Activation d'un cluster de gènes de polycétide synthase de type I chez Streptomyces ambofaciens ATCC 23877 : isolation et caractérisation d'un nouveau macrolide géant, Activation of a silent type I polyketide synthase gene cluster in Streptomyces ambofaciens ATCC23877 : isolation and characterization of a novel giant macrolide

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Sous la direction de Pierre Leblond
Thèse soutenue le 07 janvier 2010: Nancy 1
La recherche de nouveaux métabolites d'intérêt médical est toujours d'actualité, surtout si l'on considère que d'anciennes, mais aussi des nouvelles infections bactériennes ou virales apparaissent régulièrement. Les actinomycètes, et plus particulièrement les Streptomyces, sont les principaux producteurs de molécules anti-microbiennes. En effet, ils produisent presque 60-70% des produits naturels d'origine microbienne. La plupart de ces métabolites appartient à la classe des polycétides, qui sont synthétisés par des complexes multienzymatiques, les polycétide-synthétases (PKS). Les PKS utilisent des acides gras simples pour assembler des structures polycétidiques très diversifiées. Une approche très prometteuse pour identifier des nouvelles voies de biosynthèse de métabolites secondaires est basée sur une approche génomique ou « genome mining ». Le séquençage du chromosome linéaire de Streptomyces ambofaciens ATCC23877 a, entre autre, révélé sur le bras chromosomique droit, un cluster cryptique de gènes de PKS de type I de grande taille. Ce cluster contient 25 gènes, dont 9 gènes de biosynthèse, pour un total de 25 modules, tous fonctionnels. Les analyses in silico des gènes de PKS ont permis de prédire que le cluster serait responsable de la synthèse d'une molécule appartenant à la famille des macrolides. Dans des conditions standard de laboratoire, le cluster était silencieux. Afin d'activer l'expression du cluster, un gène de régulation, samR0484, présent dans le cluster et codant un régulateur de la famille LAL (Large ATP binding protein of the LuxR family), a été surexprimé dans la souche sauvage. Les analyses transcriptionelles ont montré que cela se traduisait par l'induction de l'expression des gènes de biosynthèse. Par conséquence, une stratégie de « comparative metabolic profiling » a été menée entre la souche sauvage et la souche mutante afin d'identifier le nouveau métabolite. Quatre formes différentes d'un macrolide avec un cycle lactonique de 50 carbones, ont été isolées et caractérisées. Ces composants, nommés sambomycine A, B, C et D, ont montré une activité antibactérienne et une activité antiproliférative intéressante. La détermination de la structure de la sambomycine a révélé des caractéristiques uniques et intéressantes, concernant la réaction de cyclisation et la synthèse d'un précurseur atypique. Ces mécanismes de biosynthèse ont fait l'objet d'une étude plus approfondie. Nous nous sommes également intéressés à la régulation de ce cluster. Le régulateur LAL agit comme un activateur transcriptionnel essentiel. Des analyses préliminaires indiquent que ce régulateur se fixe aux régions promotrices de certains gènes, notamment celles des gènes de biosynthèse ainsi que celles d'autres gènes de post-modification, activant ainsi leur transcription.
-Streptomyces ambofaciens
-Cluster silencieux
-Régulateur spécifique
-Macrolide
The constant and urgent need of novel bioactive compounds is the result of the emergence in the last decades of new and old infectious diseases, a sore for humankind. Actinomycetes and especially the genus Streptomyces are the principal producers of microbial drugs producing nearly 60-70% of the natural products. The majority of secondary metabolites belong to the class of polyketides that are synthesised by multienzymatic complexes named polyketides synthases (PKS). PKSs condensate simple small carboxylic acids to generate a wide range of complex polyketide structures. In the search for new drugs, the genome mining approach proved to be a powerful tool in the identification of cryptic secondary metabolite pathways. The sequencing and the analysis of Streptomyces ambofaciens ATCC23877 genome has revealed a large type I PKS cluster, on the right arm of the chromosome. The cluster contains 9 PKS, composed of 25 functional modules. In silico analysis of the PKS genes and of the tailoring genes enabled to predict the structure of the expected metabolite, a macrolide. In the laboratory standard conditions, the cluster showed to be silent. Therefore, to promote the expression of the cluster, the regulatory gene samR0484, encoding a LAL regulator (Large ATP binding protein of the LuxR family) was overexpressed in the wt strain. Transcriptional analyses showed that the PKS genes were expressed. Subsequently, by comparative metabolic profiling between the mutant strain and the wt, we were able to detect the novel metabolite produced by S. ambofaciens. Structural elucidation revealed four form of a 50-membered macrolide, named sambomycin. The compounds endow antibacterial and antitumoral activities. The structure unveiled unique and interesting characteristics of sambomycin, i.e. the cyclization reaction and the presence of an atypical extender unit. The mechanisms of biosynthesis have been analysed more in details in this work. We also investigated in the regulation of the cluster. The LAL regulator was shown to be an essential transcriptional activator, binding to the promoter regions of the PKS genes and probably to other genes in the cluster.
Source: http://www.theses.fr/2010NAN10001/document
Publié le : lundi 19 mars 2012
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Faculté des Sciences- UFR Sciences et Techniques Biologiques

Ecole Doctorale BioSE : Biologie, Santé, Environnement




Thèse

présentée et soutenue publiquement pour l’obtention du titre de

Docteur de l’Université Henri Poincaré

en Sciences de la Vie et de la Santé

par

Luisa LAURETI

Activation of a silent type I polyketide synthase gene cluster in
Streptomyces ambofaciens ATCC23877: isolation and
characterization of a novel giant macrolide

Activation d’un cluster de gènes de polycétide synthase de type I
chez Streptomyces ambofaciens ATCC23877 : isolation et
caractérisation d’un nouveau macrolide géant




Soutenance publique prévue le 7 janvier 2010 devant la commission d’examen :


Membres du jury :

Rapporteurs : M. Mervyn BIBB Professeur, John Innes Center, Norwich
M. Jean-Luc PERNODET Directeur de Recherche CNRS, Université Orsay

Examinateurs : M. Frédéric BOURGAUD Professeur, Nancy-Université
M. Bernard DECARIS ancy
M. Pierre LEBLOND ancy-Université (Directeur de thèse)
M. Bertrand AIGLE Maître de Conférences, Nancy-Université


Laboratoire de Génétique et Microbiologie UMR INRA-UHP 1128
Faculté des Sciences et Techniques – 54506 Vandœuvre-lès-Nancy





















































The Fishermen know that the sea is dangerous and the storm terrible,
but they have never found these dangers sufficient reason for remaining ashore.
(Vincent van Gogh)





































ACKNOWLEDGEMENTS/REMERCIEMENTS


Je remercie le Professeur Pierre Leblond pour m’avoir accueillie au sein du Laboratoire de
Génétique et Microbiologie et pour m’avoir permis d’entreprendre cette thèse.

I would like to thank Professor Mervyn Bibb and Professor Jean-Luc Pernodet for accepting
to be my referees. For me it has been a great honour and I hope for them it will be a pleasure to
read this thesis.

Je voudrais aussi remercier le Professeur Frédéric Bourgaud et le Professeur Bernard Decaris
pour avoir accepté d’être mes examinateurs.

I would like to thank Professor Greg Challis and the Dr Lijiang Song and Dr Christophe
Corre for welcoming me in the lab and for all the precious help in the discovery and the
characterization of sambomycin, our “little baby”. I really learned a lot from them and I enjoyed
my staying in England very much.

Je tiens surtout à remercier mon “dear boss” ( ☺) le Docteur Bertrand Aigle qui a toujours cru
en moi et dans ce projet, même quand moi je n’y croyais plus ! Merci pour la confiance que tu
m’as accordée tout au long de cette thèse et pour tous tes conseils professionnels, mais aussi
personnels. Merci d’avoir accepté mon « sacré caractère » de petite Calimero et d’avoir été
toujours très compréhensible et disponible avec moi ! J’ai beaucoup appris de toi. Ton
enthousiasme et ta rigueur scientifique resteront toujours un exemple pour moi. Enfin, travailler
côte à côte avec toi a été un vrai plaisir et je sais que tout ça va beaucoup me manquer.

Cette thèse n’aurait jamais été achevée sans l’aide et le soutien de toutes les personnes que j’ai
eu la chance de rencontrer à Nancy et de celles qui faisaient déjà partie de ma vie. Je suis
devenue celle que je suis aussi grâce à eux !

Tout d’abord, je tiens à remercier de tout mon coeur l’équipe Streptomyces ☺ :
Laurence, pour sa gentillesse infinie et pour tous les petits moments de bonheur et de pause thé
partagés avec moi. Je me suis sentie en famille avec toi, Christophe et les enfants ! Robert, un
grand merci à toi pour ton aide à la paillasse et pour ta patience à répondre à mes questions et à
mes doutes. Un grand merci également pour avoir été mon partenaire de badminton et de danse,
on s’est beaucoup éclatés ensemble. Sans toi le labo n’a plus été pareil ! Merci à Caths, toujours
pleine de bonne humeur, d’énergie et toujours disponible envers les autres… promets-moi
d’apprendre à dire non de temps en temps ! ;-) Thanks a lot to Isolde, the other foreign English
speaking in the lab ! Even if we met at the end of this adventure, we had the chance to share a

lot of nice and funny moments and I wish you all the best for your future! Merci à Annabelle,
pour son accueil chaleureux et pour son aide à chercher mon petit coin douillet, sans même me
connaître auparavant ! Merci pour m’avoir laissée faire du babysitter au petit Daniel, j’ai
vraiment aimé !

Je tiens aussi à remercier toutes les autres personnes du laboratoire présentes, passées ou venant
juste d’arriver, avec qui j’ai eu le plaisir de partager ces trois années de thèse et qui m’ont
permis de ne pas trop sentir la solitude et la distance avec mon pays et mes proches.
En particulier, merci à Catherine, Virginie, Séverine, Céline, Xavier et Stéphane pour toutes
les petites soirées gourmandes et arrosées passées ensemble. Merci à mes « collègues » thésards
Nico, Ludo et Romain à qui je souhaite très bon courage ! Merci aux « petits » du labo (comme
je les appelle amicalement) Julien, Aurore, Emilie, Fabien, Justine et Maxime car ils
contribuent à rendre le labo très sympa et rigolo! Merci à Sophie pour son super talent
d’organisation ! Merci enfin à Fred et Julie, mes deux amis en dehors du labo, avec qui j’ai
passé des moments très sympas, oubliant pour quelques heures mon boulot !

A special thank to my dear friend Bjørn, who has always been there for me for better or for
worse, even being across the ocean as proof that nothing can ruin our friendship! Thank you
very much for reading and correcting my manuscript, you gave me very useful advices and
comments, but most of all you always encouraged me in my work because you know how silly I
can be when an experiment doesn’t work as I want!! Waar ik ook heen zal gaan, ik zal je altijd
in mijn hart dragen.

Un grazie infinito ai miei cari amici italiani Gi, Valentina e Laura che sono sempre riusciti a
infondermi coraggio e fiducia e che per dimostrarmi il loro affetto sono venuti fino a Nancy! ☺

E infine voglio ringraziare la mia famiglia che mi ha sostenuto per tutto questi anni, standomi
sempre vicino e facendomi sentire il loro affetto incondizionato. Se sono quella che sono, lo
devo soprattutto a voi e all’esempio di amore, rispetto, altruismo e professionalità che mi avete
sempre dato.








INDEX

ABBREVIATIONS__________________________________________________________________1
INTRODUCTION__________________________________________________________________ 3
1. General context___________________________________________________________________5
2. Secondary metabolism and microbial natural products__________________________________7
2.1 Interconnection between primary and secondary metabolism_______________________________ 9
2.2 The antibiotics___________________________________________________________________10
2.3 Mechanisms of bacterial resistance___________________________________________________12
2.3.1 Active-efflux pumps______________________________________________________ 12
2.3.2 Enzymatic inactivation of the antibiotic_______________________________________ 13
2.3.3 Modification of the target site _______________________________________________13
3. Strategies to discover novel natural bioactive molecules_________________________________14
3.1 Genome mining __________________________________________________________________15
3.1.1 OSMAC approach ________________________________________________________16
3.1.2 Genomisotopic approach ___________________________________________________16
3.1.3 Gene inactivation and comparative metabolic profiling approach ___________________17
3.1.4 Heterologous expression ___________________________________________________18
3.1.5 Modification of the regulatory network________________________________________19
3.2 Metagenomics ___________________________________________________________________20
3.3 Combinatorial biosynthesis _________________________________________________________21
3.4 Screening of rare genera of actinomycetes and other untapped sources_______________________22
4. Insights in the regulation of secondary metabolism_____________________________________24
4.1 Nutritional regulation______________________________________________________________24
4.2 Global regulation_________________________________________________________________26
4.3Extracellular signals _______________________________________________________________28
4.3.1 γ-butyrolactones__________________________________________________________28
4.3.2 Furans__________________________________________________________________30
4.3.3 PI factor ________________________________________________________________31
4.4 Pathway-specific regulators_________________________________________________________31
4.4.1 SARP regulators__________________________________________________________31
4.4.2 LAL regulators___________________________________________________________32
5. Polyketide synthases versus non-ribosomal peptide synthases ____________________________33
5.1 The core domains_________________________________________________________________34
5.2 The auxiliary domains _____________________________________________________________35
5.3 The initiation and termination domains________________________________________________36
5.3.1 Type II thioesterase _______________________________________________________37
6. Polyketide synthases______________________________________________________________38

6.1 Typology of polyketide synthases____________________________________________________38
6.1.1 Modular type I PKS_______________________________________________________38
6.1.2 Iterative type I PKS _______________________________________________________39
6.1.3 Type II PKS_____________________________________________________________39
6.1.4 Type III PKS ____________________________________________________________40
6.2 Polyketide-tailoring genes__________________________________________________________41
6.2.1 Glycosyltransferases ______________________________________________________41
6.2.2 Methyltransferases and oxygenases_____________________42
7. Streptomyces, a prolific producing genus______________________________________________43
7.1 General characteristics_____________________________________________________________43
7.2 Streptomyces ambofaciens__________________________________________________________44
8. Objectives of the thesis ____________________________________________________________47

RESULTS_________________________________________________________________________49
Chapter 1 In silico characterization of a large type I PKS cluster ___________________________51
1.1 Sequence analysis of the enzymatic domains ___________________________________________54
1.1.1 Ketosynthase domains_____________________________________________________54
1.1.2 Acyl transferase domains___________________________________________________55
1.1.3 Acyl carrier protein domains________________________________________________56
1.1.4 Ketoreductase domains______________________________ 56
1.1.5 Dehydratase domains______________________________________________________58
1.1.6 Enoyl reductase domains_____________________________58
1.1.7 Thioesterase domain ______________________________________________________59
1.2 Prediction of the linear polyketide structure ____________________________________________60
1.3 Analysis of the other genes putatively involved in the biosynthesis__________________________62
1.3.1 Glycosyltransferase and sugar genes__________________________________________62
1.3.2 Cytochrome P450_________________________________________________________63
1.3.3 Thioesterase type II _______________________________________________________64
1.3.4 Additional genes _________________________________________________________64
1.4 The resistance genes ______________________________________________________________65
1.5 The regulatory genes ______________________________________________________________65
1.5.1 A two component system___________________________________________________65
1.5.2 A LAL regulator__________________________________________________________66
Chapter 2 Activation of a silent cluster and isolation of a novel bioactive macrolide of Streptomyces
ambofaciens ATCC2387771 __________________________________________________________69
2.1 Activation of a silent cluster ________________________________________________________70
2.2 Detection and isolation of a novel metabolite ___________________________________________72
2.3 The detected metabolites are synthetised by the type I PKS cluster _________________________ 73

2.4 Structural elucidation of the novel compounds__________________________________________75
2.5 Biological properties of the macrolide sambomycin______________________________________77
Article: Discovery of a novel macrolide in Streptomyces ambofaciens by awaking a sleeping giant ___79
Chapter 3 Characterization of sambomycin biosynthesis __________________________________99
3.1 Limits of the sambomycin cluster ____________________________________________________99
3.2 The phosphopantetheinyl transferase_________________________________________________100
3.3 The cytochromes P450____________________________________________________________101
3.4 The acyl-CoA synthetase and the acyl-CoA carboxylase _________________________________105
3.5 Secretion of sambomycin__________________________________________________________106
3.6 The resistance genes _____________________________________________________________110
Chapter 4 Regulation of the sambomycin cluster________________________________________113
4.1 The LAL regulator is an activator of the sambomycin gene cluster _________________________113
4.2 Searching for the targets of the LAL regulator _________________________________________115
4.3 In vitro characterization of the LAL regulator__________________________________________117
4.4 Sambomycin production in R2 medium ______________________________________________120
4.5 Effect of SAMR0484 on spiramycin production________________________________________122
4.6 The two component system________________________________________________________125

CONCLUSION AND PERSPECTIVES_______________________________________________ 127
1. Sambomycin, a peculiar 50-membered macrolide __________________________________128
1.1 A new cyclization mechanism for polyketides _________________________________________128
1.2 Biosynthesis of an unusual extender unit______________________________________________130
1.3 Glycosylation of the sambomycin aglycones __________________________________________134
2. Macrolides: biological properties and resistance mechanisms___________________________ 135
2.1 Biological properties_____________________________________________________________ 135
2.2 Resistance mechanisms___________________________________________________________ 136
3. The LAL regulator is a positive pathway-specific regulator of the sambomycin cluster______136
4. Combinatorial biosynthesis of the sambomycin gene cluster ____________________________139
5. The role of sambomycin in nature__________________________________________________ 140
6. Streptomyces ambofaciens and its fascinating secondary metabolites______________________142

APPENDIX_______________________________________________________________________145
REFERENCES____________________________________________________________________159






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