A general model that explains the complex pattern of biallelic APC mutations in colorectal carcinoma, duodenal and desmoid tumours [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Eva Maria Kohler

De
       A general model that explains the complex pattern of biallelic APC mutations in colorectal carcinoma, duodenal and desmoid tumours.           Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich‐Alexander‐Universität Erlangen‐Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades            vorgelegt von Eva Maria Kohler aus Nürnberg         Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der   Universität Erlangen‐Nürnberg                  Tag der mündlichen Prüfung: 16. Dezember 2008  Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch  Erstberichterstatter: Prof. Dr. Jürgen Behrens  Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Thomas Winkler   II INDEX  1. SUMMARY......................................................................................................................................................1 2. ZUSAMMENFASSUNG.2 3. INTRODUCTION............3 3.1 THE ADENOMA – CARCINOMA SEQUENCE IN COLORECTAL CANCER.........................................................3 3.2 THE TUMOUR SUPPRESSOR APC..................................................................................................................3 3.2.1 Gene and protein structure of APC......................................................................................................3 3.2.2 APC in the canonical Wnt signalling pathway...............................................
Publié le : jeudi 1 janvier 2009
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       A general model that explains the complex pattern of biallelic APC mutations in colorectal carcinoma, duodenal and desmoid tumours.           Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten 
der FriedrichAlexanderUniversität ErlangenNürnberg zur Erlangung des Doktorgrades            vorgelegt von Eva Maria Kohler aus Nürnberg  
      
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der   Universität ErlangenNürnberg 
                 Tag der mündlichen Prüfung: 16. Dezember 2008  Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch  Erstberichterstatter: Prof. Dr. Jürgen Behrens  Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Thomas Winkler   
 
II
INDEX  
1. SUMMARY ...................................................................................................................................................... 1 
2. ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................................................ 2 
3. INTRODUCTION........................................................................................................................................... 3 
3.1 THE ADENOMA  CARCINOMA SEQUENCE IN COLORECTAL CANCER......................................................... 3 3.2 THE TUMOUR SUPPRESSOR APC.................................................................................................................. 3 3.2.1 Gene and protein structure of APC...................................................................................................... 3 3.2.2 APC in the canonical Wnt signalling pathway.................................................................................... 5 3.2.3 Mutations in the Wnt pathway ............................................................................................................ 7 3.3 AIM OF THIS WORK..................................................................................................................................... 10 
4. RESULTS ........................................................................................................................................................ 11 
4.1 ANALYSIS OF THE BINDING CAPACITY OFΒCATENIN TO APC ................................................................ 11 4.1.1 Introduction of mutations in theβ‐catenin binding regions of APC ................................................. 12 4.1.2 itagitnoIesnv of the binding capacity of the 20R2 toβ‐catenin .......................................................... 14 4.1.3 nIevnioatigst of the binding capacity of the 20R3 toβ‐ 16catenin .......................................................... 4.2 ANALYSIS OF THE DEGRADATION CAPACITY OF TRUNCATED APC ......................................................... 20 4.2.1β‐Catenin degrading APC truncations .............................................................................................. 20 4.2.2 Amino acids 14041466 are critical forβ‐catenin degradation .......................................................... 23 4.2.3 The activity of the CID is cellspecific ................................................................................................ 25 4.2.4 APC constructs lacking the CID interfere with β‐catenin ionadatdegr stimulated by constructs containing it ................................................................................................................................................ 27 4.2.5 Different APC constructs targeting β‐catenin for rgedtadanoi are ffdieneraltily inhibited by APC constructs lacking the CID.......................................................................................................................... 29 4.2.6 The CID explains the mutation pattern found in tumours from FAP patients ................................. 29 4.2.7 The CID explains the mutation pattern found in sporadic colorectal tumours.................................. 33 
5. DISCUSSION ................................................................................................................................................ 34 
5.1 THE 20R2 DOES NOT BIND TOΒCATENIN................................................................................................. 34 5.2 FUNCTIONAL DEFINITION OF THE MCR OF APC IN COLORECTAL TUMOURS......................................... 35 5.3 IDENTIFICATION AND CHARACTERISATION OF A NEW DOMAIN OF APC ................................................ 37 5.4 INHIBITION OF THE CID............................................................................................................................. 39 5.5 A MODEL FOR THE SELECTION OF APC MUTATIONS................................................................................ 40 5.6 FURTHER TASKS.......................................................................................................................................... 42 
6. MATERIALS AND  43METHODS ................................................................................................................. 
 
6.1 MATERIALS................................................................................................................................................ 43 6.1.1 Technical  43Equipment .......................................................................................................................... 6.1.2 Chemicals............................................................................................................................................ 43 6.1.3 Enzymes ............................................................................................................................................. 44 6.1.4 Kits ..................................................................................................................................................... 44 6.1.5 Buffers and media ............................................................................................................................... 44 6.1.6 Organisms .......................................................................................................................................... 48 6.1.7 Antibodies........................................................................................................................................... 49 6.1.8 Oligonucleotides ................................................................................................................................. 50 6.1.9 Plasmids ............................................................................................................................................. 52 6.2 METHODS................................................................................................................................................... 53 6.2.1 Standard methods ............................................................................................................................... 53 6.2.2 Cloning and mutagenesis ................................................................................................................... 53 6.2.3 Transient transfections....................................................................................................................... 57 6.2.4 Conoitatipmmicireopun and Western Blot ....................................................................................... 57 
III
6.2.5 cserecneonumoulfIm stainings ........................................................................................................... 58 6.2.6 Reporter  59assays ................................................................................................................................... 6.2.7 Yeast Two Hybrid screening .............................................................................................................. 59 
7. LITERATURE................................................................................................................................................. 61 
8. TIONVEAIBARB INDEX ............................................................................................................................ 71 
8.1 ABBREVIATIONS......................................................................................................................................... 71 8.2 UNITS......................................................................................................................................................... 72 8.3 DIMENSIONS............................................................................................................................................... 72 8.4 AMINO ACIDS............................................................................................................................................. 73 
9. ANNEX............................................................................................................................................................ 74 
DNASequence of APC ............................................................................................................................... 74 APC constructs ........................................................................................................................................... 76 Vector map mYFAPC constructs............................................................................................................... 78 Vector map mRF‐β‐catenin ......................................................................................................................... 79 
10. PUBLICATIONS ......................................................................................................................................... 80 
DANKSAGUNG ............................................................................................................................................... 81 
LEBENSLAUF .................................................................................................................................................... 82 
      
 
IV
1. Summary 
1. SUMMARY  
 Inactivation of the tumour suppressor APC is an initial event in the development of 
colorectal cancer, as it leads to an inadequate activation of the Wnt signalling pathway which 
disturbs the cellular homeostasis of the colon epithelium. 
 
Up to now a plethora of data has been collected describing APC mutations in human 
gastrointestinal tumours. Several studies summarize germline and somatic mutations of 
single tumours from FAP patients. But all those studies could only describe an association of 
mutational hits without being able to explain them functionally. The aim of this work was, to 
reveal the molecular basis on which tumour cells are selected for distinct genetic alterations, 
conferring them the selective advantage which transforms them into a tumour. My data 
indicates that the binding ability of APC toβ‐catenin is critical for the selection of mutations 
and proofs that there is no selective pressure to retain or delete the second 20 amino acid 
repeat (20R2) because this domain does not bind to β‐catenin in vivo. In addition, I could 
show that there is a strong negative selection for APC mutations that retain the third 20 aa 
repeat (20R3). Thereby the 3 border of the mutation cluster region (MCR) of APC could be 
refined by analyzing the binding abilities of the 20R3 toβ‐catenin. In the second part of my 
work, I could define a region of APC, which is critical for the degradation of β‐catenin. 
Interestingly, this newly defined β‐Catenin Inhibitory Domain of APC (CID), is counter 
selected in colorectal tumours, but retained in desmoid and upper gastrointestinal tumours. 
In this line, we have also observed, that APC truncations containing the CID can be inhibited 
in their ability to degradeβ‐catenin by shorter constructs lacking this domain. When this is 
taken into account, nearly all mutation patterns found in FAP patients as well as in sporadic 
colon carcinoma can be explained by either a negative selection for the CID or by the positive 
selection for a second truncating mutation which is able to neutralize the CIDcontaining 
truncation. This resulted in a set of three rules, which explain nearly all mutations found in 
colorectal carcinoma: First, the first 20 amino acid repeat (20R1) has to be retained. Second, 
the 20R3 has to be excluded. Third, the CID has to be inactivated.  
 
  
 
1
2. Zusammenfassung 
2. ZUSUSGNMAEMFNSA  
 Inaktivierung des Tumorsuppressors APC ist ein initiales Ereignis in der Entstehung von 
Darmkrebs, da sie zu einer unangemessenen Aktivierung des Wnt Signalweges führt, was 
wiederum die zelluläre Homöostase des Darmepithels stört. Bislang wurde eine Fülle an 
Daten gesammelt, die APCMutationen in menschlichen gastrointestinalen Tumoren 
beschreiben. Mehrere Studien listen Keimbahnund somatische Mutationen einzelner 
Tumore von FAP Patienten auf. Aber all diese Studien konnten nur eine Assoziation von 
Mutationen beschreiben, ohne diese funktionell erklären zu können. Das Ziel dieser Arbeit 
war, die molekulare Grundlage zu enthüllen, auf der Tumorzellen für bestimmte genetische 
Veränderungen selektiert werden, die ihnen einen tumorigenen Selektionsvorteil 
verschaffen. Meine Daten zeigen, dass die Bindefähigkeit von APC an β‐Catenin 
entscheidend für die Selektion von Mutationen ist und beweisen, dass kein selektiver Druck 
besteht, das zweite 20 Aminosäure Motiv (20R2) zu behalten oder zu deletieren, weil diese 
Domäne in vivo nicht an β‐Catenin bindet. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass eine 
starke negative Selektion für APCMutationen existiert, die das dritte 20 Aminosäure Motiv 
(20R3) behalten. Indem die Bindefähigkeit von 20R3 an β‐Catenin analysiert wurde, konnte 
die 3 Grenze der Mutationsclusterregion (MCR) von APC präziser definiert werden. Im 
zweiten Teil meiner Arbeit konnte ich eine Region von APC identifizieren, die entscheidend 
für den Abbau von β‐Catenin ist. Interessanterweise wird diese neu definierte β‐Catenin 
Inhibitorische Domäne von APC (CID) in kolorektalen Karzinomen negativ selektiert, aber in 
desmoiden Tumoren und Tumoren des oberen Verdauungstraktes positiv selektiert. In 
diesem Zusammenhang haben wir auch beobachtet, dass APCTrunkierungen, die die CID 
enthalten, in ihrer Fähigkeit β‐Catenin abzubauen gestört werden können durch kürzere 
Konstrukte, denen diese Domäne fehlt. Wenn man dies berücksichtigt können fast alle 
Mutationsmuster, die in FAP Patienten sowie in sporadischen Kolontumoren gefunden 
worden sind, erklärt werden. Dies geschieht entweder durch eine negative Selektion für die 
CID oder durch eine positive Selektion zugunsten einer zweiten trunkierenden Mutation, die 
in der Lage ist, die CIDenthaltende Trunkierung zu neutralisieren. Dies resultierte in drei 
Regeln, die beinahe alle Mutationen in kolorektalen Karzinomen erklären können: Erstens 
muss das erste 20 Aminosäure Motiv positiv selektiert werden. Zweitens muss 20R3 negativ 
selektiert werden. Drittens muss die CID inaktiviert werden.  
 
2
3. INTRODUCTION  
3. Introduction  Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Colon cancer is the second most 
common cancer in Germany, both for women and men, with an estimated incidence number 
of more than 70.000 cases per year in Germany [Gesellschaft der epidemiologischen 
Krebsregister in Deutschland e. V., 2006]. The lifetime colorectal cancer risk is about 5 % and 
increases dramatically with age: By an age of 70, about 50 % of the Western population will 
have developed an adenoma [Fodde et al. 2001].  
 
3.1 The adenoma  carcinoma sequence in colorectal cancer 
In a healthy human colon, a permanent renewal of epithelial cells takes place. The 
asymmetrically dividing stem cells are localised at the base of each crypt. Newly divided 
cells differentiate while they migrate slowly upwards and finally die by apoptosis after 3  5 
days [Potten and Loeffler 1987]. In colorectal cancer this balance between proliferation and 
apoptosis is disturbed in favour of an increased mitosis rate and reduced apoptosis, which 
leads to the development of a polyp, a benign tumour mass that protrudes into the lumen of 
the gut. Such a benign adenoma may develop into an invasive carcinoma. The molecular 
basic principles for these cellular changes are meanwhile roughly understood. It is known 
that at least three socalled tumoursuppressor genes (APC, SMAD4, p53) plus one oncogene 
(KRAS) are the main targets for a mutation that will lead to colon cancer. Moreover, it is 
known that the specific genetic hits often occur in a distinct temporal order [Vogelstein et 
al. 1988, Fearon and Vogelstein 1990, Cho and Vogelstein 1992]. Mutations in the APC gene 
are the earliest genetic alterations during genesis of colorectal tumours and initiate the 
adenomacarcinoma sequence [Powell et al. 1992].  
 
3.2 The tumour suppressor APC  
3.2.1 Gene and protein structure of APC The first clue to localizing the position of the APC gene was the identification of a deletion of 
the chromosomal band 5q21 in a patient with colorectal polyposis in 1986 [Herrera et al. 
1986]. APC was cloned and further characterised in 1991 [Groden et al. 1991, Kinzler et al. 
 
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