A general model that explains the complex pattern of biallelic APC mutations in colorectal carcinoma, duodenal and desmoid tumours [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Eva Maria Kohler

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• Publié le: 01 janvier 2009
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Extrait

              A general model that explains the complex pattern of  biallelic APC mutations in colorectal carcinoma,  duodenal and desmoid tumours.                     Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten 

der Friedrich‐Alexander‐Universität Erlangen‐Nürnberg  zur  Erlangung des Doktorgrades                        vorgelegt von  Eva Maria Kohler  aus Nürnberg   

                         

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der     Universität Erlangen‐Nürnberg 

                                  Tag der mündlichen Prüfung: 16. Dezember 2008    Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch    Erstberichterstatter: Prof. Dr. Jürgen Behrens    Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Thomas Winkler      

 

II

I NDEX    

1. SUMMARY ...................................................................................................................................................... 1  

2. ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................................................ 2  

3. INTRODUCTION........................................................................................................................................... 3  

3.1   T HE ADENOMA    CARCINOMA SEQUENCE IN COLORECTAL CANCER ......................................................... 3   3.2   T HE TUMOUR SUPPRESSOR  APC.................................................................................................................. 3   3.2.1 Gene and protein structure of APC...................................................................................................... 3   3.2.2 APC in the canonical Wnt signalling pathway.................................................................................... 5   3.2.3 Mutations in the Wnt pathway ............................................................................................................ 7   3.3   A IM OF THIS WORK ..................................................................................................................................... 10  

4. RESULTS ........................................................................................................................................................ 11  

4.1   A NALYSIS OF THE BINDING CAPACITY OFΒ ‐ CATENIN TO  APC ................................................................ 11   4.1.1 Introduction of mutations in theβ‐catenin binding regions of APC ................................................. 12   4.1.2 itagitnoIesnv of the binding capacity of the 20R2 toβ‐catenin .......................................................... 14   4.1.3 nIevnioatigst of the binding capacity of the 20R3 toβ‐ 16catenin ..........................................................   4.2   A NALYSIS OF THE DEGRADATION CAPACITY OF TRUNCATED  APC ......................................................... 20   4.2.1β‐Catenin degrading APC truncations .............................................................................................. 20   4.2.2 Amino acids 1404‐1466 are critical forβ‐catenin degradation .......................................................... 23   4.2.3 The activity of the CID is cell‐specific ................................................................................................ 25   4.2.4 APC constructs lacking the CID interfere with β‐catenin ionadatdegr stimulated by constructs  containing it ................................................................................................................................................ 27   4.2.5 Different APC constructs targeting β‐catenin for rgedtadanoi are ffdieneraltily inhibited by APC  constructs lacking the CID.......................................................................................................................... 29   4.2.6 The CID explains the mutation pattern found in tumours from FAP patients ................................. 29   4.2.7 The CID explains the mutation pattern found in sporadic colorectal tumours.................................. 33  

5. DISCUSSION ................................................................................................................................................ 34  

5.1   T HE  20R2  DOES NOT BIND TOΒ ‐ CATENIN ................................................................................................. 34   5.2   F UNCTIONAL DEFINITION OF THE  MCR  OF  APC  IN COLORECTAL TUMOURS ......................................... 35   5.3   I DENTIFICATION AND CHARACTERISATION OF A NEW DOMAIN OF  APC ................................................ 37   5.4   I NHIBITION OF THE  CID............................................................................................................................. 39   5.5   A  MODEL FOR THE SELECTION OF  APC  MUTATIONS ................................................................................ 40   5.6   F URTHER TASKS .......................................................................................................................................... 42  

6. MATERIALS AND  43METHODS .................................................................................................................  

 

6.1   M ATERIALS ................................................................................................................................................ 43   6.1.1 Technical  43Equipment ..........................................................................................................................   6.1.2 Chemicals............................................................................................................................................ 43   6.1.3 Enzymes ............................................................................................................................................. 44   6.1.4 Kits ..................................................................................................................................................... 44   6.1.5 Buffers and media ............................................................................................................................... 44   6.1.6 Organisms .......................................................................................................................................... 48   6.1.7 Antibodies........................................................................................................................................... 49   6.1.8 Oligonucleotides ................................................................................................................................. 50   6.1.9 Plasmids ............................................................................................................................................. 52   6.2   M ETHODS ................................................................................................................................................... 53   6.2.1 Standard methods ............................................................................................................................... 53   6.2.2 Cloning and mutagenesis ................................................................................................................... 53   6.2.3 Transient transfections....................................................................................................................... 57   6.2.4 Co‐noitatipmmicireopun and Western Blot ....................................................................................... 57  

III

6.2.5 cserecneonumoulfIm stainings ........................................................................................................... 58   6.2.6 Reporter  59assays ...................................................................................................................................   6.2.7 Yeast Two Hybrid screening .............................................................................................................. 59  

7. LITERATURE................................................................................................................................................. 61  

8. TIONVEAIBARB INDEX ............................................................................................................................ 71  

8.1   A BBREVIATIONS ......................................................................................................................................... 71   8.2   U NITS ......................................................................................................................................................... 72   8.3   D IMENSIONS ............................................................................................................................................... 72   8.4   A MINO ACIDS ............................................................................................................................................. 73  

9. ANNEX............................................................................................................................................................ 74  

DNA‐Sequence of APC ............................................................................................................................... 74   APC constructs ........................................................................................................................................... 76   Vector map mYF‐APC constructs............................................................................................................... 78   Vector map mRF‐β‐catenin ......................................................................................................................... 79  

10. PUBLICATIONS ......................................................................................................................................... 80  

DANKSAGUNG ............................................................................................................................................... 81  

LEBENSLAUF .................................................................................................................................................... 82  

           

 

IV

1. Summary 

1.   S UMMARY    

  Inactivation of the tumour suppressor APC is an initial event in the development of 

colorectal cancer, as it leads to an inadequate activation of the Wnt signalling pathway which 

disturbs the cellular homeostasis of the colon epithelium. 

 

Up to now a plethora of data has been collected describing APC mutations in human 

gastrointestinal tumours. Several studies summarize germline and somatic mutations of 

single tumours from FAP patients. But all those studies could only describe an association of 

mutational hits without being able to explain them functionally. The aim of this work was, to 

reveal the molecular basis on which tumour cells are selected for distinct genetic alterations, 

conferring them the selective advantage which transforms them into a tumour. My data 

indicates that the binding ability of APC toβ‐catenin is critical for the selection of mutations 

and proofs that there is no selective pressure to retain or delete the second 20 amino acid 

repeat (20R2) because this domain does not bind to β‐catenin in vivo. In addition, I could 

show that there is a strong negative selection for APC mutations that retain the third 20 aa 

repeat (20R3). Thereby the 3 border of the mutation cluster region (MCR) of APC could be 

refined by analyzing the binding abilities of the 20R3 toβ‐catenin. In the second part of my 

work, I could define a region of APC, which is critical for the degradation of β‐catenin. 

Interestingly, this newly defined β‐Catenin Inhibitory Domain of APC (CID), is counter 

selected in colorectal tumours, but retained in desmoid and upper gastrointestinal tumours. 

In this line, we have also observed, that APC truncations containing the CID can be inhibited 

in their ability to degradeβ‐catenin by shorter constructs lacking this domain. When this is 

taken into account, nearly all mutation patterns found in FAP patients as well as in sporadic 

colon carcinoma can be explained by either a negative selection for the CID or by the positive 

selection for a second truncating mutation which is able to neutralize the CID‐containing 

truncation. This resulted in a set of three rules, which explain nearly all mutations found in 

colorectal carcinoma: First, the first 20 amino acid repeat (20R1) has to be retained. Second, 

the 20R3 has to be excluded. Third, the CID has to be inactivated.  

 

   

 

1

2. Zusammenfassung 

2.   Z USUSGNMAEMFNSA    

  Inaktivierung des Tumorsuppressors APC ist ein initiales Ereignis in der Entstehung von 

Darmkrebs, da sie zu einer unangemessenen Aktivierung des Wnt Signalweges führt, was 

wiederum die zelluläre Homöostase des Darmepithels stört. Bislang wurde eine Fülle an 

Daten gesammelt, die APC‐Mutationen in menschlichen gastrointestinalen Tumoren 

beschreiben. Mehrere Studien listen Keimbahn‐und somatische Mutationen einzelner 

Tumore von FAP Patienten auf. Aber all diese Studien konnten nur eine Assoziation von 

Mutationen beschreiben, ohne diese funktionell erklären zu können. Das Ziel dieser Arbeit 

war, die molekulare Grundlage zu enthüllen, auf der Tumorzellen für bestimmte genetische 

Veränderungen selektiert werden, die ihnen einen tumorigenen Selektionsvorteil 

verschaffen. Meine Daten zeigen, dass die Bindefähigkeit von APC an β‐Catenin 

entscheidend für die Selektion von Mutationen ist und beweisen, dass kein selektiver Druck 

besteht, das zweite 20 Aminosäure Motiv (20R2) zu behalten oder zu deletieren, weil diese 

Domäne in vivo nicht an β‐Catenin bindet. Darüber hinaus konnte ich zeigen, dass eine 

starke negative Selektion für APC‐Mutationen existiert, die das dritte 20 Aminosäure Motiv 

(20R3) behalten. Indem die Bindefähigkeit von 20R3 an β‐Catenin analysiert wurde, konnte 

die 3 Grenze der Mutationsclusterregion (MCR) von APC präziser definiert werden. Im 

zweiten Teil meiner Arbeit konnte ich eine Region von APC identifizieren, die entscheidend 

für den Abbau von β‐Catenin ist. Interessanterweise wird diese neu definierte β‐Catenin 

Inhibitorische Domäne von APC (CID) in kolorektalen Karzinomen negativ selektiert, aber in 

desmoiden Tumoren und Tumoren des oberen Verdauungstraktes positiv selektiert. In 

diesem Zusammenhang haben wir auch beobachtet, dass APC‐Trunkierungen, die die CID 

enthalten, in ihrer Fähigkeit β‐Catenin abzubauen gestört werden können durch kürzere 

Konstrukte, denen diese Domäne fehlt. Wenn man dies berücksichtigt können fast alle 

Mutationsmuster, die in FAP Patienten sowie in sporadischen Kolontumoren gefunden 

worden sind, erklärt werden. Dies geschieht entweder durch eine negative Selektion für die 

CID oder durch eine positive Selektion zugunsten einer zweiten trunkierenden Mutation, die 

in der Lage ist, die CID‐enthaltende Trunkierung zu neutralisieren. Dies resultierte in drei 

Regeln, die beinahe alle Mutationen in kolorektalen Karzinomen erklären können: Erstens 

muss das erste 20 Aminosäure Motiv positiv selektiert werden. Zweitens muss 20R3 negativ 

selektiert werden. Drittens muss die CID inaktiviert werden.  

 

2

3.   I NTRODUCTION    

3. Introduction    Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Colon cancer is the second most 

common cancer in Germany, both for women and men, with an estimated incidence number 

of more than 70.000 cases per year in Germany [Gesellschaft der epidemiologischen 

Krebsregister in Deutschland e. V., 2006]. The lifetime colorectal cancer risk is about 5 % and 

increases dramatically with age: By an age of 70, about 50 % of the Western population will 

have developed an adenoma [Fodde et al. 2001].  

 

3.1 The adenoma  carcinoma sequence in colorectal cancer 

In a healthy human colon, a permanent renewal of epithelial cells takes place. The 

asymmetrically dividing stem cells are localised at the base of each crypt. Newly divided 

cells differentiate while they migrate slowly upwards and finally die by apoptosis after 3  5 

days [Potten and Loeffler 1987]. In colorectal cancer this balance between proliferation and 

apoptosis is disturbed in favour of an increased mitosis rate and reduced apoptosis, which 

leads to the development of a polyp, a benign tumour mass that protrudes into the lumen of 

the gut. Such a benign adenoma may develop into an invasive carcinoma. The molecular 

basic principles for these cellular changes are meanwhile roughly understood. It is known 

that at least three so‐called tumour‐suppressor genes (APC, SMAD4, p53) plus one oncogene 

(KRAS) are the main targets for a mutation that will lead to colon cancer. Moreover, it is 

known that the specific genetic hits often occur in a distinct temporal order [Vogelstein et 

al. 1988, Fearon and Vogelstein 1990, Cho and Vogelstein 1992]. Mutations in the APC gene 

are the earliest genetic alterations during genesis of colorectal tumours and initiate the 

adenoma‐carcinoma sequence [Powell et al. 1992].  

 

3.2 The tumour suppressor APC  

3.2.1 Gene and protein structure of APC  The first clue to localizing the position of the APC gene was the identification of a deletion of 

the chromosomal band 5q21 in a patient with colorectal polyposis in 1986 [Herrera et al. 

1986]. APC was cloned and further characterised in 1991 [Groden et al. 1991, Kinzler et al. 

 

3

3.   I NTRODUCTION     1991a, Kinzler et al. 1991b]. The coding region of APC consists of 8535 bp, spans 21 exons and 

encodes a 2843 amino acid protein with an approximate molecular weight of 312 kDa 

[Thliveris et al. 1996]. The functional domains of APC are depicted in Fig. 1:  

 

   Figure 1: Domain structure of the APC protein. The 15 amino acid repeats (15R) are indicated with A-D, the 20 amino acid repeats (20R) with 1-7. The SAMP repeats are represented by an S. MCR = mutation cluster region.  

The N‐terminus of APC is known to promote self‐polymerization via an oligomerization 

domain [Su et al. 1993a, Joslyn et al. 1993, Li et al. 2008]. The so‐called armadillo repeats 

spanning amino acids 453‐767 are composed of a heptad repeat of a 42 amino acids motif, 

which has been originally identified in the Drosophila homolog of β‐catenin, armadillo 

[Riggleman et al. 1989, Peifer et al. 1994a]. Those repeats are known to be protein interaction 

domains. For APC an interaction via the armadillo repeats with the proteins APC‐stimulated 

guanine nucleotide exchange factor (Asef) [Kawasaki et al., 2000], IQ motif containing 

GTPase activating protein (IQGAP) [Watanabe et al., 2004], kinesin superfamily‐associated 

protein 3 (Kap3) [Jimbo et al., 2002] and APC membrane recruitment 1 (Amer1) has been 

reported [Grohmann et al. 2007]. The central domain of APC contains several β‐catenin 

binding sites: The so‐called 15 amino acid repeats (15R) and the 20 amino acid repeats (20R), 

of which four 15R [Eklof Spink et al. 2001, Ha et al. 2004] and seven 20R [Su et al. 1993b, 

Rubinfeld et al. 1995] have been identified. The latter are interspersed with the so‐called 

SAMP repeats, which are characterised by a central serin‐alanin‐methionin‐prolin sequence 

of amino acids and which are known to interact with Axin and Conductin [Zeng et al. 1997, 

Behrens et al. 1998]. Therefore the central part of APC interacts with components of the Wnt‐

signalling cascade. The basic domain which has a high content of arginin and lysine residues, 

has been shown to bind to the Rho effector protein mDia (mammalian homolog of 

drosophila Diaphonous) [Wen et al. 2004] and to the microtubule cytoskeleton [Munemitsu 

et al. 1994, Deka et al. 1998, Zumbrunn et al. 2001]. A second interaction site with 

microtubules takes place indirectly via the protein EB1 [Su et al. 1995]. The most C‐terminal 

part of APC contains a PDZ (PSD‐95, DLG, ZO‐1) domain, which interacts with the proteins 

 

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