Analyse de la réponse allogénique chez le porc : orientation de la réponse lymphocytaire T effectrice par les cellules dendritiques et étude de la régulation de la réponse immune., Swine alloimmune response analysis : effector T cells response orientation by dendritic cells and study of immune response regulation.

De
Publié par

Sous la direction de Christophe Baron
Thèse soutenue le 04 février 2009: Tours
L’apport des modèles de transplantation chez le rongeur pour des protocoles d’induction de tolérance chez l’homme est limité. La création d’un modèle pré-clinique visant à induire une tolérance aux allogreffes chez le gros animal comme le porc s’avère pertinent. L’activation de cellules dendritiques (DC) porcines par le CD40L ou le mélange de TNFa, d’INFa et de LPS augmente l’expression des molécules B7, induit l’expression de novo de CD25 et augmente leur capacité allostimulatrices. Par ailleurs, le CD40L ou le mélange TNF+INF+LPS induit des DC orientant la réponse allogénique vers Th1 et Th17. Les lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+ porcins ont été mis en évidence grâce à l’expression de Foxp3. Une stimulation de cellules CD4+ par la PHA en présence de TGFß induit l’expression de Foxp3. L’ajout de rapamycine maintien cette expression et renforce l’activité suppressive ce qui pourrait être expliqué par le fait que la rapamycine bloque l’expression d’IL 17 induite par le TGFß.
-Greffe d'organe
-Cellules dendritiques porcines
-Orientation de la réponse immune T
The contribution of rodent models of transplantation for protocols of induction of tolerance in humans has been disappointing. It therefore seems relevant to create a pre-clinic model in large animals. The activation of swine dendritic cells (DC) by CD40L or a combination of TNF+INF+LPS increases the expression of B7 molecules and induced de novo expression of CD25 on DC associated with an increase of allogeneic lymphocyte stimulation ability. In addition, CD40L and TNF+IFN+LPS induced DC polarizing to Th1 and Th17 response respectively. Swine natural CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes have been highlighted through the expression of Foxp3. Stimulation of CD4+ cells by PHA and IL-2 in the presence of TGFß induces the expression of Foxp3 and the addition of rapamycin enhances the suppressive activity while maintaining the expression of Foxp3. Rapamycin blocks the expression of IL-17 induced by TGFß. This effect could explain the increase of the suppressive activity caused by rapamycin.
-Lymphocytes T régulateurs
-Modèle animal
Source: http://www.theses.fr/2009TOUR3121/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
Lecture(s) : 96
Nombre de pages : 232
Voir plus Voir moins


UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS


ÉCOLE DOCTORALE SST
EA 4245 Cellules dendritiques, Immunomodulation et Greffes

THÈSE présentée par :
Caroline PILON

soutenue le : 4 Février 2009


pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François - Rabelais
Discipline/ Spécialité : Sciences de la vie/ Immunologie

Analyse de la réponse allogénique chez le porc :
orientation de la réponse lymphocytaire T effectrice par les
cellules dendritiques et étude de la régulation de la réponse
immune



THÈSE dirigée par :
M. BARON Christophe Maitre de conférences – Praticien hospitalier (HDR), Université
François Rabelais, Tours

RAPPORTEURS :
M. HAUET Thierry Professeur, Université de Poitiers, Poitiers
M. BLANCHO Gilles Professeur, Université de Nantes, Nantes


JURY :
M. BARON Christophe Maitre de conférences, Université François Rabelais, Tours
M. BLANCHO Gilles Professeur, Université de Nantes, Nantes
M. HAUET Thierry Professeur, Université de Poitiers, Poitiers
Mme. JUILLARD Véronique Docteur, Mérial, Lyon
M. LEBRANCHU Yvon Professeur, Université François Rabelais, Tours
M. SALMON Henri Directeur de Recherche, INRA, Tours

Remerciements
Je tiens à remercier le Pr. Yvon Lebranchu pour m’avoir accueillie dans son laboratoire et
avoir accepté de faire parti de mon jury de thèse.

Florence pour les conseils et l’aide précieuse que vous avez pu m’accorder durant ces années
de thèse.

Christophe, le directeur de ce travail, avec qui les discussions sont parfois sans fin… mais
toujours agréables et pertinentes. Vraiment un grand merci pour le temps que tu m’as
accordé et pour la rigueur scientifique que tu cherches à nous transmettre.

Je tiens également à remercier le Pr Gilles Blancho et le Pr. Thierry Hauet pour avoir
accepté d’évaluer mon travail de thèse en tant que rapporteur.

Un merci au Dr. Henri Salmon pour avoir accepté d’examiner cette thèse et pour la
collaboration entretenue durant ce travail.

Le docteur Véronique Juillard, tout d’abord pour avoir accepté d’évaluer ce travail et aussi
par l’intermédiaire de Mérial pour m’avoir fourni les cytokines porcines ayant permis la
réalisation des expériences sur les cellules dendritiques.

Les membres de l’unité Lymphocytes et Immunité des Muqueuses de l’INRA, pour leur
collaborations dans ce travail. Un merci particulier à Benoit pour toutes les PCR
quantitatives et à François pour tes conseils et ton aide.

Merci aux membres de l’UMR Physiologie de la Reproduction et des comportements et ceux
de la Plateforme d’Infectiologie Expériementale de l’INRA de Tours pour les prélèvements de
sang de porc.

Merci au Dr Yves Le Vern et au Dr Dominique Kerboeuf du service commun de cytométrie de
l’INRA de Tours, pour les expériences de tri cellulaire.

Merci au Dr. Julie-Déchanet Merville de l’Université de Bordeaux pour les lignées
fibroblastiques murines ainsi qu’au Dr. Brigitte Arbeille et à madame Claude Lebos pour le
travail effectué en microscopie électronique.

Je remercie vivement Artur Summerfield pour m’avoir accueillie chaleureusement dans son
laboratoire pendant 3 semaines me permettant de découvrir un autre environnement de
recherche scientifique avec des personnes très accueillantes dont je garderai d’agréables
souvenirs.

Merci aux membres, ex-membres ou futurs ex-membres du laboratoire : Christine, Cyrille,
Roxane, Romain, Angélique, Philipe, Thomas et les autres, merci pour votre aide, votre
soutien et aussi pour l’ambiance agréable qui règne dans ce laboratoire.

Je tiens également à remercier :
- Audrey pour les coups de main lors des nombreuses « manips » et pour les
différentes discussions, voire vocalises réalisées sous la hôte les jours de « Boudin ». Ta
constante bonne humeur et ta joie de vivre furent très agréables à partager.
1
- Sylvie pour la réalisation des manips ainsi que pour le temps et l’aide précieuse que
tu m’offres surtout pour la rédaction de ce manuscrit pour tes qualités humaines. Merci
également pour ta générosité et tes confitures….

- Laurence pour avoir partagé un certain temps de cette thèse ensemble, pour les re-
lectures, ton sourire permanent et et tout le reste qui fait que l’on restera amie.

- Delphine, un énorme MERCI et bon séjour dans mon pays, je suis sûre que tu t’y
plairas ; finiras-tu peut être par le trouver ton mari canadien…Bonne chance dans tes futures
recherches (scientifiques bien sûr !!).

Merci à mes coéquipières de handball qui se sont montrées très conciliantes, surtout pour les
absences que j’ai pu avoir à l’entrainement.

Un grand merci à mes amies (de vraies !!!) que je ne nommerai pas mais qui se
reconnaitront, elles ont enduré ces durs mois de rédaction, voire d’hibernation… sans jamais
se plaindre ni s’éloigner…

Et surtout, je remercie mes parents et mon frère préféré, sans lesquels je ne serai pas là,
toujours étudiante à presque 30 ans et qui m’ont toujours encouragée et soutenue dans les
choix que j’ai pu faire dans ma vie, même celui de m’éloigner d’eux de quelques 6000 km.


2
Résumé

En transplantation rénale, la réponse immune de l’hôte contre son donneur reste une
cause très importante de perte de greffons. Ainsi, un meilleur contrôle de la réponse
allogénique par induction d’une tolérance spécifique reste l’une des priorités en
transplantation humaine. A ce jour, l’apport des modèles de transplantation chez le petit
animal pour des protocoles d’induction de tolérance chez l’homme est assez limité. Par
conséquent, un projet de créer un modèle pré-clinique chez le gros animal visant à explorer
les possibilités d’induction de tolérance aux allogreffes d’organe s’avère pertinent. Dans ce
travail nous avons étudié plus particulièrement la réponse alloimmune chez le porc.
Nous avons tout d’abord étudié la réponse allogénique induite par des cellules
dendritiques (DC) porcines activées par des agents d’origine variée (CD40L ou la
combinaison de TNFα, d’INFα et de LPS). Ces agents augmentent l’expression des molécules
B7 et induisent l’expression de novo de CD25 sur les DC ainsi qu’une augmentation de la
capacité à stimuler des lymphocytes allogéniques. Par ailleurs, le CD40L ou la combinaison
TNF+INF+LPS induit des DC orientant la réponse allogénique vers Th1 et Th17
respectivement, alors que les DC immatures orientent vers Th2. Notre travail suggère aussi
fortement l’existence d’une balance Th1-Th17 chez le porc.
D’autre part, nous avons mis en évidence les lymphocytes T régulateurs naturels
+ +CD4 CD25 porcins qui expriment Foxp3 et représentent environ 3% des cellules
+mononucléées du sang. Enfin, une stimulation de lymphocytes CD4 par la
phytohémagglutinine (PHA) et l’IL-2 en présence de TGFβ induit fortement l’expression de
Foxp3. L’ajout de rapamycine renforce l’activité suppressive tout en maintenant l’expression
de Foxp3 induite par le TGFβ. A l’inverse, la rapamycine seule n’induit pas l’expression de
Foxp3 mais bloque la production d’IL-17 induite par le TGFβ en présence de PHA et d’IL-2.
Cet effet pourrait expliquer le renforcement de l’activité suppressive par la rapamycine.


Mots-clés : greffe d’organe, cellules dendritiques porcines, orientation de la réponse immune
T, lymphocytes T régulateurs, modèle animal
3
Résumé en anglais

In kidney transplantation, host immune response against donor still remains a major
cause of graft loss. A better control of allogeneic response through the induction of specific
tolerance is a major goal in human transplantation. Up to now translation into the clinic of
results obtained in rodents has been disappointing. It therefore seems relevant to create a pre-
clinic model in large animals to explore tolerance induction possibilities. In this work, we
studied the alloimmune response in swine.
We firstly studied the allogeneic response induced by swine dendritic cells (DC)
activated by different agents (CD40L or a combination of TNFα, IFNα and LPS). These
agents increased the expression of B7 molecules and induced de novo expression of CD25 on
DC associated with an increase of allogeneic lymphocyte stimulation ability. In addition,
CD40L and TNFα+IFNα+LPS induced DC polarizing to Th1 and Th17 response respectively,
whereas immature DC directed lymphocytes to a Th2 response. Furthermore our results
strongly suggest the existence of a Th1-Th17 balance in pig.
+ +
We also revealed swine natural CD4 CD25 regulatory T cells which expressed Foxp3
gene and accounted for about 3% of the peripheral blood mononuclear cells. Stimulation of
+
CD4 cells with phytohaemagglutinin (PHA), IL-2 and TGFβ strongly induced the Foxp3
expression. Addition of rapamycin increased the suppressive activity with maintenance of the
Foxp3 expression induced by TGFβ. However, the rapamycin alone did not induce Foxp3
expression, but impaired the IL-17 production induced by TGFβ, PHA and IL-2. This effect
might explain the increase of the suppressive activity caused by rapamycin.

Keywords: organ transplantation, swine dendritic cells, T cell orientation, regulatory T cells,
animal model.
4
Table des matières
Remerciements ........................................................................................................................... 1
Résumé....................................................................................................................................... 3
Résumé en anglais...................................................................................................................... 4
Table des matières...................................................................................................................... 5
Liste des tableaux ....................................................................................................................... 9
Liste des figures ....................................................................................................................... 10
Liste des annexes...................................................................................................................... 12
Liste des abréviations............................................................................................................... 13
INTRODUCTION.......................................................................................................................... 15
I- Préambule : contexte général de notre travail ...................................................................... 16
II-Les cellules dendritiques ...................................................................................................... 18
Généralités & rappels historiques sur les cellules dendritiques ........................................... 18
Biologie des cellules dendritiques : collecte et interprétation des signaux
environnementaux, initiation de l’immunité adaptative....................................................... 20
1- Maturation et activation des DC in vivo et in vitro...................................................... 20
1a- Généralités sur le processus de maturation. ............................................................... 20
1b- Induction de la maturation des cellules dendritiques et les récepteurs impliqués. .... 22
Récepteurs impliqués dans la reconnaissance des motifs conservés associés aux
pathogènes ....................................................................................................................... 22
Activation par des molécules endogènes (DAMP) ......................................................... 26
Activation par des cytokines inflammatoires.................................................................. 27
1c- Voies de signalisation activées durant la maturation de la cellule dendritique.......... 28
1d- Modifications d’expression des molécules de surface et de la synthèse de cytokines
et de chimiokines induites par la maturation.................................................................... 32
1e- Maturation des cellules dendritiques porcines ........................................................... 35
2- Rôle des cellules dendritiques dans l’activation des cellules de l’immunité innée et
adaptative ......................................................................................................................... 35
2a- Activation des cellules NK......................................................................................... 35
2b- Activation des lymphocytes B ................................................................................... 36
2c- Processus de présentation antigénique aux lymphocytes T ....................................... 36
3- Différentes sous-populations de cellules dendritiques: origine et différenciation....... 40
3a- Différentes sous-populations...................................................................................... 40
5
3b- Sous-populations de cellules dendritiques porcines .................................................. 45
3c- Ontogénie et différenciation des cellules dendritiques .............................................. 46
4- Modèles de différenciation de cellules dendritiques in vitro....................................... 47
III- Les lymphocytes T............................................................................................................. 49
1- Les différentes sous-populations de lymphocytes T.................................................... 49
2- L’activation du lymphocyte T...................................................................................... 50
2a- Récepteur des cellules T – TCR................................................................................. 51
2b- Les molécules de co-stimulation dans l’activation T................................................. 53
2c- Synapse immunologique ............................................................................................ 57
2d- Activation polyclonale des lymphocytes T................................................................ 58
3- Orientation de la réponse immune ............................................................................... 59
3a- Orientation de la réponse Th1 .................................................................................... 61
3b- Orientation de la réponse Th2.................................................................................... 63
3c- Orientation de la réponse Th17 .................................................................................. 64
3d- Lymphocytes T régulateurs........................................................................................ 67
3e- Interconnexion des différentes orientations et notion d’équilibre.............................. 67
IV- Vision intégrée de l’organisation de la réponse immune adaptative : plasticité de la cellule
dendritique, rôle de l’environnement et trafic cellulaire dans l’organisme.............................. 68
1- Rôle des cellules dendritiques dans l’orientation de la réponse immune .................... 68
2- Le concept de cellules dendritiques tolérogènes.......................................................... 72
3- Migration des cellules dendritiques ............................................................................. 73
V-Immunologie de la greffe..................................................................................................... 75
1- Différents types de rejets ............................................................................................. 76
2- Différentes voies d’alloreconnaissance........................................................................ 78
3- Les immunosuppresseurs............................................................................................. 80
4- Tolérance immune ....................................................................................................... 83
4a- Mécanismes généraux ................................................................................................ 83
4b- Les lymphocytes T régulateurs .................................................................................. 86
5-Le porc comme modèle animal d’étude de l’allogreffe ................................................ 97
Objectifs de l’étude .............................................................................................................. 98
MATERIELS ET METHODES DE L’ETUDE ..................................................................................... 99
Animaux......................................................................................................................... 100
Réactifs........................................................................................................................... 100
Cellules dendritiques porcines ....................................................................................... 101
6
Différenciation des monocytes en cellules dendritiques ................................................ 101
Maturation des cellules dendritiques ............................................................................. 101
Microscopie électronique............................................................................................... 101
Analyse de la phosphorylation de p38MAPK ................................................................ 102
Isolement des lymphocytes ............................................................................................ 103
Activation lymphocytaire............................................................................................... 104
Cytométrie en flux.......................................................................................................... 106
Mesure de la sécrétion de cytokines par ELISA ............................................................ 106
PCR quantitative ............................................................................................................ 107
Analyse Statistique......................................................................................................... 108
RESULTATS ............................................................................................................................. 109
A- Caractéristiques des cellules dendritiques porcines avant et après activation par divers
agents en présence ou non d’immunosuppresseurs................................................................ 110
I- Etude de la morphologie, du phénotype de surface et des cytokines ......................... 111
Changements morphologiques des cellules dendritiques porcines induits par le CD40L
........................................................................................................................................ 111
Modification phénotypique des DC porcines après activation par différents agents:
expression de novo du CD25......................................................................................... 111
Analyse des cytokines produites : le CD40L et le mélange TNF-LPS-IFN induisent la
production d’IL-12p40 par les cellules dendritiques ................................................... 112
Etude de la phosphorylation de p38MAPK par le LPS et le mélange TNF-LPS-IFN113
II- Influence des différentes conditions d’activation sur la capacité allostimulatrice des
cellules dendritiques porcines. ........................................................................................... 118
Etude quantitative de la capacité allo-stimulatrice des cellules dendritiques porcines
........................................................................................................................................ 118
Analyse phénotypique des lymphocytes porcins après stimulation par des DC
allogéniques................................................................................................................... 118
III-Effet des immunosuppresseurs sur les cellules dendritiques porcines.......................... 124
Effet de l’acide mycophénolique sur les capacités allostimulatrices des cellules
dendritiques ................................................................................................................... 124
Effet de la rapamycine sur la maturation et l’activation des cellules dendritiques.... 124
IV-Orientation de la réponse immune par les cellules dendritiques .................................. 125
B- Exploration de la réponse immune T régulatrice et Th17 chez le porc......................... 130
I- Caractérisation des lymphocytes T régulateurs naturels porcins.................................... 131
7
+Répartition des cellules CD25 et Foxp3 dans les lymphocytes circulants................. 131
+ +Mise en évidence de la fonction régulatrice des lymphocytes T CD4 CD25 circulants
........................................................................................................................................ 131
Capacité proliférative des Treg naturels du porc après stimulation par des agents
mitogènes ....................................................................................................................... 132
II- Orientation de la réponse immune vers la régulation par activation polyclonale de
+
lymphocytes CD4 en présence de TGFβ et de rapamycine.............................................. 136
Effet du TGFβ et de la rapamycine sur la prolifération induite par la PHA ............. 136
Induction de l’expression de Foxp3 par le TGFβ........................................................ 137
Augmentation de CD25 et de SLA-DR par la PHA : effet de la rapamycine et du TGFβ
........................................................................................................................................ 138
+Activité suppressive des lymphocytes T CD4 en présence de TGFβ et de rapamycine
........................................................................................................................................ 139
+
Effet de la rapamycine et du TGFβ sur la stimulation de lymphocytes CD4 CD25- par
de la PHA et de l’IL-2. .................................................................................................. 140
III- Modulation de l’orientation Th17 par l’IL-6 et la rapamycine.................................... 141
DISCUSSION............................................................................................................................. 154
CONCLUSION........................................................................................................................... 169
Résumé................................................................................................................................... 231
Résumé en anglais.................................................................................................................. 231

8
Liste des tableaux
Tableau I : anticorps utilisés pour l’analyse des cellules dendritiques et des lymphocytes
porcins par cytométrie en flux .................................................................................... 106
Tableau II : Séquences des amorces, température d’hybridation des paires d’amorces
(°C), tailles des fragments attendus (bp) et numéros d’accession............................ 108


9

Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.