Transfert des produits phyto....

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Transfert des produits phyto....

Publié le : jeudi 21 juillet 2011
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8
Dosage du glyphosate et de l’AMPA dans l’eau
Comparaison de deux fluorophores : FMOC et NBD-Cl
Determination of glyphosate and AMPA in water
Comparison of two fluorogenic reagents : FMOC and NBD-Cl
R. Colin
1, 2
, E. Le Fur
1
, C. CharrOEteur
1
, C. Dufau
2
, J.J. PØron
2
1
: Centre de GØnie Industriel, Guidel-Plages, 56520 Guidel, France
2
: Laboratoire de Biologie et Chimie MolØculaires, UniversitØ de Bretagne Sud, rue
Saint-maudØ, 56325 Lorient Cedex, France
Résumé
: Le glyphosate, herbicide non sØlectif trLs largement rØpandu, et son principal
mØtabolite l’AMPA, sont deux molØcules trLs solubles dans l’eau et ne peuvent donc pas
OEtre extraites selon des mØthodes classiques. Deux mØthodes de dosage ont ØtØ
dØveloppØes et comparØes, la premiLre pour les dosages de routine, la seconde pour les
dosages de confirmation.
Les deux mØthodes comportent une dØrivation prØ-colonne, la premiLre au FMOC, la
seconde au NBD-Cl, suivie d’une analyse par chromatographie liquide avec dØtection
fluorimØtrique.
AprLs Ølimination des interfØrences, la mØthode au FMOC a ØtØ validØe selon la norme XP
T90-210, sur des Øchantillons rØels. Les essais nous ont permis d’atteindre la limite de
quantification pour le glyphosate et l’AMPA respectivement à 0.06 µg/l et 0.04 µg/l, mOEme
dans des eaux chargØes en matiLres organiques, avec des coefficients de variation
infØrieurs à 20%.
La mØthode au NBD-Cl nous permet d’atteindre la limite de quantification de 1.0 µg/l pour le
glyphosate et 0.10 µg/l pour l’AMPA. Cela montre que la prØ-concentration doit OEtre testØe
pour parvenir à 0.10 µg/l pour le glyphosate.
Abstract
: Two analytical methods were developed and compared for the determination of
glyphosate and its metabolite AMPA in water. The first method is used for current
determination, the second one is used for confirmation.
The both methods involve a pre-column derivatization step, with FMOC for the first one, and
NBD-Cl for the second one. The quantification is performed by liquid chromatography and
fluorescence detection.
Matrix effects were pointed out but the method with FMOC was validated according to the
French standard XP-T90-210. The limit of quantification for glyphosate and AMPA was
respectively 0.06 μg/l and 0.04 μg/l, with relative standard deviation under 20%.
For the method with NBD-Cl, the limit of quantification was estimated at 1 μg/l level for
glyphosate and 0.1 μg/l level for AMPA, showing that pre-concentration has to be tested to
improve the quantification.
Mots-clés
: glyphosate – AMPA – eau - analyse – chromatographie - fluorescence - FMOC
– NBD-Cl
Keywords
: glyphosate – AMPA – water - analysis – chromatography - fluorescence –
FMOC – NBD-Cl
9
Introduction
Le glyphosate est une molØcule herbicide amphotLre, de faible poids molØculaire
(169.1 g/mol.), qui peut exister sous diffØrentes formes ioniques selon l’influence
du pH sur ses groupes fonctionnels (acide carboxylique, acide phosphonique et
amine secondaire), ce qui la rend facilement soluble dans l’eau (12 g/l à 25°C).
Par consØquent, les mØthodes d’extraction liquide-liquide conventionnelles ne
peuvent s’appliquer à l’analyse de ce composØ. Ajoutons que cette molØcule se
dØgrade facilement en libØrant l’AMPA sous forme d’amine primaire.
Pour doser le glyphosate et l’AMPA nous avons exploitØ la capacitØ de deux
fluorophores à rØagir dans l’eau sur des amines primaires ou secondaires en
produisant des dØrivØs fluorescents trLs sensibles au dØtecteur fluorimØtrique.
1. Méthode de référence
Le FMOC Øtant trLs largement ØvoquØ dans la littØrature [1, 2, 3] nous avons
choisi, dans un premier temps, de dØvelopper et d’amØliorer une mØthode de
chromatographie liquide [1] en utilisant le FMOC comme rØactif de dØrivation
prØcolonne, sans prØconcentration de l’Øchantillon.
Pour cela nous avons focalisØ nos efforts sur la rØduction des interfØrences de
matrices.
Le FMOC agit avec le glyphosate ou l’AMPA par attaque du doublet libre de
l’amine secondaire ou primaire sur la fonction chlorure d’acyle du FMOC.
Fig. n° 1 : Substitution nucléophile du glyphosate (2) avec le FMOC (1)
Le protocole analytique est rØsumØ en figure 2. La prise d’essai requiert seulement
3 ml d’Øchantillon, qui doit OEtre alcalinisØ à l’aide d’un tampon borate. Pour
optimiser la dØrivation il faut en effet alcaliniser le milieu rØactionnel dans le but de
fixer le doublet libre de l’azote.
C
H
O
H
C
O
Cl
OH
P
O
H
CH
2
NH
CH
2
C
OH
O
O
+
C
H
O
H
C
O
OH
P
O
H
CH
2
N
CH
2
C
OH
O
O
+
HCl
(1)
(2)
10
La dØrivation de cette phase aqueuse est rapide, 30 minutes à 20°C, mais une
Øtape de lavage prØ-dØrivation à l’Øther Øthylique est nØcessaire pour Øliminer le
maximum d’interfØrents organiques pouvant nuire à la spØcificitØ de la mØthode.
Une Øtape de lavage post-dØrivation a Øgalement ØtØ introduite pour Øliminer
l’excLs de FMOC prØsent dans la phase aqueuse, mais en prØservant les produits
de la dØrivation glyphosate-FMOC et AMPA-FMOC.
Echantillonnage :
3 ml d’Øchantillon
+ 0.5 ml de tampon Na
2
B
4
O
7
, 10 H
2
O
0.05 M (pH 9.2)
Lavage :
Ether Øthylique 3 ml
Agitation 2 min, dØcantation 15 min
DØrivation :
Phase aqueuse 1.5 ml
FMOC (1 g/l dans acØtonitrile) 250 µl
AcØtonitrile 250 µl
30 min à 20°C
Lavage :
Acidification phase aqueuse par tampon
phosphate pH 2 (140 µl)
Ajout 3 ml d’Øther Øthylique
Agitation 2 min, dØcantation 1 heure
RØcupØration phase aqueuse pour analyse
ou congØlation
Chromatographie :
Colonne NH
2
250 × 3 mm, 5 µm
Phase mobile :
KH
2
PO
4
0.05 M, pH 5.7/ACN, 70/30
DØbit 0.42 ml/min
DØtection :
Fluorescence
Ex. 260 nm, Em. 310 nm
Fig. n° 2 : Protocole d’analyse du glyphosate et de l’AMPA dans l’eau.
Méthode au FMOC
Le point critique de ce protocole d’analyse est l’Øtape de lavage prØ-dØrivation dont
l’utilitØ est illustrØe par le tableau 1.
11
La pente de la droite d’Øtalonnage couramment dØterminØ dans de l’eau purifiØe
(exempte de matiLres organiques et minØrales) est proche 10
6
pour un
recouvrement de 100%. Si nous analysons une eau de rØseau sans lavage prØ-
dØrivation, la pente est divisØe par deux. Par contre, si nous procØdons à ce
lavage la pente retrouve une valeur proche 10
6
.
Nature de l’Øchantillon
Lavage à l’Øther
Pente
Recouvrement (%)
Eau purifiØe
Eau de rØseau
Eau de rØseau
Eau de rØseau
Eau de rØseau
Eau de rØseau
Non
Non
Oui
Oui
Oui
Oui
1099856
496771
892332
961443
1040989
953449
100
45
82
88
95
87
Tableau n° 1 : Effet de la matrice organique et du lavage pré-dérivation
Grâce au lavage prØ-dØrivation, à fortiori dans les eaux naturelles, nous obtenons
des chromatogrammes trLs exploitables, mOEme à des valeurs de concentrations
infØrieures à la limite de qualitØ des eaux destinØes à la consommation humaine
(figure 3).
Pour analyser l’AMPA par cette mØthode, il a fallu introduire un lavage post-
dØrivation puisque le temps de rØtention de l’AMPA correspondait à la fin du temps
de rØtention du FMOC. Les conditions de pH de la phase aqueuse du milieu post-
dØrivation ont donc ØtØ optimisØes pour Øliminer l’excLs de FMOC tout en
prØservant le glyphosate et l’AMPA dØrivØs.
Fig. n° 3 : Chromatogramme de glyphosate (0.07 μg/l) et AMPA (0.08 μg/l) dans
une eau naturelle, obtenu après lavage pré-dérivation et lavage post-dérivation
En plus des matiLres organiques, nous avons constatØ des effets d’ions sur la
spØcificitØ de la mØthode.
12
Les pentes obtenues sont diffØrentes selon les caractØristiques minØrales des
eaux. La pente la plus faible est obtenue pour une eau d’Evian (TH = 29.4 dgF), la
pente la plus forte est obtenue pour une eau purifiØe. Les pentes intermØdiaires
correspondent à une eau de rØseau et l’eau de Volvic (TH = 5 dgF) (figure 4).
Nous supposons donc que c’est la concentration en ions Ca, Mg qui provoque
notre problLme de spØcificitØ.
Fig. n° 4 : Effet de la matrice minérale
Pour s’affranchir de cet effet de matrice nous avons choisi d’effectuer les analyses
par ajouts dosØs et nous avons validØ la mØthode selon la norme XPT-90 210.
La mØthode est linØaire sur la gamme 0.10 – 2.00 µg/l avec un coefficient de
variation infØrieur à 20%.
Les limites de dØtection et de quantification sont respectivement de 0.04 µg/l et
0.06 µg/l pour le glyphosate, 0.01 µg/l et 0.04 µg/l pour l’AMPA. La spØcificitØ de la
mØthode est rØsolue par la mØthode des ajouts dosØs.
2. Méthode alternative
La deuxiLme partie de notre travail a consistØ à dØvelopper une mØthode de
confirmation, et nous avons focalisØ nos efforts sur la fonction amine du
glyphosate et de l’AMPA, potentiellement rØactive par attaque du doublet libre de
l’azote sur le site vacant du carbocation [4,5,6,7] (figure 5).
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
concentration (μg/L)
a
r
e
a
pure water
treated water
Evian mineral water
Volvic mineral water
13
Fig. n° 5 : Substitution nucléophile aromatique du glyphosate (1) avec l’AMPA (2)
Le protocole analytique est dØcrit en figure 6.
Echantillonnage :
750 µl d’Øchantillon
+ 125 µl de tampon Na
2
B
4
O
7
, 10 H
2
O
0.125 M (pH 9.2)
DØrivation :
250 µl de rØactif de d dØrivation
(NBD-Cl 4 g/l dans Øthanol)
1 heure à 60°C
AprLs refroidissement, ajout de 100 µl de
HCl 0.5 N
Chromatographie :
Colonne NH
2
250 × 3 mm, 5 µm
Phase mobile :
K
2
HPO
4
0.03 M, pH 3/ACN, 50/50
DØbit 0.42 ml/min
DØtection :
Fluorescence
Ex. 490 nm, Em. 550 nm
Fig. n° 6 : Protocole d’analyse du glyphosate et de l’AMPA dans l’eau. Méthode au
NBD-Cl
Notons que la prise d’essai d’Øchantillon nØcessite un minimum de volume mais
doit OEtre alcalinisØe avec un tampon borate pour favoriser la rØaction de dØrivation
à 60°C ; ajoutons qu’il faut acidifier le milieu rØactionnel pour terminer la dØrivation
afin d’Øviter la production de dØrivØs secondaires.
Pour optimiser la dØrivation au NBD-Cl et obtenir les meilleures conditions
chromatographiques, nous avons synthØtisØ et isolØ le produit de dØrivation. Les
pics chromatographiques obtenus avec le produit synthØtique pur ont donc ØtØ
comparØs aux pics obtenus par dØrivation
in situ
.
HO
2
C
C
H
2
NH CH
2
P
O
OH
OH
N
O
N
C
l
NO
2
N
O
N
NO
2
N
C
H
2
P
O
OH
OH
CH
2
HO
2
C
+
+
HCl
(1)
(2)
14
Cette dØmarche a facilitØ l’obtention d’un rendement optimal de dØrivation
in situ
en Øtudiant sØparØment le pH, la concentration en NBD-Cl, le temps et la
tempØrature de dØrivation.
Le point critique a ØtØ de dØterminer le pH optimum et la concentration en tampon
borate adØquate nØcessaire à neutraliser la libØration de l’acide engendrØ lors de
la rØaction. La figure 7 montre que la dØrivation est proche de 100% pour une
rØaction d’une heure à 60°C, avec un tampon borate à 0.125 M.
Pour vØrifier l’efficacitØ de nos conditions ainsi dØterminØes, nous avons prØparØ
des Øchantillons d’eau pure dopØe par du glyphosate et d’autres Øchantillons d’eau
pure dopØe par du glyphosate dØrivØ de synthLse.
Les comparaisons ont ØtØ effectuØes en dØterminant le facteur de rØponse obtenu
en analyse (reprØsentant le rapport de l’aire des pics (u.a.)/quantitØ de glyphosate
injectØ). Le facteur moyen obtenu pour les Øchantillons dopØs par du glyphosate
est proche de 2.2×10
6
u.a./ng ; celui obtenu pour les Øchantillons dopØs par du
glyphosate de synthLse est proche de 2.3×10
6
u.a./ng. Le coefficient de variation
obtenu est proche de 6%.
Cela montre que la dØrivation in situ est rØalisØe efficacement dans les conditions
requises.
Fig . n° 7 : Optimisation de la concentration en tampon borate et du pH
Par
ailleurs,
nous
avons
optimisØ
les
conditions
de
sØparation
(voir
chromatogramme prØsentØ en figure 8). Ainsi, par rapport à la mØthode au FMOC,
la phase mobile a ØtØ modifiØe :
La proportion de phase aqueuse dans la phase mobile a ØtØ diminuØe pour rØduire
le temps de rØtention du glyphosate (comportement de type phase inverse).
Le KH
2
PO
4
a ØtØ remplacØ par le K
2
HPO
4
. Cela a permis, pour une mOEme
concentration en tampon, d’augmenter la force ionique de la phase mobile et par
consØquent d’augmenter sa force Øluante (comportement de type Øchange d’ions).
0
20
40
60
80
100
120
0
1
2
3
4
Tim e (hours)
Y
i
e
l
d
o
f
t
h
e
d
e
r
i
v
a
t
i
z
a
t
i
o
n
pH 9,25; C = 0,025 M
pH 9,75; C = 0,025 M
pH 9,25; C = 0,125 M
15
Fig. n° 8 : Chromatogramme de glyphosate 17 μg/l et AMPA 0.8 μg/l dans l’eau
purifiée
Conclusion
Notre laboratoire dispose d’une mØthode de routine validØe et largement ØprouvØe
pour analyser le glyphosate et l’AMPA, à des teneurs infØrieures à 0.10 µg/l, sans
Øtape d’extraction ou de purification.
Cette mØthode donne de meilleurs rØsultats que la mØthode au NBD-Cl. En effet,
la comparaison FMOC/NBD-Cl nous fournit un rapport de rØponse proche de 10 en
faveur de la mØthode FMOC pour le glyphosate et un rapport de rØponse proche
de 2.5 en faveur de la mØthode FMOC pour l’AMPA.
Cela implique que la mØthode au NBD-Cl est envisageable seulement aprLs prØ-
concentration.
Bibliographie
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