sonde dénaturée puis une ADN polymérase va catalyser l'incorporation de nucléo­
tides libres dont certains sont marqués au cours de la synthèse du brin complémen­
taire. Cette méthode convient aux sondes longues, mais l'activité spécifique de la
sonde est parfois moins bonne que celle obtenue par la Nick translation. 64 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
• Enfin, marquage par incorporation de nucleotides au cours d'une réaction d'ampli­
fication génique en chaîne ou PCR qui peut être considéré comme une variante amé­
lioré du ramdom labeling. Ici, les amorces (primers) oligonucléotidiques (fonction-
nellemcnt assimilables aux hexanucléotides ou nonanucléotides) sont incorporées
dans une réaction biochimique ou intervient une ADN polymérase thermostable dont
la plus anciennement connue est la Taq polymérase.
Ces procédés de marquage isotopique, s'ils permettent d'obtenir, du fait de leur
émission et de leur faible contrainte stéréochimique une très bonne sensibilité pré­
sentent cependant quelques inconvénients liés à leur nature radioactive. En effet,
l'utilisation de ces substances soumise à autorisation implique des dispositifs de
sécurité, de stockage et d'élimination. De plus, la période de ces éléments limite la
durée de conservation des sondes ce qui suppose quasiment un marquage à chaque
utilisation. Enfin, on note quelque fois une radiolyse des sondes, notamment avec le
•'-P. C'est essentiellement pour pallier ces inconvénients que se sont développées les
méthodes de marquage non isotopique.
1.3.2 Marquage non isotopique
Le principe général repose sur la fixation covalente ou biospécifique d'une molé­
cule non radioactive sur l'ADN sonde selon des méthodes proches de celles utilisées
pour le marquage immuno-enzymatique. On distingue schématiquement 2 types de
méthodes :
• Le marquage direct au cours duquel la molécule marqueur est directement fixée à
l'ADN sonde. Le marqueur peut être, soit une molécule de faible poids molécu­
laire comme la fluorescéine, soit une macromolécule enzymatique telle que la per-
oxydase.
• Au cours du marquage indirect, un haptene est fixé à la sonde et la détection se
fera grâce à une protéine spécifique de l'haptène en général un anticorps. Les
haptènes les plus couramment utilisés sont représentés par la biotinc, la digoxi-
génine, racétoxyacétylaminofiuorènc, ou encore la fluorescéine. Une variante
de cette méthode consiste à détecter les hybrides après hybridation à l'aide d'an­
ticorps anti ADN double brin.
Que ce soit par marquage direct ou par marquage indirect, l'ancrage des molé­
cules marqueurs s'effectue par voie chimique ou par incorporation de nucleotides
prémarqués à l'aide des mêmes enzymes que pour le marquage isotopique. Ces pro­
cédés non soumis à autorisation présentent les avantages suivants : rapidité, stabilité
et manipulation aisée et sont de ce fait réalisables dans de nombreux laboratoires.
Cependant leur sensibilité est inférieure à celle obtenue par marquage isotopique, cet
inconvénient est due en grande partie à l'encombrement stérique provoqué par la
molécule marqueur. De plus, elles sont quelque fois à l'origine de bruits de fond
compliquant l'interprétation finale.
Qu'il s'agisse de marquage chaud ou de marquage froid, il existe dans le com­
merce de nombreux kits complets de marquage fournissant matériel (protocoles,
enzymes, nucleotides, molécule marqueur...) et décrivant les modalités du marquage
(tableau 1). Les micro-organismes 65
Tableau 1 • Méthodes de marquage des sondes et leurs principales applications.
Méthodes de marquage Sensibilité Applications principales Exemples
Hybridation avec sondes longues en
Déplacement de coupure particulier Nick Translation kit (Amersham, Bukinghamshire UK)
(Nick Translation) Hydritation in-situ Nickn kit (Boehringer, Mannheim, D)
Hybridation en Southem blot Nick Translation System (Promega, Madison, USA) n en Northern blot
Hybridation en dot blot n sur colonies
Hybridation avec sondes longues en
particulier Rediprime, Megaprime, Mutiprime, ECL random prime system Marquage par extension
d'hexanucléotides Hybridation en Southern blot (Amersham)
(Random priming) High Prime, High prime DNA labelling kit (Boehringer) n en Northern blot
Hybridation en dot blot Prime-a-Gene labelling (Promega) n sur colonies
Hybridation avec sondes courtes en
particulier oligosondes synthétiques DNA 5' labelling kit (Boehringer, Promega) Marquage 5' terminal
Séquençage (5' terminal) ECL 5'-Thiol oligolabelling system (Amersham)
Hybridation en Southern blot n en Northern blot
Marquage 3' terminal Hybridation en dot blot DNA 3' end labelling kit (Boehringer, Promega) +
DNA tailing kit (Boehringer, Promega) ou n sur colonies ou
Hybridation in-Situ (3' terminal) ECL 3' oligolabelling system (Amersham) 3' endtailing 66 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Tableau 1 • (suite).
Méthodes de marquage Sensibilité Applications principales Exemples
Hybridation avec toutes sondes
Marquage au cours Kits d'amplication génique en chaîne (PCR) dans lesquels
d'une réaction de PCR Hybridation en Southern blot un des nucléotides est remplacé par un nucléotide marqué. n en Northern blot Disponibles chez de très nombreux distributeurs sous forme
Hybridation en dot blot de kits. n sur colonies
Hybridation in-situ
Hybridation avec ribosondes
Marquage au cours d'une réaction Kits de transcription d'ARN in-vitw dans lesquels un des
de transcription in vitro Hybridation en Southern blot nucléotides est remplacé par un nucléotide marque. Exemple n en Northern blot SP6/T7 transcription kit (Boehringer) : RNA labelling kit
(Amersham) Hybridation en dot blot n sur colonies
Hybridation In-Situ Les micro-organismes 67
Le choix du type de marquage à utiliser sera en partie conditionnée par l'équipe­
ment du laboratoire. La catégorie de sonde (longue ou courte) sera quant à elle fonc­
tion de l'objectif recherché. Signalons cependant que les sondes longues ou polynu-
cléotidiques sont plus sensibles et plus spécifiques que les sondes courtes. À
l'inverse les sondes courtes vont s'hybrider plus rapidement que les sondes longues,
elles permettent en particulier de détecter des variations fines au niveau des
séquences complémentaires du type mutation et/ou délétion de quelques bases.
Dans le domaine du diagnostic microbiologique, elles seront utilisées pour recher­
cher une séquence complémentaire contenue dans un échantillon biologique au
cours d'une réaction d'hybridation.
2. Hybridation moléculaire : principes, procédés
et méthodes
2.1 Principe
L'hybridation moléculaire repose sur trois propriétés précitées de l'ADN :
- la capacité de 2 chaînes complémentaires à former dans certaines conditions des
molécules doubles brins stables ;
- la réversibilité de la réaction double brin —» simple brin ;
- enfin l'appariement spécifique des bases.
Dans le cadre du diagnostic microbiologique l'une des chaînes en présence est
représentée par une sonde marquée et l'autre par l'ADN contenu dans l'échantillon
biologique préalablement dénaturé. Les hybrides ainsi formés seront ainsi facilement
visualisables {figure 2).
2.2 Modalités d'hybridation
Classiquement la technique d'hybridation fait intervenir 4 étapes, dénaturation,
hybridation, lavages et détection.
22.1 Dénaturation
Pour être optimale, la dénaturation doit intervenir après une étape de libération de
l'acide nucléique contenu dans les cellules cibles. Les méthodes de lyse utilisées
pour libérer et purifier les acides nucléiques impliquent :
- une étape de rupture de la membrane cytoplasmique généralement par action
d'un tensio-actif tel que le dodécylsulfate de sodium (SDS, Sigma ou Merck)
employé à 0,5 ou 1 % final ;
- une étape de digestion des protéines cellulaires par diverses protéases, protéi-
nase K ou pronase (Sigma, Merck, Bœhringer, Eurogentec.) utilisées généra­
lement à une concentration finale de 50 à 400 u.g/ml ;
- une étape de séparation et de purification des acides nucléiques habituellement
réalisée par action d'un mélange stabilisé de phénol/chloroforme/alcool isoamy-I I CO > «5 O)0 W
68 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
1. Principe
ADN cible double brin
ADN sonde Dénaturation de l'ADN cible en 2 brins
pHélevé,95°C<T°<100°C
Hybridation [Na Cl] * T° faible = Formation d'une courte hélice
double brin entre la sonde et l'un des brins de l'ADN cible : l'ap-
« marqueur»
pariement est déterminé par la complémentarité des séquences
(enzyme, fluoro-
nucléotidiques contenues dans la sonde et l'ADN cible
chrome, peroxydase,
radio-isotope...)
2. Techniques et procédés d'hybridation
Extraction
Bactéries Hybridation
acide nucléique
milieu liquide
Virus
Hybridation
milieu solide Dénaturation
j
Hybridation
in situ
Dénaturation
Détection
Frottis d'organe Sonde marquée
Figure 2 • Principe et procédés d'hybridation.
lique en proportions respectives de 25/24/1 et saturé en tampon Tris EDTA
(EDTA 1 mM ; Tris-HCl 10 mM) ou Tris EDTA Sodium à pH 8 (Tris-HCl 0,05
M ; EDTA 0,5 M ; NaCI 0,1 M). Ces mélanges très largement employés en bio­
logie moléculaire peuvent être préparés localement ou mieux, s'obtenir prêts à
l'emploi chez de très nombreux distributeurs (Appligène, Interchim...).
Ce schéma valable pour les cellules animales, doit être légèrement modifié pour
les cellules bactériennes. En effet, du fait de la nature particulière de leur paroi, ces
dernières doivent subir au préalable un traitement visant la désintégration du pepti-
doglycane, composant rigide de cette paroi. Diverses substances telles que le lyso-
zyme (Sigma, Merck), la lysostaphine (uniquement disponible chez Sigma), et
l'achromopeptidase (Merck, Sigma) seront ainsi utilisées à des concentrations
finales de l'ordre de 0,1 à 4 mg/ml selon le groupe de bactéries à traiter. Un broyage
mécanique par billes de verre ou par ultrasons peut également s'envisager. Cette
étape préliminaire de destruction de paroi reste quasi obligatoire pour les bactéries à
Grain positif (figure 3a). Les micro-organismes 69
Destruction Destruction de la membrane cytoplasmique +
de la paroi Digestion des protéines (et des ARN)
Lysozyme 1 à 2 mg/ml final Cellule bactérienne
37 °C/1 h - Action du SDS (0,5 à 1 % final)
- de la protéinase K (50 à 100 mg/ml final)
de la ARNase (50 mg/ml final)
60°C/1 à2 h Séparation en gel d'agarose
contenant 0,5 /jg/ml de bro­
mure d'éthidium + observa­
Purification
tion sous UV Cathode
Grands Action d'endonucléase
fragments de restriction
ADN (phase aqueuse)
Débris cellulaires
Phase phénolique
Petits
fragments Phénol/Chloroforme/alcool
Anode
Isoamylique (25/24/1 ) + centrifugation
Figure 3a • Extraction purification de l'ADN bactérien, digestion, séparation des fragments
en vue d'une hybridation de type Southern.
Pour rendre l'ADN cible accessible à la sonde il convient maintenant de séparer
les doubles brins de la chaîne native en brins monocaténaires. Cette étape n'est pas
indispensable lorsque l'on recherche des acides nucléiques constitutivement mono­
caténaires tels que l'ARN, cependant elle permet de défaire la structure conforma-
tionnelle secondaire de telles molécules, les rendant ainsi plus accessibles aux
sondes.
La dénaturation s'obtient par chauffage de l'échantillon biologique à 95 °C-
100 °C pendant 5 à 10 minutes ou par action d'agents chimiques dits dénaturants tels
que la soude 0,5 à 1 M. Lorsque la sonde utilisée pour l'hybridation est sous forme
bicaténaire elle doit subir également une dénaturation dans les mêmes conditions.
Les chaînes ainsi dénaturées sont maintenues sous cette forme sous l'action du froid
(glace pilée).
222 Hybridation et préhybridation
Une fois dénaturées, les chaînes cibles et sondes sont mises en présence l'une de
l'autre afin de permettre leur appariement. Il faut dans la réaction un ratio
sonde/cible (entre 1/1000 à 1/2000) tel que les fragments sondes aient plus de
chance de s'apparier avec les fragments cibles qu'entre eux. Bien entendu, ce ratio
dépend également de la méthode de marquage, il sera plus faible pour un marquage 70 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
- Dénaturation dans le gel des fragments d'ADN (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCI) puis
- Neutralisation (0,5 M TrisHCI pH 7,5 ; 1,5 M NaCI)
Transfert type Southerm (12 à 16 heures) Transfert sous vide (45 min à 1 h 30)
Masse d'environ 700 g
Papier absorbant
Plaque
, Papier Whatman 3MM
^ Membrane de nylon^ Tampon SSC 20 X (3M Na Cl ; 0,3 M trisodium citrate)
Tampon Gel
SSC20X Papier Whatman 3MM
Vide
30 à 50 cm H,0 Cuves
Sens du transfert Sens du transfert
Fixation des ADN sur la membrane de nylon
2 -U V cross link 0,12 j/cm
- Cuisson 2 h à 80 °C
Stockage ou hybridation
Figure 3b • Transfert des fragments d'ADN sur membrane de nylon.
Gène ADN ribosomal Amplification génique en chaîne (PCR) Sonde rDNA16S marqué
avec amorces sur fractions conservées
+ marquage simultané avec dNTPs dont
certains sont marqués
Exemple :
Système Digoxigénine (Bœrhinger)
ARN ribosomal 16-23 S - - Transcriptase inverse ADNc16-23S
purifié à partir de bactéries
• Marquage chimique direct ou indirect par haptène Clonage dans un vecteur plasmidique
Amplification biologique
exemples :
Marquage par random priming
- Kit de marquage direct ECL
(Amersham, Buckinghamshire, UK)
marqueur = peroxydase de Raifort
- Kit AAF
(Eurogentec, Seraing, B)
sonde commerciale marquée par haptène = Acétylaminofluorène
Figure 3c • Stratégies potentielles de préparation des sondes utilisées en ribotypie. Les micro-organismes 71
Préhybridation (60 à 65 °C) 2 à 3 heures Saturation de la membrane
Hybridation (60 à 65 °C) 16 heures (une nuit) Hybridation ARN - ADN
Lavages AAF
er
- 1 lavage à la température d'hybridation (lavage stringent)
e
- 2 lavage à la température du laboratoire
Élimination des fragments de sondes Détection :
non hybrides
- réaction immunologique 1 (reconnaissance de l'haptène
par un Ac) AP
- réactione 2e de I'Ac Ac anti Ac
par un anti-Ac couplé à la phosphatase alcaline)
Ac anti AAF - lavage puis détection colorimétrique des hybrides
sur la membrane
Substrat
Réaction colorée
AP-
Ac anti Ac
Ac anti AAF
Figure 3d • Préhybridation, Hybridation et détection (sonde ARN-AAF).
radioactif par définition très sensible. Les conditions physicochimiques de la réac­
tion déterminent en partie la spécificité de cette hybridation. En effet, pour un ADN
donné, il existe une température à laquelle environ 50 % de la chaîne est sous forme
dénaturée, c'est la Tm (melting température) ou température de demi-dénaturation.
Pour une chaîne oligonucléotique donnée la Tm est calculée par la formule Tm = 4
(G + C) + 2 (A + T) où G, C, A et T sont respectivement le nombre de bases guanine,
cytosine, adénine et thymine. Par exemple, pour une chaîne (monocaténaire) de 21
nucléotides comprenant 5 guanines, 4 cytosines, 7 adénines et 5 thymines la Tm est
égale à 4 (5 + 4) + 2 (7 + 5) = 60 °C. Lorsque la réaction d'hybridation s'effectue à
des températures très voisines de cette Tm, bien entendu en dessous de cette der­
nière, seuls les hybrides spécifiques sont stables. Cette Tm va définir la spécificité
souhaitée pour une réaction d'hybridation. Il est ainsi possible de faire varier la tem­
pérature de même que les conditions salines selon le degré de spécificité désiré. On
considère habituellement que la température de spécificité optimale est égale à la
température de demi dénaturation moins 5 °C (Tm - 5 °C) (55 °C dans l'exemple
précédent). Ces considérations ne sont valables que pour une concentration saline
et/ou ionique standard dont la concentration saline varie de 0,1 à 1 M en tampon de
Denhardt c'est-à-dire (0,02 % polyvinylpyrrolidone, 0,02 % Ficoll 400 et 0,02 %
sérum albumine bovine). Selon les laboratoires, la composition de ce tampon subi
différentes modifications en vue d'une adaptation à différents usages notamment
pour les sondes froides. L'influence de la température peut ainsi être modulée par la 72 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
concentration saline et le pH du milieu réactionnel. À pH 7,5-8, les fortes concentra­
tions salines favorisent la formation et la stabilisation des duplex. On dit que les
conditions d'hybridation sont peu stringentes, autrement dit, peu spécifiques. À l'in­
verse, la spécificité ou stringence est augmentée dans les conditions suivantes : tem­
pérature élevée (très voisine de la Tm), pH élevés (milieux contenant formamide,
soude ou urée), concentration saline basse.
Très souvent, préalablement à l'hybridation proprement dite, il convient d'effec­
tuer une saturation du support d'hybridation et des sites non spécifiques de l'ADN
cible par inondation du milieu réactionnel avec de l'ADN d'une espèce phylogénéti-
quement très différente, l'ADN de sperme de hareng ou de saumon sont les plus uti­
lisés. Cette étape dite de préhybridation évite la dispersion de la sonde et optimise
l'hybridation, en particulier lorsque l'hybridation s'effectue sur une membrane.
223 Le lavage
Il vise à éliminer l'excès de sonde non fixée sans défaire les hybrides. Les tam­
pons utilisés et les températures doivent de ce fait respecter l'intégrité des hybrides
formés, leur degré de salinité est ainsi défini pour chaque type de sonde. Étape
simple, elle demeure indispensable et incontournable.
2.2.4 Détection
La dernière étape de l'hybridation est la détection des duplex éventuellement for­
més au cours de la réaction. Cette détection dépend bien évidemment de la nature de
la molécule marqueur.
Ce sera l'autoradiographie ou la scintillation pour le marquage isotopique, la
transformation d'un substrat chromogène, la fluorescence ou l'autoradiographie dans
le cas de chimioluminescence pour les marquages froids.
23 Procédés d'hybridation
Trois procédés sont actuellement utilisés pour réaliser l'hybridation (figure 2), Il
s'agit de l'hybridation en milieu liquide, l'hybridation sur support solide, et enfin
l'hybridation in situ.
23.1 L'hybridation en milieu liquide
L'ensemble des réactions de dénaturation et d'hybridation est réalisé en tampon
liquide dans un tube d'hybridation. Plusieurs variantes peuvent être employées pour
capter les hybrides. Dans la méthode à l'hydroxyapatite le liquide réactionnel est
élue à travers un gel d'hydroxyapatite qui va retenir les duplex hybrides pour l'ana­
lyse tandis que les chaînes monobrins sont éliminés. Au cours de la variante à la
nucléase SI les chaîness libres contenus dans le milieu réactionnel sont
hydrolysées par la nucléase SI, une aliquot de tampon d'hybridation est ensuite
transférée sur un filtre de nylon ou de nitrocellulose en vue de l'analyse. Dans une
autre variante employée en microbiologie alimentaire dans les systèmes GENE-Les micro-organismes 73
Système GEN-TRAK Système ACCU-PROBE GEN-PROBE
(Distributeur EURALAM) (Distributeur AGROBIOTESTS)
Lyse des bactéries
Libération des acides nucléiques (ARN) Libération des acides nucléiques (ARN)
Hybridation milieu liquide
60°C/15min + 65 °C/5 min 65 °C/1 h hybridation + capture simultanée
Hybridation des hybrides sur support solide (triple hybridation)
Destruction chimique de
la molécule marqueur
Sonde de détection marquée
(Ester d'Acridium) sur
à la fluorescéine
les sondes non hybrides
Sonde marquée ADN cible
ADN cible Sonde de capture (hybridation à l'ester d'acridium
poly A-poly T sur support plastique)
Détection
+ H202 + NaOH -» émission de photons + Anticorps anti fluorescéine couplée
à la peroxydase de raifort
-> Lecture au luminomètre
+ substrat de la peroxydase
= Chimilumescence en milieu liquide
-) Lecture au spectrophotomètre
= système proche de l'Elisa
Applications
Listeria (validé Afnor : tout produit) Listeria monocytogenes (validé Afnor : lait et pro­
duits laitiers, validation tout produit en cours) monocytogenes (validé Afnor : tout produit)
Staphylococcus aureus Escherichia coli
Campylobacter Salmonelia (validation en cours)
Staphylococcus aureus
Campylobacter
Yersinia enterocolitica
Figure 4 • Systèmes de diagnostic GENE-TRAK et GEN-PROBE en microbiologie alimen­
taire.
TRAK 2 types de sonde sont simultanément ajoutées dans le milieu reactionnel,
l'une permettant la reconnaissance de la séquence cible et l'autre couplée à une
molécule marqueur autorisant la révélation (figure 4). L'hybridation en milieu
liquide est rapide ; trente minutes à 2 heures sont généralement suffisantes pour l'hy­
bridation. 74 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
232 L'hybridation in situ
Elle se réalise à partir de calques d'organe. L'hybridation particulièrement longue
(jusqu'à 40 heures) va mettre en évidence les ARN messagers et ou les gènes chro­
mosomiques à l'intérieur des cellules. Ce procédé, actuellement en plein essor dans
le domaine de la recherche fondamentale, permet l'étude des rapports entre virus -
bactéries et cellules.
233 L'hybridation sur support solide
C'est le procédé le plus couramment utilisé. Là encore, plusieurs variantes sont
disponibles.
2.3.3.1 Le dot/slot blot
Après lyse cellulaire, les échantillons sont immobilisés (soit par dépôt simple
= dot, soit par aspiration = slot) sur un support solide en filtre de nylon ou de nitro-
cellulose. Dénaturation, hybridation, lavage et détection ont lieu sur la membrane.
Ce procédé fournit une bonne sensibilité. Si la durée nécessaire à l'hybridation est
plus longue que précédemment, cette méthode présente entre autres avantages de
permettre le traitement de plusieurs échantillons par membrane.
2.3.3.2 Le Southern blot et ou Northern blot
Au cours de ce procédé, l'ADN extrait de l'échantillon est d'abord digéré par une
ou plusieurs endonucléases. Les fragments obtenus, séparés par électrophorèse, sont
ensuite transférés sur une membrane (nylon ou de nitrocellulose). Ce transfert est
désigné sous le vocable de Southern blot. Lorsque ce transfert intéresse des ARN, il
porte le nom de Northern blot. La dénaturation a lieu soit avant le transfert soit en
cours de transfert. Ce procédé permet, outre l'étude de plusieurs échantillons, une
double analyse, d'abord d'après le profil électrophorétique obtenu après digestion
enzymatique ou REA (Restriction Endonuclease Analysis) puis d'après le signal
d'hybridation. Son inconvénient réside dans la nécessité de disposer d'une quantité
relativement importante d'ADN cible cardes pertes sont possibles au cours du trans­
fert. Un soin particulier doit donc être apporté à l'extraction de l'ADN. Il est égale­
ment possible de contourner cette difficulté grâce à l'amplification enzymatique ou
PCR.
3. Applications en microbiologie
La technique d'hybridation d'acide nucléique est un outil dont l'utilisation s'est
considérablement répandue dans divers domaines de la biologie. En microbiologie
3 grands domaines d'application sont concernés, la taxonomie, l'épidémiologie des
souches bactériennes (ou virales) et le diagnostic. Les exemples pratiques exposés
sont empruntés à l'épidémiologie et au diagnostic bactériologique. Les micro-organismes 75
3.1 Applications dans le diagnostic microbiologique alimentaire
La technique d'hybridation est en théorie applicable au diagnostic de tous les
micro-organismes présents dans les aliments dès lors que l'on a identifié les
séquences spécifiques d'espèce ou de type. Cependant, compte tenu de la perfor­
mance de certains marqueurs classiques notamment, biochimie, anticorps monoclo-
naux, sérotypie ou lysotypie, elle est essentiellement appliquée au diagnostic des
germes présentant un réel intérêt en termes de marqueur de salubrité et de santé
publique, notamment au diagnostic de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, de
Salmonella spp., des espèces du genre Listeria et de Listeria monocytogenes. L'iden­
tification d'autres bactéries telles que Campylobacter et Yersinia enterocolitica est
également possible.
En diagnostic microbiologique alimentaire, deux systèmes connus sous les termi­
nologies de système GENE-TRAK et GEN-PROBE (figure 4) commercialisés res­
pectivement par les laboratoires Agrobiotests (35769 Saint-Grégoire cedex) et Eur-
alam (69429 Lyon cedex 03) utilisent le procédé (le plus rapide) de l'hybridation en
milieu liquide dont la démarche est présentée à la figure 4. Leur principe diffère
légèrement par la nature de la molécule marqueur. La sonde est marquée par la fluo-
rescéine dans le système GENE-TRAK, la détection (marquage indirect) s'effec-
tuant grâce à des anticorps conjugués à la peroxydase. Une détection colorimé-
trique est alors réalisée au spectrophotomètre selon une approche analogue à celle
des tests Elisa. Dans le procédé GEN-PROBE, la sonde est marquée par un ester
d'acridium (marquage direct), molécule qui en présence d'eau oxygénée et de
soude est capable d'émettre des photons détectables par chimioluminescence, grâce
à l'utilisation d'un luminomètre. Quel que soit le système adopté, les kits dispo­
nibles auprès des distributeurs cités, incluant tous les réactifs et protocoles néces­
saires, sont d'utilisation aisée et permettent de ramener le délai de réponse à environ
48 heures. Un protocole utilisant le procédé GEN-PROBE, reproduit avec l'autorisa­
tion du laboratoire Euralam, est fourni en exemple (figure 5). Hormis les réactifs et
les systèmes de détection utilisés dans ce protocole, la démarche générale reste iden­
tique pour tous les kits disponibles en microbiologie alimentaire et autorise un gain
considérable de temps par rapport aux systèmes conventionnels de diagnostic.
3.2 Applications épidémiologiques
Le typage moléculaire doit permettre de suivre l'évolution dans le temps et la dis­
sémination dans l'espace d'une souche bactérienne (ou virale) définie. La diversité
des gènes d'un organisme constitue une extraordinaire source d'investigation exploi­
table par l'épidémiologiste. De nombreux outils épidémiologiques ou marqueurs
épidémiologiques de nature moléculaire ont ainsi élargi les moyens d'analyse de la
microbiologie et parmi ces méthodes l'analyse des profils de restriction des gènes
codant les ARN ribosomaux (souvent appelé ribotypage) s'est rapidement imposée
comme système universel de typage des bactéries. En effet, ce gène qui existe en
une ou plusieurs copies chez les bactéries présente sur le chromosome bactérien des
loci variables d'une espèce à l'autre et souvent d'une souche à une autre au sein
d'une même espèce. Il suffit donc de disposer d'une sonde correspondant à ce gène 76 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
J0-» Prise d'essai + Bouillon Fraser demi
25 g 225 ml
Homogénéisation + Incubation 18-24 h à 30 °C
J1-> Ensemencement sur gélose sélective (ex. : gélose Oxford)
(méthode en strie large à l'écouvillon)
Incubation de la gélose 18-24 h à 37 °C
Remise du bouillon en incubation 18-24 h à 30 °C
J2->
- Soit présence de colonies caractéristiques ou non sur la gélose :
= Réalisation en tube du test d'identification rapide par sonde spécifique
1. Prélever les colonies à l'aide d'une ose calibrée à 1/JI.
2. Ajouter 50 /il de réactif 1 et incuber au bain-marie à 37 °C - 5 min (lyse de bacté­
ries).
3. Ajouter 50 /JI de réactif 2 et incuber au bain-marie à 60 °C -15 min (hybridation
spécifique).
4. Ajouter 300 JJ\ de réactif 3 Vortexer et incuber au bain-marie à 60 °C - 5 min (des­
truction du marqueur de la sonde non hybridée).
5. Lecture sur luminomètre AcculLDR ou LEADER 50.
- Soit absence de colonies sur la gélose ou test d'identification par sonde spécifique
négatif :
= Ensemencement du bouillon initial sur gélose sélective -> Incubation 24 h à 37 °C.
= Prolonger de 24 h l'incubation à 37 °C de la gélose.
J3-» Réalisation en tube du test d'identification rapide par sonde spécifique sur les colonies carac­
téristiques ou non.
Figure 5 • Protocole de détection rapide de Listeria monocytogenes dans le lait et les pro­
duits laitiers par méthode GEN-PROBE ACCUPROBE.
(Validation Afnor n° EUR 15/02/95)
pour révéler la diversité ou l'unicité des souches dans une espèce bactérienne.
Comme ce gène est resté relativement bien conservé, chez les procaryotes (du moins
dans certaines régions), il est possible (en théorie) à partir d'une sonde constituée
d'ARN ribosomique 16S et 23S (obtenu à partir de Escherichia coli par exemple) de
typer plusieurs souches bactériennes appartenant à des genres très différents. Ce qui
est effectivement le cas comme le démontre la somme considérable de publications
réalisées avec cette seule sonde. Bien entendu, cet outil qui fournit en quelque sorte
la carte d'identité d'une bactérie (figure 3), doit pouvoir fournir aux industriels du
secteur agro-industriel, un moyen d'identification, de typage et d'épidémiologie des
souches bactériennes utilisées. L'exemple proposé expose les modalités potentielle­
ment existantes pour l'obtention de la sonde et son utilisation. Dans notre labora­
toire, nous utilisons en routine les sondes marquées chimiquement à l'AAF et dispo­
nible sous sa forme de kit prêt à l'emploi (Eurogentec, Seraing, Belgique). Cet outil Les micro-organismes 77
trouve son application dans la défense de la propriété industrielle, et/ou dans le
dépôt de souches à breveter. En outre, utilisé au cours des toxi infections collectives
d'origine alimentaire, il constitue un puissant moyen permettant de remonter à la
source primitive de l'épidémie.
Conclusion
Les progrès réalisés dans le domaine de la technologie des acides nucléiques ont
permis l'utilisation des sondes nucléiques dans de très nombreux domaines. En
microbiologie alimentaire, l'amélioration des systèmes de marquage non radioactif,
la performance et la simplicité d'emploi des sondes froides, notamment lorqu'elles
sont vendues sous forme de Kits autorisent leur diffusion dans de très nombreux
laboratoires.
Références bibliographiques
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Microbial infections and to Genotypic analysis. 1989. In : Animal biotechnology,
107-137. Babiuk and Philips, Pergamon Press Edit.
Dodet B. 1987. Les nouveaux diagnostics biologiques. La Recherche. 18 : 658-668.
Grimont F., Chevrier D., Grimont P.A.D., Lefevre M., Gusedon J.L. 1989. Acetyla-
minofluorene labelled ribosomal RNA for use in molecular epidemiology and
taxonomy. Res. Microbiol. 140 : 447-454.
Kaplan, J.-C., et Delpech M. 1989. Biologie moléculaire et médecine. Médecine-
Science, Flammarion Edit. Paris Manipulation
2
MÉTHODES DE RECHERCHE,
DE DÉNOMBREMENT ET D'IDENTIFICATION
DE CAMPYLOBACTER JEJUNI
Éric Dromigny
Introduction
Campylobacter jejuni fait partie à l'heure actuelle des préoccupations majeures
des microbiologistes et des hygiénistes.
L'intérêt de proposer des travaux pratiques portant sur C. jejuni est triple.
• En premier lieu, la mise au point dans les années 1970 et 1980 de méthodes fiables
de recherche de C. jejuni dans les selles diarrhéiques a permis en effet de révéler
son importance en tant qu'agent de gastro-entérites chez l'homme.
C'est ainsi que les chiffres publiés tant en France qu'à l'étranger font état d'une
fréquence égale sinon supérieure à celle des infections humaines dues aux Salmo-
nclles ( 1 ) (2). Cette fréquence élevée des campylobacterioses humaines fait de C.
jejuni une bactérie d'importance médicale que l'on peut être amené à manipuler au
laboratoire d'analyses médicales.
• En second lieu, C. jejuni est maintenant reconnu en France comme responsable de
maladies microbiennes alimentaires.
Il peut être transmis au consommateur par divers vecteurs, comme l'eau et surtout
le lait ou diverses viandes de volailles ou de boucherie mal cuites.
À ce titre, en 1988, à l'occasion de la diffusion d'une brochure du journal officiel
de la République Française relative aux toxi-infections alimentaires (3), C. jejuni
était inclus dans la liste des agents majeurs de maladies d'origine alimentaire.
Il n'existe pas encore de véritable critère microbiologique imposant sa recherche
dans les aliments, mais sa recherche, voire son dénombrement peuvent être effectués
dans le cadre d'expertises ou d'enquêtes menées à l'occasion de suspicion de trans­
mission alimentaire. Les micro-organismes 79
C'est aussi un micro-organisme qui peut être recherché dans le cadre du contrôle
de conformité imposé par le législateur et reposant sur les principes de l'analyse des
risques et des points critiques pour leur maîtrise (ou « HACCP »). C'est par exemple
le cas pour les produits alimentaires remis directement au consommateur et régis par
l'arrêté ministériel du 9 mai 1995 (4). Les occasions de mettre en évidence Campy-
lobacter jejuni peuvent donc être particulièrement nombreuses au laboratoire d'hy­
giène alimentaire.
• Enfin, C. jejuni est un micro-organisme que l'on peut qualifier de « fastidieux » car
sa culture et son identification demande au manipulateur une certaine habitude.
Il exige pour sa croissance des milieux spécifiques et enrichis, ainsi qu'une atmo­
sphère pauvre en oxygène, sans lesquels on ne peut espérer le mettre en évidence.
Même dans les conditions idéales, sa croissance n'est pas très rapide et demande
bien souvent au moins deux jours.
C'est une bactérie sensible aux microflores concurrentes et dont la conservation
est délicate. Son identification fait appel à des tests d'interprétation souvent délicats.
Cette difficulté est, en fait, un sujet de choix pour des travaux pratiques.
Pour toutes ces raisons, nous présentons ici une séance de travaux pratiques por­
tant sur C. jejuni, en proposant plusieurs options sur la base d'une séance relative­
ment simple et en donnant un ensemble de renseignements pratiques pour la réussite
des travaux pratiques.
Après une partie consacrée à de brefs rappels surtout destinés à donner les princi­
pales caractéristiques de la bactérie pouvant être rappelées par le moniteur de travaux
pratiques en séance introductive, ce chapitre sera présenté en cinq parties désormais
classiques : principe, matériel, mode opératoire, résultats, et interprétation.
1. Les bactéries du genre Campylobacter :
éléments généraux
1.1 Taxonomie
Campylobacter représente le groupe V de la deuxième section du Bergey's
eManual (9 édition), regroupant des bactéries : aérobies, microaérophiles, mobiles,
hélicoïdales, (vibrions), à Gram négatif.
Campylobacter est une bactérie de 0,2 à 0,5 um de large et de 0,5 à 8 um de long,
à une ou plusieurs ondulations (forme vibrionnaire).
Le vibrion est mobile par l'intermédiaire d'un flagelle présent à un ou deux pôles
de la cellule bactérienne.
C'est une bactérie au métabolisme respiratoire nécessitant une teneur en oxygène
allant de 1 à 15 % (optimum : 5 %) et une concentration en gaz carbonique d'envi­
ron 3 à 5 % (quelques souches pouvant cultiver en aerobiose), ne fermentant et
n'acidifiant jamais les glucides, possédant une oxydase, n'hydrolysant ni la gélatine,
ni l'urée, ne produisant pas de pigments. 80 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Les Campylohacter les plus importants se cultivent aussi à 42 °C, on les
dénomme pour cela Campylohacter thermotolérants par opposition avec Campylo­
hacter fétus qui ne se cultive pas à 42 °C mais à 25 °C.
1.2 Caractères généraux de culture
Les bactéries du genre Campylohacter sont caractérisées par une grande exigence
en ce qui concerne les conditions de culture. Il n'est en effet pas possible d'assurer
leur croissance en présence d'air et sur les milieux ordinaires.
La première condition de leur croissance est la microaérophilie. Ils ne se cultivent
que dans une atmosphère ou un milieu liquide pauvres en oxygène. La teneur opti­
male en oxygène est évaluée à 5-6 %. A l'exception des souches dites aérotolérantes,
la croissance en atmosphère ambiante (20 % d'O,) est habituellement impossible : il
y a alors accumulation dans la cellule bactérienne de peroxyde d'hydrogène qui inhi­
bent sa croissance.
La deuxième condition de croissance découle de la précédente : pour atténuer la
toxicité de l'oxygène, on doit fournir aux campylobactéries des milieux riches.
Certains facteurs de croissance contrebalancent la toxicité des tensions trop éle­
vées d'oxygène : le sang joue un rôle favorable en permettant la synthèse d'enzymes
qui interviennent dans la destruction des peroxydes, avant que lae de la cata-
lase (pour les espèces qui en produisent) ne soit suffisante.
Des agents soufrés réducteurs tels le thioglycolate, jouent en outre un rôle favo­
rable. De plus, le gaz carbonique, même en faible quantité, est nécessaire à la crois­
sance de Campylohacter.
La troisième condition de croissance est l'inhibition ou l'élimination des micro­
flores associées. Campylohacter est un mauvais compétiteur biologique. Il cultive
lentement. On ne l'isolera que difficilement au sein de la dore fécale ou alimentaire.
Enfin, la quatrième condition de croissance est une température d'incubation de
37 °C ou 42 °C. Les espèces dites thermotolérantes présentent une croissance à 42 °C,
ce qui n'est pas le cas de C. fétus. Par contre à 25° C, seul C. fétus et quelques autres
Campylohacter cultivent (tableau 1).
En règle générale, la durée d'incubation sera d'au moins 48 heures, en raison de
la lenteur du développement de Campylohacter. On les maintiendra en croissance
jusqu'à 5 jours pour les souches les plus lentes.
Même dans ces conditions quasi-idéales, la culture de Campylohacter est pauvre :
des colonies de petite taille, transparentes, parfois envahissantes apparaissent en
48 heures sur milieu solide ; en milieu semi-gélosé, la culture apparaît dans une zone
cylindrique ayant 4 à 10 mm de hauteur, située à quelques centimètres de la surface
(106).
Elle se présente aussi souvent sous forme coccoïde et notamment à partir de
24 heures de croissance. Les micro-organismes 81
C'est une forme de dégénérescence qui s'avère très difficile à cultiver mais qui
semble conserver son pouvoir pathogène, au moins au début de la dégénérescence.
C'est une forme qui apparaît plus vite à 42 °C. Elle pourrait être associée à l'absence
de croissance de certaines souches et de leur caractère spontanément non cultivable.
Il faut savoir la reconnaître sous coloration de Gram. C'est pourquoi nous en
reparlerons avec le diagnostic différentiel (5.3.2. Les pièges du diagnostic différen­
tiel).
13 Caractères généraux d'identification
Parmi les caractères métaboliques de Campylobacter, il faut retenir que :
- Campylobacter ne fermente et n'acidifie jamais les glucides ; le métabolisme
est de type respiratoire ;
- n'hydrolyse ni la gélatine ni l'urée et ne produit pas de pigment ;
- il ne réduit pas les nitrates en nitrites ;
- il possède pas ou peu d'enzymes ;
- toutes les espèces de Campylobacter possèdent une oxydase mais seules cer­
taines d'entre elles produisent une catalase telles que celle de Campylobacter
jejuni.
2. Principe
Cette séance de travaux pratiques comprend la mise en œuvre de méthodes per­
mettant d'une part de se familiariser avec la bactérie elle-même en travaillant sur des
souches de laboratoire.
Elle comprend d'autre part la mise en œuvre des méthodes de recherche et d'iden­
tification, voire de dénombrement de cette bactérie dans les conditions de la pra­
tique, c'est-à-dire dans les aliments d'origine animale.
Enfin seront présentées des méthodes de recherches de souches sauvages.
L'enseignant pourra ainsi choisir dans les trois approches celle qui sera la plus
adaptée au temps dont il dispose pour ces travaux pratiques et en fonction des possi­
bilités de manipulation des étudiants.
D'un point de vue général, les milieux et techniques de la microbiologie classique
seront supposés connus et maîtrisés et seront donc simplement cités.
Ne seront véritablement développés que les milieux et techniques spécifiques de
C. jejuni, et notamment ceux qui sont déterminants pour la réussite de la manipula­
tion.
Nous rappellerons enfin que C. jejuni est une bactérie pathogène pour le manipu­
lateur et que toutes les précautions doivent être prises pour éviter l'ingestion des cel­
lules de cette bactérie (pipettes convenablement cotonnées, poubelles de paillasse
pourvues en désinfectant, port de blouses de laboratoire, nettoyage convenable des 82 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
mains, stérilisation suffisante du matériel usagé...). En effet, même en faible quan­
tité, son ingestion peut être à l'origine de troubles digestifs qui sont parfois graves.
3. Matériel
3.1 Souches de laboratoire
3.1.1 Comment se les procurer ?
Le mieux est de se fournir en souche auprès de collections de souches bacté­
riennes, telle que la Collection de l'Institut Pasteur, qui dispose d'une série d'envi­
ron 10 souches.
On se procurera la souche type de l'Institut Pasteur C. jejuni CIP 70 80 T, la
souche type de l'Institut Pasteur C. coli CIP 70 2 T (pour disposer d'un témoin néga­
tif pour l'hydrolyse de l'hippurate).
Toutefois, de façon plus économique, des souches sauvages de Catnpylobacter
thermotolérants peuvent être facilement obtenues par isolement à partir du contenu
digestif de poulets ou d'autres volailles de chair, voire de matières fécales de rumi­
nants ou de porcs (on isolera souvent C. coli dans ce dernier cas). Cet isolement
pourra être réalisé avec les milieux que nous proposons dans la partie 3.2.1 Géloses,
et avec la technique décrite dans la partie 4.3 Mise en évidence de souches sauvages.
Éventuellement, on associera à ces souches :
- une souche de C. lari, résistante à l'acide nalidixique ;
-un e souche de Catnpylobacter fétus subsp../i?/(/i, ce qui procurera un témoin
négatif pour la croissance à 42 °C et un positif pour la croissance à 25 °C ;
- une souche <X Helicobacter pylori, ce qui permet d'étoffer le diagnostic différen­
tiel avec des souches de morphologie proche de celles de C. jejuni ;
- une souche d'Enterococcus, ce qui procurera un témoin positif pour le test de
l'hydrolyse de l'hippurate.
3.12 Comment les conserver ?
La conservation des souches de C. jejuni est toujours un point extrêmement déli­
cat, car c'est une bactérie qui a tendance à dégénérer rapidement. Contrairement aux
bactéries classiquement recherchées au laboratoire d'hygiène alimentaire, il n'est
pas possible de la conserver au delà de quelques jours à température ambiante.
Cette conservation doit être réalisée de deux manières :
3.1.2.1 Conservation de courte durée
La conservation de courte durée permet de conserver une souche d'une séance de
travaux pratiques à l'autre.
Elle est réalisée à même le milieu qui a servi à la croissance de la bactérie. Par
exemple, la souche est ensemencée dans un milieu au thioglycolate contenant 2 mg Les micro-organismes 83
d'amphotéricine B et conservée à l'étuve à 37 °C. La subculture tous les deux jours
permet (en général) de conserver la souche.
Ou bien la souche est conservée pendant environ 1 semaine à + 4 °C, sur la gélose
qui a servi à son isolement, avec toutefois le risque, s'il s'agit d'une gélose sélective
et d'un échantillon contenant une microflore concurrente, de voir cette dernière se
multiplier et rendre l'isolement de C.jejuni impossible. Il faut aussi compter avec la
dégénérescence de la souche sous forme coccoïde.
3.1.2.2 Conservation de longue durée
• Congélation
Une solution rapide est de prélever environ 1 ml de Campylobacter en culture
pure de 24 h sur bouillon Brucella avec une pipette stérile, que l'on dépose dans un
cryotube placé ensuite à - 80 °C ou mieux dans l'azote liquide, avec si c'est possible
du sérum de veau fœtal.
• Lyophilisation
La lyophilisation permet de conserver environ un an ou deux les souches de Cam­
pylobacter.
Toutefois, la meilleure solution, si on veut conserver à tout prix la ou les souches,
est de faire appel à plusieurs techniques (lyophilisation + congélation à -80 °C), plu­
sieurs tubes ou flacons étant ensemencés par technique de conservation et par
souche.
Il n'est en effet pas rare de constater que la souche congelée ou lyophilisée ne
reparte pas en subculture, peut-être après transformation coccoïde.
3.13 Comment les revivifier ?
De la même façon, plusieurs milieux devront être ensemencés lors de la revivifi-
cation : des géloses au sang non sélectives, des milieux liquides comme du bouillon
Brucella ou du bouillon au thioglycolate et à la Résazurine (cf. 3.2 Milieux). Pour
les souches manifestement contaminées, un passage sur une gélose sélective (gélose
Skirrow) par isolement en stries ou mieux une filtration sélective (cf. 4.2.2.3 Isole­
ment par filtration) permettent la plupart du temps de récupérer la souche pure. La
filtration peut être réalisée sur filtre posé sur gélose au sang ou avec tout système de avec une porosité de 0,45 um.
3.2 Milieux
32.1 Géloses
3.2.1.1 Nature et composition des géloses
• Les géloses de subculture ou d'identification
Les géloses de subculture ou d'identification sont représentées par des géloses au
sang dépourvues d'antibiotiques, mis à part de l'amphotéricine B à la concentration 84 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
de 2 mg/1, pour inhiber d'éventuelles moisissures ou levures venues contaminer la
souche de Campylobacier, ce qui est assez fréquent à cause de l'emploi de sachets
générateurs de gaz et d'une grande humidité des atmosphères de culture de Campy­
lobacier.
Le sang utilisé peut être du sang stérile de mouton ou de cheval.
• Les géloses sélectives d'isolement
Les milieux sélectifs solides sont des géloses dont la base (Columbia agar ou Bru-
cella agar ou autre base gélosée) est additionnée de 5 à 15 % de sang stérile de mou­
ton ou de cheval.
Les géloses d'isolement sont additionnés d'antibiotiques, les plus classiques étant
représentés par la vancomycine, le triméthoprime, la polymixine B ou l'amphotéri-
cine B. On les combine parfois avec un procédé de filtration.
Nous avons retenu plusieurs types principaux de géloses sélectives en fonction de
la nature et de la concentration des substance antibiotiques utilisées. L'amphotéri-
cine est facultative, sauf si l'échantillon correspond à de la volaille, riche en levures.
Nous avons délibérément retenu un nombre important de géloses sélectives : en
raison des difficultés de la mise en évidence de Campylobacier, on en utilise le plus
souvent deux en parallèle.
De plus, la plupart de ces géloses sont des géloses de référence et figurent dans
les normes internationales de recherche de Campylobacier thermotolérants (Géloses
de Karmali, Butzler modifiée, Skirrow, CCDA, Preston).
Chaque gélose est adaptée à une situation donnée en fonction de son pouvoir
sélectif ou des risques d'inhibition des Campylobacier.
Enfin, sous chaque dénomination, la composition des géloses peut varier. Nous don­
nons ici les compositions les plus souvent rencontrées. Pour se procurer ces milieux,
voir annexe n°l : Références des principaux milieux de culture et d'identification.
Dans le cas général, l'enseignant choisira une ou deux géloses dans la série sui­
vante (deux géloses si on recherche C.jejuni dans les aliments, cf. 4.2 Mise en évi­
dence de C.jejuni à partir des aliments) :
• La gélose Karmali
C'est une gélose sélective dépourvue de sang. Elle mérite à ce titre d'être présen­
tée à des étudiants car elle permet de rechercher Campylobacier à moindre frais et
même si on ne dispose pas d'une source régulière de sang stérile frais. C'est aussi le
premier milieu d'isolement sélectif figurant dans les normes internationales de
recherche de Campylobacter thermotolérants dans les aliments.
Milieu de base =
Campylobacter agar base (Karmali) 40 g
Charbon actif 4 g
Eau I I Les micro-organismes 85
Solution d'hématine =
Hématine 032 g
Eau 100 ml
Solution d'antibiotiques supplémentée =
Pyruvate de sodium0 mg
Céfopérazone 32 mg
Vancomycine 20 mg
Cycloheximide0 mg
980 ml de milieu de base seront ajoutés à 10 ml de solution d'hématine et 10 ml
de solution d'antibiotiques supplémentée.
• La gélose Butzler modifiée
Gélose Columbia Q.S.P. 11
Sang de mouton 50 ml
Céfopérazone 15 mg
Rifampicine0 mg
Colistine0 000 LU.
Amphotéricine B 2 mg
C'est une gélose réputée très sélective qui peut ainsi servir à isoler Campylobacter
de prélèvements très contaminés par une microflore concurrente, tels que des
matières fécales, la céfopérazone étant particulièrement active sur les bacilles Gram -
(Pseudomonas et Entérobactéries) et les coques Gram +. La colistine est active sur
les bacilles Gram -.
• La gélose Skirrow
Basegélosée Q.S.P. 11
Sang stérile lysé de cheval (ou de mouton) 50 ml
Vancomycine 10 mg
Sulfate de Polymixine B 2 500 U.I.
Lactate de triméthoprime 5 mg
La polymixine B inhibe essentiellement les bacilles Gram -.
Le triméthoprime a un spectre d'activité large : cocci Gram + ou - , bacilles Gram -.
La vancomycine inhibe la plupart des germes Gram +.
Il convient bien pour l'isolement des Campylobacter possédant une catalase à
partir d'échantillons dont la microflore concurrente n'est pas trop active, par
exemple pour purifier une souche de C.jejuni contaminée.
Ces antibiotiques seront complétés par de l'amphotéricine B à la concentration de
2 mg/1 ou de l'actidione à la concentration de 100 mg/1, pour inhiber d'éventuelles
moisissures ou levures. On fabrique parfois cette gélose avec du sang stérile lysé (ou
laqué) de cheval obtenu par congélation/décongélation de ce sang. 86 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
• La gélose Preston
Elle est caractérisée par l'adjonction de rifampicine à spectre très large contre
Gram + et Gram -, plus sélective que les antibiotiques de la gélose de Skirrow et
agissant sur des souches résistantes de Staphylococcus, et par l'absence de céphalo-
sporines ou de colistine qui sont parfois inhibitrices de certaines souches de Campy-
lobacter.
Base gélosée Q.S.P. Il
Sang stérile de cheval (ou de mouton) 50 ml
Triméthoprime 10 mg
PolymyxineB 5 000U.I.
Rifampicine0 mg
Cycloheximide 100 mg
Nous citerons pour mémoire la gélose CCDA et la gélose de Blaser plus adaptés à
la recherche de C.jejuni dans les matières fécales humaines.
3.2.1.2 Fabrication et conservation des géloses
Les géloses pourront être préparées à l'avance par l'enseignant. Toutefois, la
fabrication d'un certain nombre de géloses par l'étudiant lui permettra de mieux en
retenir les composants essentiels.
NB : La fabrication de ces milieux sélectifs par l'étudiant est souhaitable pour ses
vertus pédagogiques. Mais il faudra faire attention à prévenir tout risque de contact
ou d'ingestion des composants par le manipulateur, et notamment des substances
sélectives. En effet, il s'agit d'antibiotiques dont certains, comme le cycloheximide
ou actidione sont toxiques par inhalation, contact avec la peau et par ingestion.
Dans le cas de la manipulation de ces substances sélectives, on procédera en por­
tant des gants et plus particulièrement pour le cycloheximide, des lunettes et un sys­
tème de protection du visage, voire derrière la glace d'une hotte de manipulation des
produits toxiques à extraction d'air.
Différents additifs peuvent être employés comme agents de croissance : pyruvate
de sodium, métabisulfite de sodium, et sulfate ferreux (par exemple à 0,25 g/1 cha­
cun) si l'on craint une absence de croissance.
Ces géloses, et notamment les géloses au sang, devront être préparées extempora-
nément et utilisées le plus rapidement possible. L'utilisation de géloses trop
anciennes peut rendre aléatoire la croissance de la bactérie.
Ce sont bien des géloses au sang et non pas des géloses chocolat. Il ne faudra pas
trop chauffer la gélose avant d'ajouter le sang, sauf pour une culture d'Helicohacter
pylori qui préfère les géloses chocolat.
De plus, pour un dénombrement de colonies, on asséchera les boîtes sous la hotte,
de façon à obtenir ensuite de véritables.
En effet, sur des milieux humides, C.jejuni qui est flagellée, a tendance à donner
des colonies étalées ressemblant à du vernis en (laques brillantes, parfois légèrement Les micro-organismes 87
grises. On devra rechercher ce dernier aspect pour le montrer aux étudiants, car c'est
un aspect des colonies très caractéristique de Campylobacter.
Toutes les géloses au sang devront être conservées dans un délai maximal de
3 jours à + 4 °C.
322 Milieux liquides
3.2.2.1 Bouillons non sélectifs
On devra utiliser du bouillon Brucella ou du bouillon thioglycolate à la résazurine
semi-gélosé, notre préférence allant à ce dernier, même si ce n'est pas un milieu aca­
démique.
En effet, la croissance de la souche peut être suivie aisément par l'étudiant par l'obser­
vation de lae de la bactérie en surface et à quelques millimètres de la surface,
de même que la croissance d'éventuels contaminants, apparaissant alors souvent sous
formes de fusées ou de traînées, voire d'une opacification de tout le milieu.
Il n'est alors pas besoin de réaliser une coloration de Gram pour connaître l'état
de la souche, alors que cette coloration est obligatoire dans le cas du bouillon Bru­
cella dans lequel le trouble n'est jamais très marqué.
C'est aussi un milieu qui peut être sans difficulté placé directement en étuve, sans
sachet générateur d'atmosphère microaérophile, en raison de son caractère réducteur.
Mais il faudra utiliser un milieu frais ou régénéré à la vapeur, présentant une colle­
rette violette de résazurine réduite.
3.2.2.2 Bouillons d'enrichissement
Enfin, des milieuxt devront être utilisés pour la recherche de
Campylobacter dans les aliments.
Ils comprennent une base liquide (Bouillon Brucella) ou semi solide (Bouillon
thioglycolate à la résazurine) et des antibiotiques.
• Bouillon Preston
C'est un milieu d'enrichissement à utiliser pour les aliments frais (cf. 4.2 Mise en
évidence de C.jejuni à partir des aliments).
Bouillon nutritif de base Q.S.P. 11
Sang stérile défibriné lysé de cheval 50 ml
Triméthoprime lactate 10 mg
Polymyxine B 5 000 LU.
Rifampicine 10 mg
Cycloheximide 100 mg
• Bouillon Park et Sanders
C'est un milieu à utiliser pour les échantillons d'aliments ayant reçu un traitement
pouvant entraîner un stress des bactéries et une absence de croissance sur les milieux
(laits en poudre, viandes chauffées...). 88 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Il est caractérisé par deux solutions d'antibiotiques A et B qui seront rajoutées
successivement, la solution A immédiatement avant l'inoculum (5 ml), la solution B
4 heures après (50 ml) (cf. 4.2 Mise en évidence de C.jejuni à partir des aliments).
Bouillon nutritif de base Q.S.P. 1 1
Sang stérile défibriné lysé de cheval 50 ml
Solution d'antibiotiques A =
Triméthoprime lactate 20 mg
Vancomycine 20 mg
Eau 5 ml
Éthanol à 95 % (V/V) 5 ml
Solution d'antibiotiques B =
Céfopérazone 32 mg
Cycloheximide 100 mg
Mélange eau/acétone 50/50 (V/V) 50 ml
3 3 Autre matériel de culture
En raison du caractère microaérophile de Campylobacter, l'utilisation de jarres
pour anaérobies est indispensable pour sa culture.
Des générateurs d'atmosphère devront impérativement être utilisés. On utilisera
de préférence le mélange suivant : 5 % d'oxygène, 10 % de gaz carbonique et 85 %
d'azote. Cette atmosphère est obtenue grâce au système générateur d'atmosphère
microaérophile. Il se présente sous la forme de sachets métalliques contenant un
générateur d'hydrogène type borohydrure de sodium et un générateur de CO,,
comme le mélange bicarbonate de sodium - acide citrique. Après addition d'eau, ils
sont placés dans la jarre en présence d'un catalyseur (grains de palladium par
exemple ou sacs catalyseurs métalliques) lui-même convenablement régénéré par
passage au four Poupinel au moins 10 min après plusieurs utilisations.
Des filtres de 0,45 nm de porosité permettront d'effectuer l'isolement de C.jejuni
par filtration sur gélose (cf. 4.2.2.3 Isolement par filtration).
Des étuves seront nécessaires à 37 °C mais aussi à 42 °C et 25 °C, pour les tests
de croissance. Eventuellement, des bains-marie à ces températures pourront rempla­
cer les étuves.
3.4 Matériel d'identification
Le matériel permettant la réalisation de différents tests d'identification, en plus de
disques d'oxydase, d'eau oxygénée (recherche de la catalase), d'un microscope avec
objectif à immersion et de trois étuves réglées à 25 °C, 37° C et 42° C (cf. supra), de
divers tubes à hémolyse, comprendra : Les micro-organismes 89
3.4.1 Colorations
Il est nécessaire de disposer de l'ensemble des colorants classiques pour la colora­
tion de Gram, bien que la forme très caractéristique de la bactérie permette de l'iden­
tifier quelqu'en soit la couleur (virgules, formes en S, formes coccoïdes).
C.jejuni étant une bactérie flagellée, il est possible d'effectuer une technique de
coloration des flagelles par exemple par la méthode de Ribadeau et Dumas. Comme
ce n'est pas un test nécessaire à l'identification de C.jejuni, nous ne développerons
pas cette méthode.
3.42 Tests biochimiques et de croissance
3.4.2.1 Milieu solide
Il correspond au milieu dit TSI ou « Triple Sugar Iron », ou gélose au citrate de
fer et aux trois sucres contenant en particulier des sels de fer permettant de mettre en
évidence la production d'hydrogène sulfuré par certaines souches de
Campylobacter.
Ce milieu, après reconstitution est réparti en tubes sous la forme de géloses incli­
nées, de façon à prévoir un culot de 2,5 cm de profondeur, et une pente. Le noircis­
sement du milieu ou son jaunissement signeront respectivement la production d'hy­
drogène sulfuré et la fermentation des glucides avec acidification du milieu.
3.4.2.2 Milieux semi-solides
Pour les tests de croissance, les milieux ont comme base le bouillon Brucella ou
Brucella broth (Difco ND), réparti en tubes stériles de 15 ml.
Pour obtenir la consistance « semi-gélosée », rajouter environ 0,1 % d'agar.
3.43 Sensibilité aux antibiotiques
Ces tests sont réalisés par la méthode des disques sur gélose au sang. La composi­
tion de ces disques est la suivante :
-Acide nalidixique 30 ug ;
- Céfalotine 30 ug.
On réalisera une suspension laiteuse de la souche de C. jejuni qui sera versée sur
une gélose au sang.
La gélose au sang servant de milieu pour ce test sera préférentiellement composé
d'unee Mueller-Hinton.
3.4.4 Recherche de l'hydrolyse de Vhippurate
Ce test correspond à la mise en évidence de l'hydrolyse de l'hippurate de sodium
en glycine (et en acide benzoïque) par les souches de Campylobacter.
La présence de glycine est révélée par l'addition de ninhydrine (coloration vio­
lette soutenue). 90 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Il est dérivé de celui qui est habituellement utilisé pour l'identification des
souches de streptocoques.
Il permet de mettre en évidence la présence d'une hippuricase.
Le matériel nécessaire à ce test correspond à :
• une solution d'hippurate de sodium à 10 % (dans un tampon PBS ou phosphate
salin) =
Hippurate de sodium 10 g
Tampon PBS =
NaCI 8,5 g
Hydrogénophosphate disodique dihydraté 8,98 g
Dihydrogénophosphate monosodique monohydraté 2,71 g
Eau Q.S.P. 1 1
La solution d'hippurate sera stérilisée par filtration et répartie dans de petits tubes
à hémolyse, conservés à - 20 °C.
• une solution de ninhydrine composée de 3,5 g de ninhydrine dans 100 ml d'un
mélange à parties égales de butanol et d'acétone.
Toutefois, ce test, réalisé à l'origine en tubes, est souvent d'interprétation difficile
pour Campylobacter.
11 est en effet difficile d'obtenir une culture abondante du germe et d'inoculer le
germe dans la solution d'hippurate de sodium en quantité suffisante pour provoquer
une réaction d'intensité convenable.
C'est pourquoi nous décrivons ici une technique de mise en évidence de la gly­
cine produite en chromatographie en couche mince.
Le matériel nécessaire à ce test en chromatographie en couche mince correspond
à une solution de migration poure en couche mince comprenant de
l'eau distillée, de l'acide acétique et du butanol à parties égales, des plaques de Sili-
cagel (Schleicheret Schiill ND), un pulvérisateur pour la solution de ninhydrine.
3.4 .5 Utilisation d'une mini-galerie
On peut éventuellement faire manipuler une mini-galerie, et notamment lors de
recherche de souches sauvages (cf. 4.3 Mise en évidence de souches sauvages de C.
je/uni et Annexe 1 B pour les références).
4 Modes opératoires
Nous proposons ici trois manipulations différentes de complexité croissante. La plus
simple est la manipulation de souches de laboratoire de C.jejuni, destinée à familiariser
l'étudiant avec les difficultés de la culture et de l'identification de cette bactérie. Les micro-organismes 91
La deuxième manipulation a pour but de rechercher C. jejuni dans des aliments
artificiellement contaminés par des souches de laboratoire.
La troisième manipulation correspond à la mise en situation et à la recherche de
souches sauvages de C. jejuni.
4.1 Manipulation de souches de laboratoire de C. jejuni
4.1.1 Programme de préparations des souches par l'enseignant
En raison de la longueur et du caractère aléatoire de la culture de C. jejuni, il est
conseillé de suivre l'échéancier suivant, qui permet de se mettre (le plus souvent) à
l'abri de surprises désagréables, et de disposer à temps de souches pour les manipu­
lations :
Si J est le jour du début des travaux pratiques :
- J est préférentiellement un lundi, voire un mardi.
- Les souches de laboratoire sont sorties de l'azote à J - 7 et repiquées immédia­
tement, mises en culture 48 h, repiquées à nouveau (J - 5), mises en culture
48 h, repiquées à nouveau (J - 3), et laissées deux ou trois jours, selon qu'il
s'agit d'une fin de semaine ou pas.
- Le jour J, on travaille préférentiellement sur les souches de J - 3, mais les plus
anciennes conservées à + 4 °C telles quelles sur leur gélose ou dans leur
bouillons d'enrichissement pourront être utilisées en cas de perte des souches de
J - 3, et dans tous les cas, pour observer les formes coccoïdes en coloration de
Gram.
- Chaque souche ensemencée devant être en général incubée 48 heures, on pré­
voira une inoculation par les étudiants dès le jour J, une lecture des milieux à
J + 2, J + 4, etc., et des manipulations sur les boîtes de J - 3 ou plus anciennes à
J + 1, J + 3, etc. pendant l'incubation des milieux, par exemple en mettant en
œuvre les techniques d'identification décrite plus loin (coloration de Gram...).
4.12 Repiquage des souches de laboratoire
4.1.2.1 Repiquage en souche pure
Les souches de laboratoire seront inoculées par l'étudiant sur plusieurs milieux :
deux géloses au sang qui seronts en stries, un bouillon Brucella et un
bouillon thioglycolate à la résazurine.
Ces souches de laboratoire seront fournies d'une part sous forme de colonies, qui
seront prélevées à la pipette « trompe de mouche » quand elles sont petites. Dans ce
premier cas, l'enseignant aura préparé et inoculé 48 heures avant des géloses au sang
humides et sèches, de façon à disposer des deux aspects des colonies de Campylobacter
(petites colonies et étalements, cf. 5.1 Aspects des colonies de Campylobacter).
Ces souches de laboratoire seront fournies sous forme de souche congelée ou lyo­
philisée, de façon à familiariser avec les difficultés de la subculture de souches
conservées de C. jejuni. 92 MICROBIOLOGIE ALIMENTAIRE : TECHNIQUES DE LABORATOIRE
Après inoculation, les milieux seront placés dans une jarre avec un sachet généra­
teur d'atmosphère microaérophile, sauf pour le bouillon thioglycolate à la résazurine.
L'incubation est réalisée à 37 °C pendant 48 heures, mais on peut commencer à
observer une croissance sur les milieux dès 24, en particulier sur le bouillon
thioglycolate à la résazurine, où on observera un début de trouble localisé à la partie
superficielle du bouillon (qu'il ne faut bien entendu pas agiter).
4.1.2.2 Repiquage en échantillon multi-microbien
La pratique de l'isolement de C. jejuni au sein d'autres microorganismes sera pro­
posée à l'étudiant en plaçant dans quelques millilitres de bouillon Brucella une
souche de C. jejuni et les représentants de la flore concurrente habituellement ren­
contrée sur les géloses :
E. coli ou une autre entérobactérie, et notamment Proteus en raison de son pouvoir
envahissant des géloses, Pseudomonus fluorescens ou des levures pour la même raison.
L'isolement sera alors réalisé sur gélose sélective (cf. 3.2.1.1 Nature et composi­
tion des géloses).
4.13 Identification des souches de laboratoire
4.1.3.1 Lecture des boîtes et des bouillons
Après ouverture des jarres, les colonies de C. jejuni seront observées à la loupe en
raison de leur petite taille et à jour frisant.
Des colorations de Gram et des états frais sont réalisés (cf. 5.2 Aspects des Cam-
pylobacter au microscope).
4.1.3.2 Tests d'identification
Ces testsn sont réunis ici :
Test de l'oxydase :
Recherche de la catalase
Tests de croissance à 25 ° C (2 à 5 jours)
Tests de croissance à 37° C
Tests de croissance à 42° C
Production d'H,S sur TSI (5 jours)
Hydrolyse de l'hippurate
Sensibilité aux antibiotiques (Acide nalidixique et céfalotine)
Les tests d'identification sont réalisés comme suit : Les micro-organismes 93
• Test de l'oxydase
La présence de cette enzyme se manifeste par une coloration violette, après avoir
déposé avec une pipette Pasteur boutonnée un fragment de colonie, sur un disque
imprégné de tétraméthylparaphénylènediamine. _
Les Campylobacter sont « oxydase positive ».
• Recherche de la catalase
Disposer d'un flacon d'eau oxygénée à 5 %. Après introduction à l'aide d'une
pipette Pasteur boutonnée, la présence de la catalase est révélée par un dégagement
de gaz (= effervescence).
Campylobacter jejuni/coli et Campylobacter fétus sont « catalase positive ».
• Tests de croissance à 25 °C, 37 °C, 42 °C
Les milieux (bouillon Brucella ou bouillon thioglycolate à la résazurine) sont pla­
cés en étuve aux températures ci-dessus, après inoculation.
- Campylobacter jejuni/coli se développe à 37 °C et 42 °C, mais pas à 25 °C.
- fétus se développe à 37 °C et 25 °C mais pas à 42 °C.
Sur bouillon thioglycolate à la résazurine, le développement des bactéries à
quelques millimètres en dessous de la surface du milieu, permet de confirmer la
microaérophilie et d'éliminer les vibrions anaérobies facultatifs.
• Production d'H S sur TSI 2
Le milieu TSI est ensemencé sur la pente et dans le culot. Le dégagement d'H S 2
est mis en évidence par la coloration noire du milieu :
Campylobacter est en général H,S (-).
Toutefois, un biotype particulier de C.jejuni {Campylobacter jejuni biotype 2) est
H,S (+). De plus, Campylobacter coli est H S (±) au terme de cinq jours d'incuba­2
tion, (une légère coloration noirâtre apparaît en partie inférieure de la pente du
milieu TSI dans le liquide accumulé.
Ces deux derniers tests (croissance à différentes températures et production d'H,S
sur milieu TSI) peuvent être réalisés simultanément : les souches de laboratoire sont
alors ensemencées sur 3 milieux TSI.
• Hydrolyse de l'hippurate
Il faut récolter sur gélose des formes végétatives de Campylobacter en quantité
suffisante, soit une gélose par tube d'hippurate.
On prendra garde à ne pas prélever par la même occasion de gélose, dont les
acides aminés feraient virer au violet foncé la ninhydrine et donneraient un test posi­
tif par excès.
La glycine peut être révélée en tubes par addition de 5 gouttes de ninhydrine dans
la suspension après incubation à 37 °C, 2 heures du tube d'hippurate ensemencé.

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