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Une histoire de la résistance aux antibiotiques

De
364 pages
La résistance aux antibiotiques est apparue peu après la prescription de ces molécules. Cependant, dès l'aube du vingtième siècle, des médecins avaient mis en garde contre l'apparition de la résistance aux antibactériens de synthèse. Les bactéries pathogènes (pneumocoque, staphylocoque, entérocoque, colibacille…) mirent alors en œuvre des stratégies de résistance particulières. Cette histoire passionnante s'adresse aux étudiants, biologistes, vétérinaires, pharmaciens, médecins.
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Lettre du professeur Y. A. Chabbert Je vous livre quelques réflexions que me suggère votre ouvrage. La résistance aux antibiotiques est clairement apparue il y a soixante ans avec le Staphylocoque producteur de pénicillinase. Dans les années cinquante, la recherche industrielle, à partir des sources naturelles aboutit à une floraison d'agents antibactériens si nombreux que l'on peut en faire un dictionnaire touffu. Mais l'antibiothérapie évolua vers la mise au point de dérivés (bêta-lactamines, quinolones) avec un succès considérable en matière d'activité et généralité. L'histoire de la résistance montre clairement qu'aujourd'hui de très nombreux mécanismes affectent tous ces dérivés et des échecs thérapeutiques graves leur sont imputables. Devant cette situation, on peut certes en réduire les conséquences par un meilleur choix, mais on est en droit de se demander s'il ne faut pas recommencer à interroger la nature, autrefois si prolixe, pour lui demander de fournir de nouvelles bases pour une nouvelle ère antibiotique. Je ne peux qu'encourager à fond votre projet.

Docteur Yves A Chabbert Professeur Honoraire à l'Institut Pasteur 9 mars 2009

Le professeur Chabbert est né à Bordeaux en 1921, ville où il a effectué toutes ses études et son internat en médecine. Sa thèse en médecine, soutenue en 1947, concernait déjà l'étude des antibiotiques et les relations avec la clinique (mise au point du dosage de la pénicilline). En cette même année, Yves A. Chabbert entre à l'Institut Pasteur où il exerce son activité dans le laboratoire de l'Hôpital Pasteur, puis dans le laboratoire qui deviendra l'Unité des Agents Antibactériens. Il fut le premier à quantifier et à standardiser l'antibiogramme, à en donner une lecture interprétative et à mettre au point les techniques d' étude des associations d'antibiotiques. Il fut aussi un des premiers à identifier la résistance du staphylocoque à la méticilline et à rapporter la multirésistance des Salmonella à la présence de plasmide. Il initia une véritable épidémiologie moléculaire. Pendant trentesix ans, il n'aura de cesse de multiplier les travaux pour assurer une meilleure prescription antibiotique et prévenir les résistances. Il a été le Maître incontesté et respecté de l'étude de l'action des antibiotiques sur le monde bactérien, un Maître plein d'humour et de bon sens.
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(+) SUR LE MARCHÉ EN FRANCE, DEPUIS L'ORIGINE DES (d'après la consultation des dictionnaires Vidal ; pour les dates, on n'a pas tenu compte des compléments envoyés en cours d'année). Le nombre de vingt-neuf bêtalactamines mises à la disposition des médecins en France, en 2008, est matière à réflexion.
ANTIBIOTIQUES

BÊTA-LACTAMINES PRÉSENTES

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AVANT-PROPOS
L'histoire de la résistance aux antibiotiques devrait commencer à partir de la découverte de ces molécules, l'année 1929, date de la découverte de la pénicilline ou l'année 1940, date où l'on a cru aux vertus thérapeutiques de la pénicilline, alors même que Edward Abraham décrivait pour la première fois l'inactivation de la pénicilline par une pénicillinase. Nous avons choisi de la faire débuter trente ans plus tôt, lors des premiers pas de la chimiothérapie anti-infectieuse, parce que beaucoup de considérations et de conseils de prudence résultant de travaux et d'observations minutieuses avaient déjà été émis. C’est pourquoi il est regrettable que ces avertissements n’aient pas été pris en considération dès ces années. On tentera quelques explications dans le dernier chapitre de cet ouvrage. Ce livre est basé sur la liste des publications concernant les principales étapes de la découverte d'un mécanisme de résistance, la bactérie choisie étant celle où ce mécanisme s'exprime le mieux. Le texte est là pour faire le lien entre ces premières observations. Le nombre de publications sur un thème donné est considérable. En interrogeant la base de données PubMed avec la question Streptococcus pneumoniae penicillin resistance on obtient 3.728 références de publications en janvier 2009, pour un sujet plus restreint (Pseudomonas aeruginosa efflux antibiotic) on recueille 304 références. Le choix des publications n'est donc pas aisé. Il a été basé sur la nouveauté de l'information et sur l'importance des résultats présentés. On a toujours recherché la première référence relatant un fait nouveau (par exemple le passage d'un gène de résistance du chromosome vers un plasmide) en évitant de mentionner les références de travaux ultérieurs sur le même sujet, sauf si des informations nouvelles et importantes étaient apportées. Certes, tous les travaux cités n'ont pas la valeur novatrice souhaitée, mais ils participent néanmoins à la compréhension de l'apparition et de la persistance des résistances. Le nombre de publications portant sur des sujets voisins devient vite impressionnant (il y en a par exemple, un foisonnement en 1952, au début de l'utilisation de l'isoniazide (INH) comme traitement de la tuberculose). Le choix est encore plus difficile pour les années les plus récentes, l'absence de recul ne permettant pas toujours de
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juger de l'importance et du retentissement des résultats. La très grande majorité des références a été récoltée dans la consultation des articles originaux, avec parfois quelques surprises, certaines publications ayant des titres différents de celui habituellement cité, ou avec une liste des auteurs dans un ordre différent de celui donné dans les tables, ou encore avec des titres de publication de Pasteur retraduits de l'anglais, dans un français qui n'est plus celui du grand homme ! Mais je suis aussi conscient que des erreurs ont pu se glisser dans mon texte. Le texte, on l’a dit, n'est présent que pour faire un lien entre toutes ces publications, mais parfois la rédaction emprunte des chemins ardus, témoignant de la complexité des mécanismes de résistance et pouvant émerveiller ceux qui vont au-delà des interactions moléculaires. D'après telle publication, on serait parfois tenté d'en faire la une d'un chapitre, d'attirer l'attention, de piquer la curiosité, de susciter la polémique, mais la consultation d'autres travaux permet souvent de moduler les premières affirmations, de tempérer l'éclat de la première démonstration. Les références sont présentées sous une forme inhabituelle. Elles sont classées par année croissante de publications de manière à mieux objectiver l'histoire de la résistance. Par exemple la mise en évidence des gènes sauteurs par Hedges et Jacob a été publiée en 1974, alors que ces gènes avaient déjà été décrits chez le maïs en 1950 par Barbara Mc Clintock (chapitre 1). A l'intérieur d'une même année, les références ont été classées par ordre alphabétique du nom du premier auteur. La date de la publication est souvent très postérieure à celle de la découverte. Par exemple, dans le chapitre 2, David Hansman a observé la résistance d'un pneumocoque à la pénicilline en 1967, mais il n’a publié son observation qu'en 1971. Dans certains cas, cette particularité est spécifiée en écrivant 1967/1971. On a ajouté, aux termes habituels d'une référence, l'adresse du premier auteur, sans préciser le service ou le département, mais seulement l'université ou l'hôpital et la ville. C'était un des soucis de l'auteur de distinguer le lieu où s'est déroulée la recherche, en se référant à la publication originale. Mais les références les plus anciennes ne donnent parfois pas d'information. Quelques anomalies peuvent être constatées. Le libellé de l'adresse d'un même auteur peut être parfois différent d'une publication à l'autre : on a respecté les indications portées dans la publication. La précision du lieu reste appropriée jusque dans les années 1985, mais sa pertinence est peut être moins grande au cours de ces dernières années quand les auteurs sont nombreux et appartiennent à plusieurs centres de recherche : les travaux exigent la mise en œuvre de techniques de plus en plus complexes, effectuées par plusieurs équipes résidant dans des lieux
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différents. Néanmoins cette indication permet de situer le chercheur le plus impliqué ou l'équipe qui a initié le travail. On pourrait établir un palmarès des pays où s'effectuent les recherches les plus fécondes. Contentons-nous d'apprécier la contribution des équipes françaises à la recherche internationale, avec toutes les réserves émises à propos du choix des publications. Dans le cadre des thèmes très précis que nous avons retenus, le pourcentage de publications des équipes françaises rapporté à l'ensemble, va de 7 % pour le chapitre 3 sur le Staphylocoque à 26 % pour le chapitre 5 sur les Bêta-lactamases des entérobactéries. Les pourcentages intermédiaires sont 12 % chapitre 7 Mycobactérie ; 14 % chapitre 6 Bacille pyocyanique ; 19 % chapitre 2 Pneumocoque ; 21 % chapitre 4 Entérocoque). Une étude plus fouillée par décade montrerait des pourcentages plus élevés dans les dernières années du fait de l'émergence de nouvelles équipes. La quasi-totalité des publications est en anglais. Les 8,7 % en français dans le chapitre 2 Pneumocoque, sont dus essentiellement aux citations de résultats épidémiologiques concernant la France, publiés dansle Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire. Rappelons que ces pourcentages sont basés sur les articles les plus originaux (avec certes des difficultés pour cette qualification et quelques écarts par rapport à cette exigence) et non sur l'ensemble des publications sur le sujet, dont on sait que certaines sont copiées dans différents journaux ou que d'autres ne relatent pas toujours des travaux d'une grande originalité. Certains ne jugent le dynamisme des équipes de recherche que par le nombre de travaux publiés dans les prestigieuses revues Science et Nature. Le nombre de travaux sur la résistance bactérienne, publiés dans ces revues, toutes équipes françaises et internationales confondues, est faible (trois à cinq références concernant les thèmes abordés en interrogeant la base de données PubMed). Par contre, dans une première approche, il semble que la résistance du bacille tuberculeux aux antibiotiques soit plus fréquemment l'objet de publications dans ces revues. Que doit-on en penser ? que ces revues ne sont pas adaptées à ce type de recherche ? qu’elles accueillent certains thèmes plus facilement ou qu'il n'y a pas de résultats qui en vaillent la peine ? que les articles doivent intéresser le plus grand nombre possible de futurs abonnés ? Je reste profondément reconnaissant à la communauté scientifique d'avoir défriché avec tant d'ardeur les mécanismes les plus intimes de la résistance, d'avoir montré que les expérimentations les plus fondamentales pouvaient expliquer les problèmes les plus dramatiques dans l'art de guérir et susciter les essais pour y remédier. Glossaire, abécédaire et conventions d’écriture, voir page 319 * signifie que les mots sont répertoriés dans le glossaire.
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Introduction
Le 12 février 1941, un policier d'Oxford présentant une infection disséminée à staphylocoque doré était traité par la pénicilline. Après une amélioration de son état, l'évolution fatale ne put être enrayée en raison du manque de cette préparation. Dix autres malades furent ensuite traités et leur état évolua très favorablement, mais la production de pénicilline était très limitée. Florey et Chain arrivèrent à convaincre des industriels aux ÉtatsUnis à produire la pénicilline à grande échelle, si bien qu'en 1944, cet antibiotique fit partie de l'arsenal thérapeutique des troupes américaines et anglaises.

1- La menace microbienne : les micro-organismes résistants aux antibiotiques
Abraham et Chain décrivirent en 1940, une substance produite par un colibacille, qui inhibait complètement la pénicilline et la dénommèrent pénicillinase. En 1945, Fleming mit en garde la population, dans un article du New York Times du 26 juin, contre une utilisation abusive de la pénicilline pouvant conduire à l'apparition et à la propagation de bactéries résistantes. Cinq ans plus tard, à Paris et à Londres, la moitié des souches de staphylocoque était résistante à la pénicilline. Les premiers pas de l'antibiothérapie résument déjà le destin des antibiotiques : composés merveilleux qui tuent les bactéries les plus redoutables, composés désacralisés qui sombrent dans le crépuscule des thérapeutiques dépassées. Sommes-nous réellement dans cette période ? Les premiers propos vraiment alarmistes datent de 1998. Les bactéries résistent de plus en plus aux antibiotiques (Le Monde 13-14 septembre 1998), La résistance aux antibiotiques est très inquiétante malgré nos connaissances (ASM News, juin 1998). En septembre 1998, à Copenhague, une réunion de plus de trois cents spécialistes venant d'une trentaine de pays, est intitulée : La menace microbienne… Stratégies pour prévenir et contrôler l'émergence et la diffusion des micro-organismes résistants aux antimicrobiens…
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Figure 1 : ÉVOLUTION DU TAUX COMPARATIF DE MORTALITÉ PAR TUBERCULOSE DE 1925
À

1994 (Dossiers et Recherches n° 74, janvier 1999, Le rôle des vaccinations dans la baisse de la mortalité, Jacques Vallin et France. Meslé).

La menace est toujours là…Une bactérie résistante qui fait trembler Israël. Elle aurait déjà fait plusieurs dizaines de victimes… (Le Figaro, 10 mars 2007). Chaque année plus d'une vingtaine de réunions internationales sont consacrées partiellement ou totalement à la résistance aux antibiotiques. Le problème est bien réel : les bactéries échappent de plus en plus à l'action des antibiotiques.
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Et pourtant les antibiotiques apportèrent une contribution majeure à l'amélioration de la santé de l'homme, une contribution que l'on avait parfois exagérée dans l'euphorie de la réussite. Les maladies infectieuses, qui représentaient la principale cause de mortalité jusqu'au début du vingtième siècle dans les pays industrialisés où la condition ouvrière était souvent déplorable, étaient en régression spectaculaire. L'exemple le plus démonstratif était peut-être celui de la tuberculose (Figure 1). En France, le taux de mortalité passa de 145 pour 100 000 habitants en 1941 (il y eut une recrudescence pendant la dernière guerre) à 58 en 1950, soit deux ans après l'introduction de la streptomycine en France, et 31 en 1955, deux ans après l'arrivée de l'isoniazide (INH). Nous verrons ce qu'il en est advenu maintenant. Cependant il faut rester prudent dans la glorification du rôle des antibiotiques. Ainsi le taux de mortalité par tuberculose avait déjà baissé avant la guerre, probablement par les effets conjugués du BCG (introduit en 1921) et surtout de l'amélioration du niveau de vie sur le plan alimentaire et de l'hygiène. A la suite de la réunion de Copenhague, deux organisations européennes furent créées : la première, en 1999, collecte la sensibilité de sept espèces bactériennes à certains antibiotiques (EARSS*, European antimicrobial resistance surveillance system), l'autre créée en 2001 évalue l'utilisation des agents antimicrobiens en thérapeutique humaine (ESAC, European surveillance of antimicrobial consumption). Nous reparlerons de ces organisations dans un prochain ouvrage.

2- Les maladies infectieuses et les bactéries
2-1- Les maladies infectieuses sont provoquées par l'intrusion de bactéries, de virus, de champignons, de parasites Les maladies qui atteignaient simultanément un nombre important d'individus avaient toujours frappé l'humanité et étaient qualifiées de peste, au sens de maladie épidémique grave. Elles pouvaient survenir massivement dans des populations hors de leur environnement habituel, armée en campagne, voire en déroute, population assiégée, grand rassemblement religieux. La pandémie de peste qui envahit l'Europe en 1346, fit 25 millions de morts en six ans. Le typhus extermina près d'un demi-million de soldats dans l'armée napoléonienne au cours de la retraite de Russie en 1812, le choléra décima Paris en 1831-1832 (18.000 décès). Le paludisme sévit dans les zones intertropicales et près d'un million de personnes décèdent chaque année de paludisme en Afrique au XXIe siècle. Le médecin et poète italien Girolamo Fracastoro (1478-1553) énonça déjà que des germes sont responsables de l'infection (1). En se basant sur l'étude de la syphilis, de la tuberculose et d'autres affections, il formula le concept
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de contagion, portée par des semences qu'il nomme seminaria, particules imperceptibles capables de se reproduire, de se multiplier et d'envahir l'organisme. Mais c'est depuis la réfutation de la génération spontanée par Louis Pasteur en 1860 (7), que les maladies graves décrites jusqu'alors, devinrent réellement infectieuses, au sens de maladie succédant à la pénétration d'un agent et à sa multiplication. Car c'est la caractéristique de ces affections, qui ne surviennent que par suite de l'introduction dans l'organisme d'un microorganisme que l'on qualifiera de pathogène. En simplifiant : pas d'agent, pas de maladie. Mais la proposition inverse n'est pas toujours vraie : la bactérie pathogène est présente sans que la maladie ne se déclare, il faut que le terrain fléchisse, au cours de circonstances, dont quelques-unes ont été rappelées ci-dessus. Les maladies infectieuses sont nombreuses et c'est l'honneur des médecins et des microbiologistes de les avoir décrites en détail pour permettre à d'autres, d'après des signes pathognomoniques, de les diagnostiquer plus aisément, plus rapidement. On les désigne par leur expression majeure : méningite, septicémie ou par l'agent qui en est à l'origine : listériose, brucellose, hépatite B. La connaissance des agents en cause donne aux maladies infectieuses un statut particulièrement favorable. Supprimer l'agent c'est empêcher ou enrayer la maladie. Cette équation reste vraie dans la grande majorité des cas dans la mesure où le traitement est précoce et où l'organisme (i) n'a pas enclenché des mécanismes immunologiques néfastes(angines à streptocoque et atteinte cardiaque) (ii) n'a pas été lésé définitivement (lésion de la moelle donnant une paralysie définitive du membre correspondant dans la poliomyélite). Mais les agents infectieux sont variés et tous ne peuvent pas être éradiqués. Il existe ceux qui ont une vie propre, indépendante de l'organisme qu'ils vont infecter et qui peuvent se multiplier dans le milieu extérieur, ce sont les bactéries. Ainsi les Listeria se développent dans le milieu extérieur, le fourrage, l'ensilage destiné à l'alimentation animale. Le vibrion du choléra, les Pseudomonas peuvent se multiplier dans l'eau. Les parasites vivent au dépens d'un organisme où ils passent une partie ou la totalité de leur vie. L'agent du paludisme se multiplie dans les hématies. Par contre les virus n'ont pas de vie propre. Rejetés dans le milieu extérieur, ils peuvent y persister sans se multiplier. Il en est ainsi des virus de l'hépatite ou de la poliomyélite, véhiculés par l'eau (après une contamination par les matières fécales) mais qui ne s'y développent pas. Cette différence de mode de vie est la conséquence d'une différence fondamentale de structure. Les bactéries, comme les parasites, contiennent
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deux types d'acide nucléique (acide désoxyribonucléique ADN* et acide ribonucléique ARN*). Les virus ne renferment qu'un seul type (ADN ou ARN) et ne possèdent aucun gène pour leur biosynthèse, ils sont donc contraints d'emprunter les matériaux et l'énergie à la cellule qu'ils parasitent. Leurs faibles dimensions (ils sont cent à mille fois plus petits que les bactéries) a été longtemps un caractère distinctif, on les qualifiait de virus ultra-filtrables, i.e. passant à travers les pores des bougies Chamberland, formées de porcelaine poreuse. Mais la découverte en 2004, d'un virus de l'amibe (Mimivirus codant neuf cents protéines) (25-2) de la dimension d'une petite bactérie (0,7 micromètre) et qui ne semble pas une exception (33-2), doit faire oublier définitivement la distinction par la taille. Une conséquence essentielle de la différence du mode de vie des bactéries et des virus, concerne la thérapeutique : schématiquement on peut dire que la bactérie, cellule différente des cellules de notre organisme, pourra être éradiquée par les antibiotiques sans perturber notre organisme. Par contre les virus dont la multiplication est intriquée à la vie de nos cellules, seront plus difficiles à éliminer si l'on ne veut pas nuire à leur hôte. Nous mettons à part les parasites dont nous ne ferons plus état. Notre propos concerne donc les bactéries, puisque dans la grande majorité des cas, les antibiotiques ne sont actifs que sur ces micro-organismes. 2-2- Les techniques traditionnelles d'étude des bactéries sont bousculées par la génomique On sait que les bactéries sont de très petite taille (millième à centième de millimètre soit 1 à 10 μm). Leur observation ne fut possible que par la mise au point du microscope. Dès 1610, Galileo Gagilei dit Galilée (1564-1642) avait construit une lunette pour voir de près les choses les plus petites. Mais ce fut le drapier hollandais Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723) (4) qui élabora à Delft des microscopes très rudimentaires, pour examiner les tissus (il était drapier de son métier) et qui lui permirent de décrire dès 1674 et régulièrement ensuite, dans une revue scientifique anglaise qui existe encore maintenant (Philosophical Transactions of the Royal Society of London), les différentes formes d'animalicules provenant de l’eau de pluie, d'infusions de poivre et de son propre tartre dentaire : sphères (cocci), bâtonnets (bacilles), spirales (spirochètes). Mais certains auteurs assurent que le véritable découvreur du microscope est l'Anglais Robert Hooke (1635-1703) (2) qui décrivit, entre beaucoup d'autres choses, en 1665 dans son livre Micrographia, une moisissure chevelue que l'on appelle Mucor actuellement. Toujours au cours du XVIIe siècle, il semble bien que le jésuite allemand Athanasius Kircher (1602-1680) (3) fut le premier à utiliser le microscope pour trouver la cause des maladies : au cours d'une épidémie de peste qui sévit à Rome, en 1656, il rechercha sur les cadavres morbi pestiferi
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seminaria, les germes de la peste. Mais toutes ces observations n'eurent pas de suite. Ce n'est que deux siècles plus tard que l'on s'intéressa à ce que l'on venait d'appeler bactéries. Les colorants étaient utilisés couramment pour visualiser et caractériser les tissus cellulaires, et c'est au cours de ses essais sur des coupes de rein que le Danois Hans CJ Gram (1853-1938) (11) remarqua les effets du violet de gentiane couplé à l'iode/iodure de potassium sur les bactéries. Il publia en 1884, la formule d'une coloration simple, en plusieurs étapes qui, modifiée, permit de colorer les bactéries en violet ou en rose. Les premières étaient à Gram* positif, les autres, à Gram négatif. Cette dénomination, toujours utilisée de nos jours, doit sa pérennité au fait qu'elle reflète une différence fondamentale dans la paroi qui limite les bactéries. Les bactéries à Gram négatif ont une paroi peu épaisse, contenant des lipopolysaccharides (qui se dissolvent dans l'alcool). Les lipides sont absents de la paroi (néanmoins très épaisse) des bactéries à Gram positif. Les antibiotiques actifs sur les bactéries à Gram positif seront souvent différents de ceux qui sont actifs sur les bactéries à Gram négatif. L'observation au microscope optique permet donc de distinguer à l'examen direct d'un prélèvement, la forme et la mobilité des bactéries. Après coloration, on peut différencier des cocci à Gram positif ou négatif et des bacilles à Gram positif ou négatif, les spirochètes se colorent mal avec le Gram (Figure 2). Le microscope optique, dont le pouvoir séparateur* n'excède pas 0,25 μm ne donne pas plus d'informations. Le microscope électronique (qui permet de distinguer des détails 10.000 fois plus petits) apporte quelques données supplémentaires et donne de splendides images (dont la couleur que l'on ajoute est totalement arbitraire et artificielle, mais permet l'illustration d'articles de vulgarisation). Des techniques mises au point ultérieurement donnent une vue de la bactérie en relief dans son environnement tissulaire (microscope électronique à balayage). L'observation en temps réel de la machinerie de la cellule (division du chromosome…) est possible avec le microscope à épifluorescence, alors que le microscope confocal, microscope à épifluorescence avec balayage laser, permet de pénétrer en profondeur. En s'éloignant de l'observation stricte des bactéries, on pourrait ajouter que la microscopie à force atomique, utilisant une sonde sensible aux forces électrostatiques des atomes, permet d'étudier les repliements de l'ADN et de cartographier les zones d'interaction avec les protéines (dans les cellules eucaryotes) ; et enfin la microscopie à résonance magnétique, en présentant des images en trois dimensions des molécules, permettra, par exemple, la reproduction des formes des principes actifs des médicaments.

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Figure 2 : QUELQUES EXEMPLES DE MORPHOLOGIE DE BACTÉRIES. Les bactéries à Gram positif ont une paroi épaisse (jusqu'à 30 nm*) formée d'un glycopeptide (muréine) alors que les bactéries à Gram négatif ont une paroi plus mince (environ 10 nm) formée de muréine, phospholipides et protéines. Les techniques chimiques et moléculaires et en particulier la PCR*, mise au point en 1986 (15), viennent suppléer aux observations phénotypiques traditionnelles (23). Toutes les bactéries possèdent une copie d'un gène du ribosome* qui leur est spécifique (le gène ARNr 16S*) formé de séquences communes et de séquences variables suivant les espèces bactériennes. La détection (par PCR) dans un prélèvement provenant d'un malade des
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séquences communes, indique une présence bactérienne et la détection des régions variables permet l'identification de l'espèce bactérienne. En pratique on développe actuellement des techniques de détection d'ADN spécifique de la bactérie que l'on recherche, fragment que l'on peut éventuellement amplifier par PCR pour faciliter leur mise en évidence. Ces techniques sont appliquées pour déceler les bactéries dans deux circonstances principales : bactéries de culture longue ou délicate (dans les infections respiratoires : bacille de la coqueluche, bacille de Koch…), bactéries responsables d'infections sévères du fait de leur localisation (au cours de méningite : méningocoque, pneumocoque, Haemophilus inflenzae…). Bientôt le séquençage complet de chromosome deviendra une technique courante (26) … La possibilité de faire vivre les bactéries en dehors de l'organisme, d'obtenir une culture, est, on l'a déjà signalé, une des caractéristiques essentielles de ces micro-organismes. Louis Pasteur (1822-1895) dans son premier mémoire sur la fermentation lactique, de 1857 (6), considéré comme l'acte fondateur de la bactériologie, cultivait les bactéries en milieu liquide ; H. Hoffmann inaugura la culture sur pomme de terre en 1865, mais ce fut Robert Koch (1843-1910) qui généralisa les cultures en milieu rendu solide par agar ou gélatine en 1881, permettant d'obtenir des colonies isolées et par conséquent plus facilement, des cultures pures. Les rapports avec l'air, plus exactement avec l'oxygène, furent éclaircis dès 1863 par Pasteur qui distingua clairement au cours de ses travaux sur la putréfaction, les bactéries aérobies, qui se développent en présence d'oxygène, et anaérobies (8). De multiples études physiologiques et biochimiques purent alors être réalisées en cultivant les bactéries sur des milieux simples dont on maîtrisait la composition, et apportèrent une connaissance approfondie de la structure et du fonctionnement des bactéries. Une bactérie fut particulièrement étudiée : Escherichia coli, bactérie du colon, ou colibacille, décrite par le bactériologiste allemand Theodor Escherich en 1885. Actuellement la génomique apporte de nouvelles informations. Depuis le premier séquençage complet du génome d'une bactérie en 1995 (Haemophilus influenzae, une bactérie des voies respiratoires supérieures) (17), de nombreux autres génomes ont été séquencés (plus de 600 en 2008) : celui d'E. coli K12 (18) est constitué de 4.639.221 paires de base (la paire de base est maillon élémentaire de l'ADN)… et la démarche expérimentale pour une meilleure connaissance des bactéries a pris le chemin opposé à celui suivi jusqu'à maintenant. En effet jusqu'à ces dernières années, on étudiait la nature des aliments utilisés par une bactérie et ses mutants, on identifiait ensuite les enzymes impliquées et l'on en déduisait les gènes et leur organisation qui gouvernaient ces réactions. Maintenant c'est l'inverse, nous connaissons précisément l'enchaînement des bases de l'ADN (mille à
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plusieurs milliers de paires de bases constituent un gène), mais parfois, nous ne savons pas ce que les gènes codent : 38 % des 4.288 gènes de E. coli ont une fonction encore inconnue. 2-3- Quelques éléments d'anatomie et de physiologie bactériennes utiles pour la compréhension de l'action des antibiotiques (Figure 3) La bactérie est une cellule autonome. Elle est délimitée par une structure rigide, un peu comme la coque d'un navire, la paroi, qui donne la forme de la bactérie ; cette structure est un polymère* d'un polysaccharide peptidique (peptidoglycane ou muréine). Sous la paroi est située la membrane cytoplasmique (ou interne), constituée d'une double couche de phospholipides où sont immergées des protéines. La membrane forme un vaste sac souple et perméable dans lequel est contenu le cytoplasme. A l'intérieur du cytoplasme, une machinerie complexe fabriquant, synthétisant des protéines et des acides nucléiques, se déploie et se compartimente et une multitude d'enzymes s'organisent en équipes pour constituer des voies métaboliques.
L'ADN, le poste de commandement de la cellule, est le plus souvent représenté par un seul chromosome circulaire formé de deux brins d'ADN en double hélice et pelotonné. Le chromosome de E. coli déroulé serait en effet un filament long d'environ 1,36 mm (et extrêmement fin : 2 millionièmes de mm, soit 2 nanomètres) or il est contenu dans une cellule 500 fois plus petite. Il baigne directement dans le cytoplasme (il n'y a pas de membrane nucléaire), si bien que les ordres qu'il donne sont portés rapidement par des ARN* messagers aux différentes équipes et à la machinerie. Mais cette description n'est, en quelque sorte, que le squelette biochimique de la bactérie. Il faut ajouter, entre autres, de nombreuses interactions entre les équipes, permettant d’affiner et d’adapter le métabolisme à des situations particulières. De plus le chromosome n'est pas une structure stable : il incorpore des éléments génétiques d'autres bactéries (cf § 7-2) si bien que 70 % du chromosome du pneumocoque par exemple, provient d'ADN étrangers (30). De même on a montré récemment que de nombreux petits ARN ont un rôle régulateur (24, 25).

La bactérie que nous venons de décrire correspond à une bactérie à Gram positif. Mais cette structure de base comporte des variantes. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi est enveloppée par une membrane externe lipo-polysaccharidique et l'espace compris entre cette membrane et la paroi correspond à l'espace périplasmique, dans lequel se trouvent des enzymes, telles que les bêta-lactamases (cf chapitre 5). Les mycoplasmes (agents de pneumopathies) sont dépourvus de paroi, d'où leur insensibilité à des antibiotiques attaquant la paroi (pénicilline, plus généralement bêtalactamines). Le bacille de Koch a une paroi très riche en lipides que seuls certains antibiotiques pourront pénétrer. Le vibrion du choléra a deux chromosomes et l'agent de la maladie de Lyme (cf infra) a un chromosome linéaire. Des structures additionnelles peuvent augmenter la résistance aux antibiotiques (Figures 2 et 3). De petites molécules d'ADN circulaire dont la
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Figure 3 : QUELQUES ÉLÉMENTS DE LA STRUCTURE DE LA BACTÉRIE. CA : capsule ; CH :

chromosome dont un des brins permet la synthèse d'un ARN messager ARNm qui en se plaçant sur le ribosome R va donner la synthèse de protéines ; CI : cil ou flagelle donnant la mobilité ; PA : paroi recouvrant la membrane cytoplasmique MC ; PL : plasmide dont certains gènes gouvernent la synthèse du pilus sexuel PS permettant l’amarrage à une autre bactérie, étape préparatoire à une conjugaison.

dimension est de l'ordre du centième du chromosome, dénommées plasmides*, portent très souvent plusieurs gènes de résistance aux
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antibiotiques. La présence d'une capsule entourant la paroi du pneumocoque, freine l'entrée des antibiotiques. La spore, produite par les bactéries (des gangrènes par exemple) quand les conditions de vie leur sont défavorables, est totalement insensible aux antibiotiques. En effet les enveloppes qui délimitent la spore, sont particulièrement étanches et ont pu maintenir, par exemple, les potentialités vitales d'une bactérie datant, peutêtre, de 250 millions d'années : il s'agit, comme on l'a montré en 2000, d'une spore de Bacillus isolée d'une inclusion liquidienne, présente dans un cristal de sel gemme (22) (La question fut posée : est-ce un cas d'immortalité ?). Des poils, plus élégamment appelés pili ou fimbriae, permettent aux bactéries à Gram négatif de s'accrocher aux cellules pour les coloniser ; certains antibiotiques pourront inhiber leur synthèse. Les flagelles donnent la mobilité, et l'on peut supposer que E. coli doit fuir quand arrive une déferlante, plus précisément un gradient, d'antibiotique ! Toutes ces structures concourent à la vitalité de la bactérie. Après avoir pénétré dans notre organisme, la bactérie baigne dans des milieux complexes. De multiples substances, dont les nutriments, traversent sa paroi (i) en empruntant des pores (substances hydrosolubles) (ii) par diffusion (composés liposolubles), puis la membrane interne. Les composés indésirables sont refoulés dans le milieu extérieur par des systèmes d'efflux, les autres sont pris en charge par la machinerie cellulaire pour assurer l'entretien et la croissance, en utilisant l'énergie provenant de réaction d'oxydoréduction. La plupart des bactéries pathogènes restent à l'extérieur des cellules de l'hôte d'où elles décochent leurs toxines. Certaines pénètrent dans les cellules où elles échappent aux défenses de l'hôte. Incluses dans une vacuole intra-cytoplasmique, elles peuvent s'en libérer en la lysant (Listeria*, Shigella*, Rickettsia*) ou y rester mais contrarier son évolution (Legionella*, Chlamydia*) ou sa maturation (bacille de Koch, Salmonella* Typhimurium) (20). Les mécanismes fondamentaux du fonctionnement des bactéries ne diffèrent pas de ceux d'une autre cellule (Ce qui est vrai pour les bactéries est aussi vrai pour les éléphants, Monod et Jacob) mais la nature des équipes (enzymes en relation avec l'ADN) et la marque des machines (ribosomes) sont différentes, ce qui permet aux antibiotiques d'attaquer spécifiquement les bactéries et de préserver l'intégrité des cellules de notre organisme… dans la plupart des cas. La vitalité des bactéries est prodigieuse. Ensemencé dans un milieu nutritif liquide bien aéré (par agitation continue du flacon), E. coli se divise toutes les vingt minutes. En 24 heures, en présence d'une réserve alimentaire illimitée, on obtiendrait 4,7 mille milliards de milliards de bactéries ! Ces chiffres dépassent l'entendement, et par chance les conditions optimales de culture ne pouvant être techniquement maintenues, la croissance s'arrête
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après quelques générations. On peut comprendre que les antibiotiques, pour être efficaces, doivent agir précocement, avant que la population bactérienne ne soit trop dense. Certaines bactéries ont un temps de génération beaucoup plus long, et des échanges ralentis avec le milieu extérieur : ce temps est de l'ordre d'un jour pour le bacille de Koch, d'une quinzaine de jours pour le bacille de la lèpre. Les antibiotiques auront alors plus de difficultés à pénétrer et à imprégner ces bactéries, ce qui justifie des traitements de longue durée (jusqu'à deux à cinq ans pour les formes multibacillaires de lèpre). 2-4- Mais l'immense majorité des bactéries ne sont apparemment pas nocives pour l'homme Les bactéries sont très répandues dans l’environnement. Le sol peut contenir jusqu’à 108 à 109 bactéries par gramme de poids sec de terre. Les bactéries qui vivent sur la peau sont inoffensives (commensales), celles qui résident dans l'intestin vivent en symbiose avec notre organisme : elles trouvent avantage à être logées dans ces lieux riches en substances nutritives et notre organisme en tire bénéfice. Ces bactéries participent à la digestion de molécules récalcitrantes (tel le cartilage), à la synthèse de vitamines indispensables à l'homme (biotine, B12, K) ; des bactéries lactiques, en produisant différents peptides et bactériocines* entravent l'implantation de bactéries indésirables. Des nombres sont souvent cités pour démontrer l'importance de cette flore microbienne : l'organisme humain formé de l'assemblage de 1013 cellules, héberge 1012 bactéries sur la peau, 1013 dans son appareil respiratoire et 1014 dans son tube digestif. Un projet de recensement de toutes ces bactéries est en cours (the human microbiome project) (31). Mais nous verrons cependant que cette flore si sympathique peut être, malgré elle, un réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques… et l’on se demande aussi si des changements parmi les bactéries du microbiome peuvent participer à la manifestation de certaines affections ou syndromes multifactoriels. 2-5- Alors comment peut-on savoir si une bactérie isolée à partir d'un prélèvement (de sang, d'urine… ) est impliquée dans la maladie observée ? La réponse fut apportée avant même la naissance de la microbiologie, par Friedrich Henle (1809-1885) qui émit l'idée en 1840 (5), de l'existence d'un contagium vivum et qui formula des postulats permettant d'impliquer le rôle d'un agent vivant dans une maladie. Plus tard, au cours de ses travaux sur la maladie du charbon et de la tuberculose (de 1876 à 1884), Koch (9,10) fut amené à poser certaines conditions qui furent reprises ultérieurement sous forme des Postulats de Koch que l'on peut ainsi résumer :
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(i) le micro-organisme doit être retrouvé au niveau des lésions, dans chaque cas de la maladie (ii) il doit être cultivable en culture pure en dehors de l'organisme pendant plusieurs générations (iii) la culture ainsi obtenue, inoculée à un animal sensible, doit reproduire la maladie. Notons curieusement que ces postulats ne furent pas publiés par Koch mais par Friedrich Loeffler (1852-1915) (qui a réussi à cultiver le bacille de la diphtérie) dans un article daté de 1883 (19). D'autres conditions furent ajoutées : le micro-organisme doit être re-isolé de l'animal inoculé, il ne doit pas être retrouvé dans d'autres affections, il doit provoquer une réponse immunitaire. Mais, comme pour toute règle en biologie, il y a des exceptions. Ainsi les gangrènes, suite à des accidents de la route par exemple, sont dues à plusieurs bactéries. Le tréponème de la syphilis n'est pas cultivable sur les milieux inertes et une suspension de vibrion du choléra, préparée par Koch lui-même et ingérée en 1892 par Pettenkofer, un hygiéniste de Bavière, ne provoqua aucun trouble… On constitua, ainsi au cours des années, une liste des maladies avec en correspondance les bactéries qui en étaient la cause. La maladie résulte de la pénétration et de la multiplication de bactéries produisant des toxines* agissant à doses infinitésimales : exotoxine* (au cours du tétanos, de la diphtérie…) ou endotoxine* libérée après lyse du corps bactérien (fièvre typhoïde…) ou de bactéries équipées de tout un arsenal : facteurs de virulence* comprenant toxines redoutables et enzymes destructrices hydrolysant les tissus (infection pulmonaire par bacille pyocyanique chez sujets atteints de mucoviscidose…). On pensait que la liste des bactéries pathogènes était close, et que l'efficacité des antibiotiques allait la faire oublier. On s'aperçut cependant que certaines bactéries délaissées, moins agressives, parce que dépourvues de facteurs de virulence puissants, pouvaient avoir un rôle pathogène lorsque les défenses de l'organisme fléchissaient ou ne pouvaient atteindre l'agent infectieux (corynebactéries, Staphylococcus epidermidis). Et le nombre de ces malades allaient en augmentant du fait des progrès des soins médicaux. De plus l'utilisation généralisée des sondes* nucléiques permit de repérer des bactéries non cultivables et d'identifier de nouvelles souches bactériennes responsables d'affection d'étiologie jusque-là mystérieuse. Ainsi le syndrome de malabsorption connu sous le nom de maladie de Whipple, fut-il rapporté en 1992 à une bactérie (Tropheryma whipplei) (16) ce qui justifiait l'utilisation des antibiotiques pour traiter cette affection. On fut ainsi conduit à faire quelques entorses aux postulats de Koch, mais provisoirement, car on
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rapporta en 2000 que T. whipplei peut être néanmoins cultivé (21) même à partir d'un prélèvement d'un malade (28). Une nouvelle revue médicale fut créée en 1995 par un organisme américain (CDC*) : Emerging infectious diseases, les maladies infectieuses émergentes. 2-6- Les maladies émergentes Nous sommes confrontés actuellement à trois types de maladies émergentes. Les maladies re-émergentes dues à des bactéries connues, comme la tuberculose qui sévit dans le monde entier et particulièrement en Afrique, la diphtérie en Europe de l'Est, la syphilis en Chine (29) et depuis 2000 en Europe. Les maladies émergentes plus récentes dont beaucoup sont d'origine virale et quelques-unes, bactérienne : la légionellose (bactérie identifiée en 1977) (12) ; les entérocolites hémorragiques à E. coli 0157:H7 décrites en 1982 (13) (cette bactérie provient de E. coli O55:H7 ayant reçu différents gènes dont celui de la toxine Shiga) (27, 32) ; la gastrite due à Helicobacter pylori (identifié en 1983) (14) pouvant se compliquer d'ulcère gastrique et éventuellement de cancer ; et d'autres… Et un nouveau virus vient d'être isolé en 2008 chez les sujets ayant subi une transplantation d'organe (33). D'autres maladies qui réapparaissent, ont en commun d'être transmises par la piqûre d'insectes (tiques), eux-mêmes infectés à partir d'un réservoir animal. Ainsi, la maladie de Lyme (du nom d'une ville du Connecticut où sévissait une épidémie d'arthrites, précédées de rougeur, érythème chronique migrant, 5.500 nouveaux cas par an en France), des rickettsioses, des ehrlichioses et d'autres qui tirent leur nom de celui qui a découvert l'agent pathogène. Mais alors que font les antibiotiques ? Ils sont à l'origine du troisième volet des maladies émergentes, celles qui sont résistantes aux antibiotiques !

3- Les antibiotiques et les bactéries
3-1- Quelques étapes de la découverte des antibactériens Dans un sondage de novembre 2000, on demandait aux Français quelles étaient les plus grandes découvertes de ce siècle. Les antibiotiques furent classés en premier, avec 40 % d'opinions favorables. Et dès que l'on parle d'antibiotique, on pense à pénicilline et à Fleming. Deux illustrations pour accompagner cette réponse. L'une pour la découverte fondamentale : la photographie de la boîte de culture où l'on voit une grosse colonie de Penicillium notatum ayant lysé des colonies de staphylocoque (Figure 4) Figure 4 : DEUX IMAGES EMBLÉMATIQUES DE LA PÉNICILLINE. Reproduction de la boite
de Petri où l'on voit la disparition des colonies de Staphylocoque autour de la colonie de Penicillium (A. Fleming. Brit J Exp Path. 1929, 10 : 226-236) (ref 38). Reproduction du début de l'article où Chain, Florey et al rapportent les propriétés chimiques, pharmacologiques et thérapeutiques de la pénicilline (Lancet, 1940, 2 : 226-228) (ref 43). 24

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publiée en 1929 (38). L'autre pour l'application médicale : le titre de l'article publié le 24 août 1940 dans la revue anglaise, The Lancet (43) : La pénicilline comme agent de chimiothérapie, ayant pour auteurs Chain, Florey (et leurs collaborateurs) qui partageront en 1945 le prix Nobel avec Fleming (Figure 4). Car la découverte de la pénicilline en 1929, n'est pas la découverte des antibiotiques à usage thérapeutique. Chain et Florey signalent d'ailleurs au début de leur article que, avant eux, René Dubos (1901-1982), microbiologiste d'origine française, naturalisé américain, avait pensé à une utilisation thérapeutique de la gramicidine qu'il avait découverte en 1939, mais que ce composé était trop toxique ; nous reparlerons de Dubos. Depuis l'antiquité, il semble bien que l'on ait soigné les infections avec des moisissures se développant sur le pain, le soja… Plus proche de nous, on a invoqué d'autres découvreurs des antibiotiques, mais quand Louis Pasteur (1822-1895) écrit la vie empêche la vie (1877) (34), il s'agit d'une compétition pour l'oxygène entre deux êtres aérobies, d'une antibiose, concept introduit en 1889 par Paul Vuillemin pour décrire une situation dans laquelle un micro-organisme est en opposition vitale avec un autre. Joseph Lister (1827-1912), le découvreur de l'antisepsie, reprenant les observations du bactériologiste Sanderson, montre en 1871-1872 l'effet inhibiteur d'un Penicillium glaucum sur des bactéries, et conscient du rôle du champignon, a même appliqué, en 1884, un extrait de culture sur un abcès d'une infirmière. Ernest Duchesne (1874-1912) (35) est allé plus loin dans ses recherches avec Penicillium glaucum, travaux qui ont conduit à la soutenance d'une thèse de médecine à l'École de santé militaire de Lyon en 1897. En 1899, Emmerich et al (35-2) ont préparé un extrait de culture de bacille pyocyanique, appelé pyocyanase, inhibant les cocci et d'autres bactéries. L'extrait trop toxique par voie générale, a été utilisé sous forme de pommade pendant quelques années. Ultérieurement plusieurs centaines d'observations d'antagonisme bactérien ont été recensées, mais n'ont pas eu de suite. Pourquoi n'ont-elles pas été exploitées ? Peut-être parce que l'essor de la chimie mettait alors à notre disposition de nombreux composés dont la structure était parfaitement connue et que l'on pouvait modifier et dont on pouvait essayer l'activité antibactérienne. Retenons plus longuement deux précurseurs. Paul Ehrlich (1854-1915), chimiste prussien, fut le véritable initiateur de la chimiothérapie. Ses travaux se développèrent schématiquement au cours de quatre périodes. Il s'intéressa d'abord aux colorants pour caractériser les tissus et les cellules et tenta en 1891 l'action du bleu de méthylène dans le traitement de deux patients atteints de paludisme. Il étudia ensuite l'effet des toxines des plantes sur les souris et montra le rôle protecteur des anticorps et étendit ses investigations aux toxines
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bactériennes ; il définit les titres des préparations en utilisant la réaction avec l'antisérum, interaction qu'il considéra comme une réaction chimique, et mit au point avec Behring le sérum antidiphtérique, travaux qui lui valurent le prix Nobel en 1908 avec Elie Metchnikoff. C'est à propos des anticorps qu'Ehrlich parle de balles magiques (ensorcelées) (Zauberkugeln). On dit qu'il emprunta ce terme du Singspiel romantique Der Freischütz (Le Bon Tireur) de Carl Maria von Weber. Dans cette légende folklorique, un jeune homme doit atteindre absolument une cible pour se marier avec sa fiancée. Pour être sûr d'y parvenir, il Paul Ehrlich (1854-1915) passe un pacte avec le diable, qui lui © The Nobel Foundation donne une balle magique pour atteindre sûrement la cible. Il poursuivit ensuite des travaux sur l'action des colorants sur les infections parasitaires dues au trypanosome (agent de la maladie du sommeil), peu génératrices d'immunité protectrice. Ehrlich chercha alors des balles magiques chimiques parmi les colorants qu'il connaissait bien, puis synthétisa toute une série de composés dérivés d'une structure de base. Ses essais furent conduits non seulement in vitro, mais aussi chez la souris et avec le bactériologiste japonais Shiga, il découvrit en 1904, le rouge trypan. Ce composé guérissait l'infection due au trypanosome, de la souris, mais était peu efficace chez l'homme. Ces travaux participèrent aux fondements de la chimiothérapie dans une période où pourtant triomphait l'immunothérapie. Mais finalement Ehrlich attacha son nom au traitement de la syphilis et d'autres tréponématoses* par un dérivé de l'arsenic, le Salvarsan®. En effet, en 1905, on découvre le tréponème, agent de la syphilis, et Ehrlich trouve un certain parallélisme entre les infections dues au trypanosome et celles dues au tréponème. Un grand nombre de composés dérivés de l'arsenic sont synthétisés et identifiés par un numéro. Au printemps 1909, un bactériologiste stagiaire Sahachiro Hata venant de Tokyo, familier de la syphilis chez le lapin (le tréponème n'est pas cultivable), essaie de nombreux dérivés contre la syphilis. Le numéro 606 est très efficace : vingt-quatre malades atteints de syphilis sont guéris. Le Salvarsan® est alors qualifié un peu pompeusement de Therapia sterilisans magna de la syphilis par Ehrlich et sera largement utilisé pour traiter une syphilis récemment contractée
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Figure 5a : SALVARSAN® - Formule selon Ehrlich (The Lancet, 1913, 2 : 445) et selon

l'Index Merk (2008). La présentation d'Ehrlich permet de comprendre la comparaison de la formule avec une flèche empoisonnée.

Figure 5b : LE PRONTOSIL RUBRUM ET LE SULFAMIDE 1162-F. Le prontosil correspond à la sulfamidochrysoïdine. La partie ayant une activité antibactérienne est le sulfanilamide (1162F). Figure 5c : MÉCANISME D'ACTION DES SULFAMIDES. Le sulfanilamide (1162-F) a une structure proche de l'acide para-aminobenzoïque. Il peut donc être incorporé à la place de ce dernier au cours de la synthèse de l'acide folique, ce qui conduit à une molécule inactive.
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(Figure 5). Mais Ehrlich continue à améliorer son produit et après trois cents nouvelles synthèses, il trouve en 1912, le Neosalvarsan®. Peu de temps avant sa mort, Ehrlich prononça en 1913, une lumineuse conférence au 17ème Congrès international de Médecine qui se tenait à Londres où il rappela les grands principes de la chimiothérapie, tels qu'il les concevait (36, 37). Il enchaîna avec une impeccable logique les idées et s'appuya sur ses travaux concernant les anticorps, pour expliquer l'action des substances chimiques sur les parasites. Ses réflexions sont pleines d'intérêt de nos jours, où l'on parle de l'immunothérapie que l'on avait négligée lorsque l'antibiothérapie triomphait. Et pour la bonne compréhension, Ehrlich n'hésite pas à recourir à des aphorismes, parfois militaires. 1- l'activité d'un composé est due aux groupes chimiques qu'il porte 2- le composé doit se fixer sur le parasite : corpora non agunt nisi fixata 3- il se fixe sur des chimiorécepteurs spécifiques. Plus les récepteurs sont nombreux, plus la chimiothérapie est efficace 3- un exemple de spécificité : la drogue est comparée à une flèche empoisonnée (dont le poison est l'arsenic trivalent dans le cas du Salvarsan®) portée par un groupement (amine -NH2) permettant la fixation au récepteur du parasite 4- certains composés (contre le trypanosome), inactifs in vitro peuvent devenir actifs in vivo par suite de leur transformation chez l'animal 5- cette transformation varie d'un animal à l'autre 6- la toxicité résulte de la présence de récepteurs identiques sur le parasite et sur les cellules de l'organisme. Il faut donc arriver à séparer dosis toxica de dosis tolerata ou alors synthétiser des dérivés se fixant faiblement sur les cellules de l'organisme 7- la dose thérapeutique d'un remède idéal devrait être du cinquième ou du dixième de la dosis tolerata 8- pour une therapia sterilisans magna, il faut frapper fort et frapper vite (en français dans le texte) mais on risque de libérer des toxines (cf 7) 9- l'hypersensibilité à la drogue est toujours à redouter, mais aussi l'hypersensibilité aux produits libérés par la lyse du parasite sous l'action du médicament (réaction de Jarisch-Herxheimer suite à la lyse du tréponème de la syphilis par le Salvarsan ®) 10- si la thérapeutique n'est pas entièrement stérilisante, les parasites restants pourront être éliminés par l'action des anticorps qui seront rapidement formés 11- cette situation peut résulter (i)- de l'apparition de variétés résistantes : trypanosomes résistants du fait de la diminution d'affinité des récepteurs pour le composé (ii)- d'une mauvaise distribution de l'antibiotique dans l'organisme (par exemple dans le liquide céphalorachidien). Alors que la
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therapia magna sterilisans pouvait être comparée à une victoire rapide au cours d'une guerre en rase campagne, la thérapeutique à instituer en cas de résistance, correspondrait à un siège de plusieurs mois pour prendre une forteresse : plusieurs injections sur plusieurs semaines seront indispensables et d'autres options seront nécessaires (augmentation de la perméabilité…) 12- Une association de drogues pour attaquer le parasite sur deux récepteurs différents peut être envisagée, selon la maxime militaire marcher séparément, combattre ensemble. L'efficacité est plus grande que la somme des efficacités séparées (effet que l'on qualifie maintenant de synergique). Ehrlich parle d'efficacité, de toxicité et de résistance… déjà en 1913 et en insistant sur frapper fort et frapper vite, il signifie, que mise à disposition d'un médicament et mode d'utilisation sont indissociables pour une bonne efficacité. Et il ajoute un dernier aphorisme : Prévenir est mieux que guérir. Après avoir rendu hommage à ses prédécesseurs, dont en premier à Pasteur, il souligne, à la fin de son exposé, que des milliers (de personnes) sont venues depuis leur pays pour témoigner que dans le monde de la science toutes les barrières nationales ont disparu. On était en 1913. Nombreux furent ceux qui s'engagèrent sur la voie tracée par aidés par la puissante industrie chimique allemande. L'I.G. Farbenindustrie, en Rhénanie-du-Nord-Westphalie, avait synthétisé tout une série de colorants diazoïques (avec deux azotes –N=N-) couplés avec un sulfonamide pour teindre les textiles, et la couleur obtenue était très résistante au lavage et à la lumière du fait de la combinaison du colorant avec les protéines de la laine. Le médecin et chimiste allemand Gerhard Domagk (1895-1964) (39), qui était directeur de recherche dans cette Société, rechercha une activité antibactérienne parmi ces colorants et trouva que l'un d'eux de couleur rouge, le Prontosil rubrum (Rubiazol®) guérissait des souris infectées par un streptocoque hautement pathogène (1935) (Il est assez plaisant de noter qu'actuellement des fabricants cherchent à greffer des antiseptiques sur des textiles !). Ce résultat fut très remarqué, car c'était la première fois qu'un composé non toxique permettait de tuer des bactéries ordinaires et de guérir une maladie expérimentale puis, ultérieurement des malades. Cependant seuls certains streptocoques, que l'on appellerait maintenant Streptococcus pyogenes, étaient sensibles et Domagk recommanda donc une étroite collaboration entre bactériologistes et cliniciens pour que le traitement fût institué à bon escient. N'est-ce pas toujours d'actualité ? Une dernière remarque : les essais d'activité furent conduits chez l'animal, le Prontosil étant inactif sur les streptocoques cultivés in vitro et l'on verra pourquoi. Notons que lorsque le Prontosil fut diffusé aux USA, il fut décidé d'utiliser un nouvel excipient* ce qui fut suivi par le décès de soixante-seize personnes : l'excipient était l'éthylène glycol, utilisé actuellement comme
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antigel ! Cet accident décida les autorités fédérales à créer un organisme pour s'assurer de la sécurité et de l'efficacité des produits destinés à l'usage humain : ce fut la FDA (Food and Drug Administration) (d'après B. Meunier, 2006) (54). Les recommandations d'Ehrlich et de Domagk concernant l'utilisation des antibactériens ont été souvent oubliées : on s'est laissé griser par l'efficacité des antibiotiques et l'on a cru pouvoir éliminer définitivement les maladies infectieuses. Le Prontosil, inactif in vitro, était donc actif in vivo. Une vive controverse s'éleva entre ceux qui pensaient que le produit agissait d'une manière indirecte et ceux qui penchaient pour une action directe sur les bactéries. Dans la deuxième éventualité, le Prontosil devait être transformé par l'organisme en un composé qui était le véritable antibactérien et ce fut le Français Jacques Tréfouël (1897-1977) (40) et son équipe de l'Institut Pasteur, qui démontra quelques mois plus tard de la même année 1935, que seule une partie de la molécule était responsable de l'activité antibactérienne (Figure 5b). Il s'agissait du composé comportant un groupement sulfamide enregistré 1162F, ainsi dénommé parce qu'il provenait du laboratoire d'Ernest Fourneau. Les sulfamides étaient nés. E. Fourneau avait par ailleurs un certain sens de l'humour, puisque paraît-il, ne sachant quel nom donner à un anesthésique puis à un antiseptique à base d'arsenic, il opta respectivement pour Stovaïne® et Stovarsol® (de l'anglais stove : fourneau). Quant au 1162F, le produit s'appela dans les pharmacies Septoplix® et fut commercialisé en France pendant 63 ans, jusqu'en 1998… De nombreux sulfamides furent synthétisés, les fièvres puerpérales, les méningites à méningocoque étaient guéries, même la lèpre pouvait être contenue par les sulfones. De plus, on sut que le sulfamide agissait en empêchant l'incorporation de l'acide para-amino-benzoïque dans une vitamine essentielle à la croissance bactérienne, l'acide folique (Figure 5c). Et par la même occasion Donald Woods (1912-1964) (45) mit en évidence un des grands mécanismes moléculaires d'action des antibiotiques : la compétition de substrats. Le sulfamide a une formule proche de celle de l'acide para-amino-benzoïque et entre en compétition avec ce dernier au cours de la synthèse de l'acide folique, or cette vitamine est essentielle dans de nombreux processus dont la division cellulaire (Figure 5c). Les successeurs d'Ehrlich et de Domagk triomphaient, bien qu'un premier échec thérapeutique ait déjà été signalé en 1937 (41). 3-2- Quelques étapes de la découverte des antibiotiques Dix ans plus tôt, le 3 (ou 4) septembre 1928, Alexander Fleming (1881-1955) interrompait des vacances pour rejoindre le St-Mary Hospital à Londres dans des circonstances prêtant à discussion (Andremont, Tibon31

Cornillot, 2006 ; Greenwood, 2008). En passant dans son laboratoire, il observa une culture de staphylocoque en boîte de Petri* qui avait été inoculée plusieurs semaines auparavant et nota qu'autour d'une grande colonie d'un champignon contaminant, les colonies de staphylocoque devenaient transparentes et étaient manifestement en voie de lyse. Combien de bactériologistes avant lui, avaient négligé une telle boite et son contaminant ? Dans sa publication princeps de 1929, Fleming donna le nom de pénicilline au filtrat de culture du champignon Penicillium notatum responsable de cet Alexander Fleming effet (38). Il précisa son instabilité à (1881-1955) température ambiante, son activité sur les © The Nobel Foundation bactéries (sensibilité ou résistance), son absence de toxicité chez l'animal et signala son utilisation possible dans le traitement des infections bactériennes, mais conclut sur son intérêt pour isoler en laboratoire une bactérie résistante (le bacille de l'influenza) dans les expectorations. On lui reprochera de ne pas avoir pu isoler sous forme active le composé pénicilline, ce qui aurait permis une application thérapeutique. On lui reprochera aussi de s'en servir comme un simple désherbant (en éliminant les bactéries commensales de l'expectoration) afin de faciliter la culture d'un agent soi-disant responsable de la grippe (Haemophilus influenzae) en vue, paraît-il, de préparer un vaccin contre cette affection, suivant les avis de son aîné, Wright. Entre-temps, le Français René Dubos, agronome de formation, travaillait aux États-Unis sur la bactériologie des sols. Sur les conseils de son compatriote Alexis Carrel, il entra dans le laboratoire d'Oswald T. Avery. Après différentes péripéties scientifiques, il isola en 1939, le premier antibiotique, bien que le mot ne soit pas prononcé, à usage thérapeutique recherché, d'un Bacillus du sol (Bacillus brevis) (42). Il s'agissait d'un polypeptide* qui détruit de nombreux cocci à Gram positif : la gramicidine. Mais ce composé est toxique par voie générale (il sera utilisé en solution nasale jusqu'en 2005…) et les sulfamides viennent d'être découverts en 1935 : la chimie des hommes n'a pas encore cédé le pas à la chimie des micro-organismes. La gramicidine fera encore parler d'elle. En 1969 Lipmann et al (52) montreront pour la première fois que la synthèse de certains peptides (ici gramicidine) n’est pas ribosomique, mais requiert
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l'intervention d'enzymes que l'on appellera NRPS (non ribosomal peptide synthases). Puis vint Howard Florey (1898-1968). Ce pathologiste australien travaillait à Oxford où il avait accueilli un jeune chimiste, réfugié juif allemand, Ernst Chain (1906-1979). Guidé par les travaux de Dubos, il reprit l'étude de la pénicilline, purifia le produit, et l'utilisa avec succès dans des infections expérimentales à streptocoque, staphylocoque et Clostridium, agent des gangrènes (43). Les firmes pharmaceutiques anglaises n'étant guère enthousiastes, Florey et un de ses collègues partirent aux États-Unis où trois compagnies pharmaceutiques finirent par s'intéresser à la pénicilline. L'antibiotique fut à la disposition des troupes anglaises et américaines en 1944. Une affiche des laboratoires Schenley proclamait Merci à la Pénicilline…Il reviendra, montrant un médecin militaire injectant de la pénicilline à un soldat blessé. La production s'accéléra et une souche fortement productrice de pénicilline (Penicillium chrysogenum isolé d'un melon pourri) fut préférée. Le coût du million d'unités diminua vertigineusement : de 200 dollars en 1943, il passa à 6 dollars en 1945. En France, la pénicilline G fut à la disposition du corps médical en 1948. Ce fut l'euphorie. En 1950, elle était proposée par onze laboratoires. Elle était partout, dans les pommades, les collyres, les gouttes nasales, les ovules, pourtant n'avait-on pas observé auparavant que la pénicilline était instable à température ambiante ? Même les notices accompagnant le médicament, s'enflammaient : la pénicilline est admirablement tolérée par les enfants ! Il y aurait même eu des bâtons pour les lèvres avec de la pénicilline… pour s'embrasser hygiéniquement. Cependant l'activité était essentiellement limitée aux bactéries à Gram positif et au tréponème de la syphilis : John Mahoney a introduit la pénicilline dans cette indication, en remplacement du traitement par les arsenicaux (Néosalvarsan® que nous avons déjà cité), générateurs d'accidents graves et fréquents. Giuseppe Brotzu (1895-1976), hygiéniste à l'université de Cagliari (Sardaigne) avait observé qu'aucune fièvre typhoïde n'était contractée par les personnes qui se baignaient dans la mer près de l'endroit où se jetaient les égouts, alors que la typhoïde était endémique dans la ville. En 1945, il isola de ces eaux d'égout une souche de champignon (Cephalosporium acremonium) qui inhibait effectivement les salmonelles et publia ses observations en 1948 (48). Plusieurs substances antibiotiques étaient produites par Cephalosporium et Brotzu sollicita, sans succès, des aides financières pour poursuivre ses recherches. Les travaux furent alors repris à Oxford, par l'équipe de Florey : E.P. Abraham (1913-1999) et G.G.F. Newton (1920-1969). Ces derniers isolèrent en 1953, du filtrat de culture une substance que l'on dénomma céphalosporine C qui n'était pas détruite par la pénicillinase et était active non seulement sur les bactéries à Gram
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positif, mais aussi sur des bacilles à Gram négatif (dont les salmonelles) (51). La céphalosporine C sera à l'origine d'une riche lignée de céphalosporines. On rapporte que lorsqu'on demandait à Brotzu s'il voulait des droits exclusifs pour sa découverte, il répondait invariablement : Les droits exclusifs sont à Dieu et l'homme n'est qu'un instrument de la Providence. Tout comme Ehrlich, les chimistes ajoutèrent des groupements variés au noyau bêta-lactame de la pénicilline et de la céphalosporine. Les antibiotiques semi-synthétiques ainsi obtenus permirent de surmonter les résistances qui apparaissaient, d'élargir le spectre d'activité à des bactéries jusque là inaccessibles, et de prolonger la présence d'un effet antibactérien dans l'organisme (cf Tableau des principaux antibiotiques p 319). Mais la pénicilline G était encore récemment prescrite dans la prophylaxie des infections à streptocoque après un rhumatisme articulaire aigu ou dans le traitement de la syphilis. Rapidement d'autres antibiotiques de structure différente furent décrits (Tableau p 321). En 1939, Selman Waksman (1888-1973), microbiologiste du sol reconnu, entreprend de rechercher des micro-organismes produisant des substances antibactériennes et appellera en 1941 (certains disent dès 1932) ces substances "antibiotiques". Il décrit en 1940, l'actinomycine, isolée d'un actinomycète, substance antibactérienne très active mais trop toxique (44). Mais c'est en mettant au point une méthode de criblage (screening) lui permettant d'étudier plusieurs milliers de micro-organismes, qu'il découvre en 1944, avec ses collaborateurs (Albert Schatz en particulier) la streptomycine produite par Streptomyces griseus (46) . Cet antibiotique venait compléter le spectre d'activité de la pénicilline G en étant active sur les bacilles à Gram négatif et surtout sur le bacille de Koch (47), la tuberculose va-t-elle être vaincue ? Une étude clinique anglaise, dans le cadre du Medical Research Council, publiée en 1948 (49, 53), et qui fut parmi les premières études randomisées* au monde, confirme l'amélioration radiologique de sujets tuberculeux après un traitement de six mois. Poursuivant ses travaux, Waksman découvre la néomycine en 1949 (50). Le chloramphénicol (isolé de Streptomyces venezuelae en 1947 par John Ehrlich) est actif à la fois sur les bactéries à Gram positif et négatif et permet enfin de traiter la fièvre typhoïde, et même le typhus. En 1948, l'auréomycine (isolé de Streptomyces aureofasciens par Benjamin Duggar alors âgé de 76 ans) est le chef de file d'une autre famille d'antibiotiques à large spectre. L'antibiotique idéal n'est-il pas déjà là ? D'autres antibiotiques suivirent : la polymyxine (1948), l'oxytétracycline (1950), la colistine (1952), l'érythromycine (1952), la vancomycine (1955), la kanamycine (1957), la rifamycine (1959), l'acide nalidixique (1962) … avec toujours un certain rôle de l'imprévu dans la découverte. En 1958, on
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s'aperçut de l'action bactéricide d'un produit secondaire obtenu au cours de la synthèse d'un antiparasitaire, la chloroquine. Les dérivés de ce produit conduisirent à l'acide nalidixique, chef de file des quinolones. 3-3- Quelques définitions : antibiotique, antibactérien, antiseptique, désinfectant Une substance est dite antibiotique si elle inhibe les bactéries à faible concentration (de l'ordre du millième de milligramme i.e. microgramme μg ou moins, par ml du milieu organique) et si elle n'est pas toxique à cette dose pour l'homme. L'action d'un antibiotique est spécifique, sur une cible précise de la bactérie. Il en résultera que la protection, la modification ou la disparition de la cible entraînera la résistance. Initialement on réservait le terme d'antibiotique (Waksman, 1932/1941) à des substances produites par des micro-organismes et agissant sur d'autres micro-organismes (ainsi de la pénicilline synthétisée par Penicillium chrysogenum), alors que les substances produites par synthèse chimique étaient plutôt des antibactériens (tels les sulfamides). Mais l'usage tend à ne conserver que le terme d'antibiotique. Les antiseptiques sont par contre différents. Schématiquement ils ne sont actifs sur les bactéries et d'autres agents dont les virus, qu'à des doses plus élevées (de l'ordre de 100 à 1000 fois plus par ml que les antibiotiques), doses toxiques pour l'organisme (d'où leur usage essentiellement externe). Leur action, en général peu spécifique, s'exerce sur différentes structures cellulaires (exemple : alcool à 70°). Les désinfectants sont agressifs et utilisés pour traiter des surfaces inertes, des objets tels que les instruments médicaux (exemple : hypochlorite de sodium, eau de Javel).

4- L'action des antibiotiques sur les bactéries
Deux acteurs principaux : l'antibiotique et la bactérie, évoluant dans un environnement éminemment variable, suivant le malade et la maladie (55). 4-1- Les deux protagonistes, l'antibiotique, la bactérie Pour comprendre comment agit un antibiotique, il est plus aisé, dans un premier temps, de mettre en présence seulement les deux protagonistes, l'antibiotique et la bactérie in vitro. Mais il est déjà nécessaire de se mettre dans des conditions voisines de celles obtenues au cours d'un traitement d'une infection aiguë chez l'homme : (i) des concentrations d'antibiotique proches des concentrations sanguines obtenues après une prise d'antibiotique à dose non toxique pour l'organisme (ii) des bactéries en phase de croissance
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: LA CONCENTRATION La CMI correspond à la concentration minimale inhibitrice d'antibiotique donnant un arrêt de la croissance. La CMB correspond à la concentration minimale tuant 99,99 % des bactéries après une exposition en milieu de croissance de 24 h. La CSI est la concentration sub-inhibitrice : elle n'affecte pas la croissance de la bactérie mais provoque le phénomène d'hormesis (une faible dose donne un effet opposé à celui obtenu avec de forte dose) ; elle donne une activation de la transcription* sans affecter la croissance bactérienne (Davies et al) (56). 2- APRÈS ENLÈVEMENT DE L'ANTIBIOTIQUE : L'EFFET POST-ANTIBIOTIQUE PAE. Le PAE correspond au temps durant lequel se maintient l'inhibition de la croissance après disparition de l'antibiotique.
MINIMALE INHIBITRICE CMI ET BACTÉRICIDE CMB.

Figure 6 : CROISSANCE 1-

EN PRÉSENCE D'ANTIBIOTIQUE

Ainsi dans le cas d'une septicémie à staphylocoque doré différentes concentrations de l'antibiotique (pénicilline G, entre 0,01 et 32 mg/L) sont mises en présence d'une culture bactérienne en
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