A novel regulatory system for tightly controlled and long-term inducible transgene expression in human cell lines [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Christina Danke

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A novel regulatory system for tightly controlled and long-term inducible transgene expression in human cell lines Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Christina Danke aus Forchheim Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 12. April 2010 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Hillen Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Hans-Martin Jäck Danksagung Prof. Dr. Wolfgang Hillen danke ich für die Möglichkeit, an seinem Lehrstuhl zu promovieren, seine langjährige Unterstützung und seinen wissenschaftlichen Rat. Prof. Dr. Hans-Martin Jäck möchte ich für die Erstellung des Zweitgutachtens danken. Prof. Dr. Christian Koch und Prof. Dr. Lars Nitschke danke ich für ihre Bemühungen als Zweitprüfer. Mein besonderer Dank geht an Dr. Christian Berens für seine umfassende Betreuung, seine stets offene Tür bei sämtlichen Anliegen, seine Anregungen und das kritische Lesen der Arbeit. Gedankt sei Prof. Dr. Georg Fey und Prof. Dr.
Publié le : vendredi 1 janvier 2010
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A novel regulatory system
for tightly controlled and long-term inducible
transgene expression in human cell lines



















Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.




vorgelegt von
Christina Danke
aus Forchheim










Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg























Tag der mündlichen Prüfung: 12. April 2010

Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Hillen

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Hans-Martin Jäck

Danksagung



Prof. Dr. Wolfgang Hillen danke ich für die Möglichkeit, an seinem Lehrstuhl zu promovieren,
seine langjährige Unterstützung und seinen wissenschaftlichen Rat.

Prof. Dr. Hans-Martin Jäck möchte ich für die Erstellung des Zweitgutachtens danken.

Prof. Dr. Christian Koch und Prof. Dr. Lars Nitschke danke ich für ihre Bemühungen als
Zweitprüfer.

Mein besonderer Dank geht an Dr. Christian Berens für seine umfassende Betreuung, seine stets
offene Tür bei sämtlichen Anliegen, seine Anregungen und das kritische Lesen der Arbeit.

Gedankt sei Prof. Dr. Georg Fey und Prof. Dr. Lars Nitschke für die Zurverfügungstellung des
FACSCalibur und den Mitgliedern des Lehrstuhls für Genetik für ihre Hilfsbereitschaft bei
Problemen und Fragen rund um das Gerät, sowie für CD123 Antikörper und Molm-13 Zellen.

Prof. Dr. Helmut Fickenscher und Tuna Toptan möchte ich für die interessante Zusammenarbeit
danken.


Ganz besonders danke ich den ehemaligen, momentanen, kurzzeitigen und wieder
zurückgekehrten „Kellerkindern“ für eine tolle Laborgemeinschaft und Zusammenarbeit: Lars
für den gemeinsamen Start in das „Projekt Apoptose“ und die Betreuung in der ersten Zeit,
Christel für zahlreiche Ratschläge in verschiedensten Lebenslagen, Schmidti für schaurig-schöne
Klänge und seine extrem hilfreiche Unterstützung an Bench und Hood, Sabine für die gute
Zusammenarbeit und langjährige Officenachbarschaft, Marcus für chemischen Rat und tolle
Fotografien, den Praktikantinnen Martina, Julia („die Hauptpraktikantin“), Michele und Judith
für ihre Beiträge zu meiner Arbeit, sowie allen zusammen, auch Max, Janko, Anna und Xandra,
für zahlreiche gemeinsame Mittagessen und das eine oder andere gemeinsame Bierchen.

Vielen Dank allen Mitgliedern der Mibi für die angenehme Zusammenarbeit, vor allem den
CvDs, Markus Müller, Dr. Alfons Rösch, Dr. Gerald Seidel und den Damen im Sekretariat.
Kathrin, Britta und Matze danke ich herzlich für ihre Hilfe bei der Inbetriebnahme des Mac in
der „feindlichen“ Netzwerkumgebung.


Besonderer Dank geht an meine Eltern für ihre Rundum-Unterstützung zu jeder (Tages-)Zeit und
an die Familie Hecht für die nachmittägliche Kinderbetreuung und sonstige gemeinsame
Aktivitäten – ohne Euch wäre es zwischendurch ganz schön eng geworden!
Meinen Freunden danke ich für ihre Unterstützung in verschiedensten Situationen und ein stets
offenes Ohr.

Alberto und Layra danke ich dafür, dass sie jahrelang nicht nur die Wochenendplanung den
Bedürfnissen der Zellen untergeordnet haben – ihr seid wirklich toll!


Index
1 Zusammenfassung.................................................................................................................1
2 Summary ................................................................................................................................3
3 Introduction ...........................................................................................................................5
3.1 The Tet system........................................................................................................................... 5
3.1.1 The original eukaryotic Tet system ........................................................................................ 6
3.1.2 Modifications of the Tet system ............................................................................................. 6
3.1.2.1 Transactivator modifications ....................................................................................................... 6
3.1.2.2 Tet transsilencers and the combined activator-repressor strategy................................................ 7
3.1.2.2.1 The generation of tTS-KRAB ................................................................................................. 7
3.1.2.2.2 The combined activator-repressor strategy ............................................................................. 8
3.1.2.2.3 The generation of tTS-PP........................................................................................................ 9
3.1.2.3 Modifications of TRE.................................................................................................................. 9
3.2 Constitutive coexpression of Tet transregulators................................................................. 10
3.3 Conditional expression of suicide genes................................................................................ 11
3.3.1 Conditional cell death as safety tool for therapeutical use ................................................... 11
3.3.2 Conditional cell death elicited by overexpression of proapoptotic proteins......................... 12
3.3.3 Transfer of Tet-dependent expression units into primary cells via rhadinoviral vectors ..... 14
3.4 Scope of the thesis ................................................................................................................... 15
4 Results .................................................................................................................................17
S D
4.1 Jurkat-derived regulator cell lines expressing rtTA2 -M2 and tTS -KRAB .................... 17
S4.1.1 Generation of the regulator cell line Jr2 M2K ..................................................................... 17
S4.1.2 Generation of the regulator cell line Jr2 M2K-LucEGFP .................................................... 19
4.2 Identification of potent suicide genes in Jurkat cells ........................................................... 22
S
4.3 Attempts to establish stable suicide switches in Jr2 M2K cells .......................................... 26
4.4 Control of functional elements used to generate stably integrated suicide switches......... 27
4.4.1 Long-term expression of the tricistronic regulator cassette.................................................. 27
S
4.4.1.1 Long-term regulatory properties of Jr2 M2K cells.................................................................... 28
4.4.1.2 Insulation of the tricistronic regulator cassette by cHS4 core elements..................................... 30
4.4.2 Functionality of cHS4 core elements.................................................................................... 32
4.4.3 Influence of an external promoter on the uninduced activity of an insulated
TRE-controlled expression cassette...................................................................................... 36
S4.4.4 Generation of the control cell line Jr2 M2K-TRE-EGFP..................................................... 37
4.5 The PLDLS motif as an alternative to the KRAB repression domain ............................... 39
S4.5.1 Generation and characterization of the Jurkat regulator cell line Jr2 M2PP........................ 39
S4.5.2 Long-term regulatory properties of Jr2 M2PP cells............................................................. 42
S S4.5.3 Comparison of double stable Jr2 M2K- and Jr2 M2PP-derived cell pools ......................... 43
4.5.3.1 Generation and characterization of double stable Jurkat cell pools coding for different
combinations of transregulators and Tet-inducible promoters................................................... 44
4.5.3.2 Treatment of double stable Jurkat cell pools with 5-AzadC ...................................................... 50
4.6 Comparison of different Tet-inducible promoters in Jurkat T cells.................................. 51
4.6.1 Performance of transiently transfected Tet-inducible reporter constructs............................ 51
S4.6.2 Performance of chromosomally integrated Tet-inducible promoters in Jr2 M2PP cells ..... 52
Index
S4.6.3 Regulatory properties of Jr2 M2PP-MMTV/TRE, -TREtight and -SG/TRE single-cell
clones.................................................................................................................................... 54
S4.6.4 Dose response of Jr2 M2PP-MMTV/TRE, -TREtight and -SG/TRE single-cell clones
to different tc-derivatives...................................................................................................... 56
4.7 Application of the Tet-inducible promoters SG/TRE to control the expression of
CD123 and TREtight to generate Tet-dependent suicide switches in Jurkat cells ........... 58
S4.7.1 Generation of Jr2 M2PP cells expressing CD123 under the control of SG/TRE................. 58
S4.7.2 Establishment of TREtight-controlled suicide switches in Jr2 M2PP cells ......................... 61
4.8 Constitutive expression of Tet transregulators from alternative promoters..................... 73
4.8.1 Expression of the tricistronic regulator construct from P ................................................ 73 PGK
4.8.2 Constitutive expression of transgenes using human bidirectional promoters....................... 74
4.8.2.1 Simultaneous expression of Renilla and firefly luciferases from human bidirectional
promoters................................................................................................................................... 74
4.8.2.2 Bidirectional expression of Tet transregulators from P in HeLa cells .................................. 75 TFP
S D
4.8.2.2.1 Transient expression of rtTA2 -M2 and tTS -KRAB .......................................................... 75
S D4.8.2.2.2 Stable expression of rtTA2 -M2 and tTS -KRAB: HLuc P M2K .................................... 76 TFP
4.8.2.2.3 Generation of a Tet-dependent suicide switch in HLucP M2K cells................................. 79 TFP
4.8.2.3 Selection and application of further human bidirectional promoters......................................... 79
4.8.2.3.1 Transient expression of Tet transregulators in four different cell lines................................. 83
4.8.2.3.2 Application of genomically integrated P in NIH3T3: NIH3T3P M2K ........................... 87 3/5 3/5
4.8.2.4 Coupling the bidirectional transcription of transregulators with IRES-mediated expression
of a resistance marker ................................................................................................................ 88
IRESPuro
4.8.2.4.1 Generation of the Jurkat-derived cell line JP M2 K.................................................. 89 3/5
IRESPuro IRESPuro4.8.2.4.2 Generation of the cell lines HP M2 K and HLucP M2 K ........................... 91 TFP TFP
4.8.2.5 Simultaneous expression of mCherry and EGFPmut2 from P and P ................................. 92 TFP 3/5
4.9 Constructs for the transfer of Tet-inducible expression units into primary cells via
rhadinoviral vectors................................................................................................................ 97
5 Discussion...........................................................................................................................101
5.1 Establishing Jurkat-derived regulator cell lines ................................................................ 101
5.1.1 Generation of cell lines using tricistronic regulator constructs .......................................... 102
S S5.1.2 Regulatory properties of the cell lines Jr2 M2K and Jr2 M2PP ........................................ 103
5.2 Vector design for stable integration of Tet-inducible response units............................... 105
5.3 The KRAB-based transsilencer interferes with reactivatability of transgene expression
while the PLDLS-based transsilencer does not .................................................................. 106
D S5.3.1 Binding of tTS -KRAB in the control cell line Jr2 M2K-TRE-EGFP interfered
with transgene activation.................................................................................................... 106
D
5.3.2 tTS -KRAB-repressed double stable cell lines are less responsive to dox induction
D than tTS -PP-repressed cell lines ....................................................................................... 107
5.4 Tet-inducible promoters provide different expression windows in Jurkat cells ............. 109
D
5.5 Careful selection of the regulatable promoter and the use of tTS -PP as transsilencer
allows to optimize gene regulation in Jurkat cells.............................................................. 111
S5.5.1 Adjusting SG/TRE-controlled CD123 expression to different levels in Jr2 M2PP cells... 111
S5.5.2 Establishing TREtight-controlled conditional suicide switches in Jr2 M2PP cells ........... 112
5.5.2.1 RevCasp3 and tBid were identified as most potent death inducers in transient assays ........... 112
Index
5.5.2.2 Dox-dependent expression of stably integrated revCasp3 and tBid cDNAs led to efficient
killing of human T lymphocytes.............................................................................................. 114
5.6 Expression of Tet transregulators from human bidirectional promoters ....................... 116
5.6.1 Bidirectional expression of transgenes in transient assays ................................................. 117
5.6.2 Expression of transregulators from genomically integrated P and P .......................... 119 TFP 3/5
5.7 Conclusions and outlook....................................................................................................... 122
6 Material and Methods.......................................................................................................123
6.1 Material.................................................................................................................................. 123
6.1.1 Chemicals ........................................................................................................................... 123
6.1.2 Auxiliary Material .............................................................................................................. 124
6.1.3 Instruments ......................................................................................................................... 125
6.1.4 Enzymes, Proteins, Size markers and Libraries.................................................................. 125
6.1.5 Antibodies........................................................................................................................... 126
6.1.6 Commercially available systems (“kits”) ........................................................................... 126
6.1.7 Oligonucleotides................................................................................................................. 127
6.1.8 Plasmids.............................................................................................................................. 130
6.1.8.1 Plasmid constructions .............................................................................................................. 134
6.1.8.2 Sequences of human bidirectional promoters .......................................................................... 140
6.1.9 Bacteria............................................................................................................................... 141
6.1.10 Cell lines............................................................................................................................. 141
6.2 Media, Buffers and Solutions............................................................................................... 143
6.2.1 Bacterial growth media....................................................................................................... 143
6.2.2 Cell culture media............................................................................................................... 143
6.2.3 Buffers and solutions.......................................................................................................... 144
6.2.3.1 General buffers and solutions .................................................................................................. 144
6.2.3.2 Buffers and solutions for DNA gel electrophoresis ................................................................. 144
6.2.3.3 Buffers and solutions for analysis of firefly and Renilla luciferase activity............................ 144
6.2.3.4 Buffers and solutions for polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)................................... 145
6.2.3.5 Buffers for Western blot analysis ............................................................................................ 145
6.2.3.6 Buffers for FACS analyses ...................................................................................................... 145
6.3 Methods.................................................................................................................................. 146
6.3.1 General Methods................................................................................................................. 146
6.3.2 Cell culture ......................................................................................................................... 146
6.3.2.1 Cultivation of cell lines............................................................................................................ 146
6.3.2.2 Cell counts ............................................................................................................................... 146
6.3.2.3 Long-term storage of cell lines ................................................................................................ 146
6.3.3 Methods for transfection and characterization of cell lines................................................ 147
6.3.3.1 Transient transfection of COS-7 cells and HeLa cells............................................................. 147
6.3.3.2 Transient transfection of Jurkat cells ....................................................................................... 147
6.3.3.3 Transient transfection of NIH3T3 cells ................................................................................... 147
6.3.3.4 Stable transfection of adherent cell lines ................................................................................. 147
6.3.3.5 Stable transfection of Jurkat cell lines ..................................................................................... 147
6.3.3.6 Harvesting cells for firefly luciferase assays ........................................................................... 148
6.3.3.7 Harvesting cells for Renilla luciferase assays.......................................................................... 148
6.3.3.8 Determination of protein concentrations ................................................................................. 148
Index
6.3.3.9 Firefly luciferase and Renilla luciferase assays ....................................................................... 148
6.3.3.10 Harvesting and staining for FACS analyses ............................................................................ 148
6.3.3.11 Fluorescence activated cell sorting analysis (FACS)............................................................... 149
6.3.4 Western blot analysis.......................................................................................................... 149
6.3.4.1 Harvesting for Western blot analysis....................................................................................... 149
6.3.4.2 Western blot analysis............................................................................................................... 149
6.3.4.3 Stripping of PVDF membranes................................................................................................ 150
7 Literature ...........................................................................................................................151
8 Abbreviation Index ...........................................................................................................163
9 Publications........................................................................................................................167

1 Zusammenfassung
Die Transfusion von Donorlymphozyten ist eine Möglichkeit, nach erfolgter Stammzelltransplantation
persistierende oder wieder aufkeimende bösartige Erkrankungen zu behandeln. Um die Sicherheit solcher
Ansätze zu gewährleisten, werden die Donorzellen mit einem konditionalen Suizidschalter ausgestattet, der es
erlaubt, die Behandlung beim Auftreten unerwünschter Nebenwirkungen abzubrechen. Hauptziel der
vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines konditionalen, auf der Expression humaner proapoptotischer
Proteine basierenden Suizidschalters in der humanen T-Zelllinie Jurkat, unter Verwendung der regulatorischen
Komponenten des Tet-Systems. Solch ein Ansatz könnte gewisse Einschränkungen überwinden, die sich bei
der Anwendung des zur Zeit am häufigsten eingesetzten Suizidsystems, das auf der Expression der viralen
Thymidinkinase beruht und gegenwärtig klinisch getestet wird, ergeben.
Grundlegende Anforderungen an solch ein Suizidsystem sind i) strikte Expressionskontrolle, ii) die konstante
Induzierbarkeit des Schalters und iii) effiziente Zelltodinduktion.
Zur Gewährleistung strikter Expressionskontrolle wurde die kombinierte Aktivator-Repressor-Strategie
angewandt, um Jurkat-Regulatorlinien zu generieren. Zwei mechanistisch unterschiedlich wirkende
Transsilencer, tTS-KRAB and tTS-PP, die entweder die KRAB-Repressionsdomäne oder ein
S
PLDLS-Repressionsmotif tragen, wurden jeweils zusammen mit dem reversen Transaktivator rtTA2 -M2
coexprimiert. In beiden Ansätzen wurden hervorragend regulierende Zelllinien erhalten. Bei der
Expressionskontrolle chromosomal integrierter Transgene zeigte sich jedoch, dass tTS-KRAB-vermittelte
Repression, wahrscheinlich durch Rekrutierung von Heterochromatin, zum Silencing der Transgenexpression
S
führte. Repression durch den kürzlich entwickelten Transsilencer tTS-PP in der Zelllinie Jr2 M2PP dagegen
beeinträchtigte die nachfolgende Transaktivierung nicht; und zwar auch dann nicht, wenn die
Transgenexpression vor ihrer Induktion schon für mehrere Wochen ausgeschaltet worden war.
Da der Tet-regulierbare Promotor die Qualität der Regulation beeinflussen kann, wurde das Verhalten vier
S
verschiedener Promotoren in Jr2 M2PP Zellen analysiert. Die Ergebnisse ließen stark divergierende
Eigenschaften in Bezug auf Basalexpression und maximal mögliches Expressionsniveau erkennen. TREtight
wurde als am besten geeigneter Promotor für die Kontrolle zytotoxischer Transgene identifiziert.
Das Potential verschiedener proapoptotischer Proteine, bei Doxycyclin-abhängiger Überexpression Zelltod
auszulösen, wurde zuerst in transienten Transfektionen untersucht. Unter Verwendung stabil integrierter,
Isolator-flankierter Suizidgenexpressionskassetten, die unter der Kontrolle von TREtight stehen und für die
rekombinanten proapoptotischen Moleküle revCasp3 oder tBid kodieren, wurden effiziente Suizidschalter in
S
der Jurkat-Regulatorlinie Jr2 M2PP generiert. Mit beiden Schaltern wurden bis zu 99% der Zellen innerhalb
von 24 Stunden nach Induktion getötet. Mit dem hier verfolgten Ansatz wurde stringente Expressionskontrolle
nicht nur erreicht, sondern auch für mehrere Monate aufrecht erhalten. Nach dieser Zeit konnte der Zelltod
genauso effizient induziert werden wie vorher.
Die eigentlichen Zielzellen therapeutischer Anwendungen solcher Sicherheitsschalter sind primäre humane
T-Zellen. Episomal persistierende Herpesvirus saimiri-basierte Vektoren sind ein vielversprechendes
Werkzeug für den Gentransfer in diesen Zelltyp. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene all-in-one
Tet-regulierbare Transgenexpressionskassetten konstruiert und in Transfervektoren für Herpesvirus saimiri
eingebracht. Diese wurden anschließend von einer kooperierenden Arbeitsgruppe auf ihre Fähigkeit überprüft,
Doxycyclin-abhängige Regulation von Transgenen in humanen Primärzellen zu vermitteln.

Des Weiteren wurde in dieser Arbeit das Potential verschiedener humaner bidirektionaler Promotoren getestet,
die simultane Expression zweier Transgene zu vermitteln. Einer der Promotoren, P , der am endogenen TFP
Locus für die Transkription der Untereinheiten des mitochondrialen trifunktionalen Proteins zuständig ist,
zeigte vielversprechende Eigenschaften. Stabil integriert in HeLa Zellen, vermittelte er zuverlässig die
Transkription eines dualen Regulatorsetups über mehrere Monate hinweg.
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