Analyse des propriétés physico-chimiques et pharmacologiques d'Imidazole [1,2-¯]pyridine : évaluation de l'apport de la RMN HR-MAS pour la compréhension de ces mécanismes

De
Publié par

Sous la direction de Jean-claude Debouzy
Thèse soutenue le 09 février 2011: UNIVERSITE DE GRENOBLE, Grenoble
La MAP kinase p38 régule la transduction du signal en réponse à un stress environnemental. Les inhibiteurs spécifiques de p38, qui sont connus pour bloquer la production de cytokines pro-inflammatoires, mais peuvent également intervenir sur le phénomène d'apoptose. C'est dans cette dernière optique que de nouvelles structures d'inhibiteurs, ont été synthétisées. Ces structures, après caractérisation par RMN, ont été ensuite évaluées en termes de mécanisme d'action et de disponibilité biologique. Outre les méthodes classiques cette évaluation a finalement fait appel aux techniques HR-MAS. Les sept molécules ainsi synthétisées ont été regroupées en trois famille (1a, 2a-c, 3a-c). Quoique les propriétés physico-chimique de ces motifs soient très différentes, il en ressort une potentialité d'action commune en tant qu'inhibiteur de la MAP kinase p38.
-Rmn
-Inflammation
-Apoptose
-Monocyte
P38 MAP Kinase regulates the signal's transduction in response to an environmental stress. The specific p38 inhibitors, which are known to bloc the pro inflammatory (cytokines) production, can intervene on the (apoptosis) phenomenon too. This is in this last perspective that news inhibitors' structures have been synthesized. These structures, after RMN characterization, have been estimated in term of the mechanics of an action and biological ability. As well as the classical methods, this evaluation finally requires HR-MAS technics. The 7 molecules synthesized in this manner have been in 3 families regrouped (1a, 2a-c, 3a-c). Although the physic- chemical properties of these motives are very different, it stands out a common potentiality of action as an MAP Kinase p38 inhibitor
-Nmr
-Inflammation
-Apoptosis
-Monocyte
Source: http://www.theses.fr/2011GRENS003/document
Publié le : lundi 19 mars 2012
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THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE
Spécialité : Modèles, Méthodes et Algorithmes en Biologie
Discipline : Biophysique, Biochimie et Biologie Cellulaire
Arrêté ministériel : 7 août 2006



Présentée par
Sébastien FOLLOT


Thèse dirigée par Jean-Claude DEBOUZY

préparée au sein de IRBA/CRSSA dans l’Unité de Biophysique
Cellulaire et Moléculaire
dans l'École Doctorale de l’Ingénierie pour la Santé la
Cognition et l'Environnement


Analyse des propriétés physico-chimiques
et pharmacologiques
d’Imidazo[1,2- ]pyridine :
Evaluation de l’apport de la RMN HR-MAS pour la
compréhension des mécanismes d’interaction avec les
cibles biologiques.


Thèse soutenue publiquement le 9 février 2011,
devant le jury composé de :

PR Hatem FESSI
DR Yves CHANCERELLE
DR Mohamed SKIBA
DR David CROUZIER
PR Jean-Claude DEBOUZY
1
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tel-00573124, version 1 - 3 Mar 2011


















































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THÈSE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE GRENOBLE
Spécialité : Modèles, Méthodes et Algorithmes en Biologie
Discipline : Biophysique, Biochimie et Biologie Cellulaire
Arrêté ministériel : 7 août 2006



Présentée par
Sébastien FOLLOT


Thèse dirigée par Jean-Claude DEBOUZY

préparée au sein de IRBA/CRSSA dans l’Unité de Biophysique
Cellulaire et Moléculaire
dans l'École Doctorale de l’Ingénierie pour la Santé la
Cognition et l'Environnement


Analyse des propriétés physico-chimiques
et pharmacologiques
d’Imidazo[1,2- ]pyridine :
Evaluation de l’apport de la RMN HR-MAS pour la
compréhension des mécanismes d’interaction avec les
cibles biologiques.


Thèse soutenue publiquement le 9 février 2011,
devant le jury composé de :

PR Hatem FESSI
DR Yves CHANCERELLE
DR Mohamed SKIBA
DR David CROUZIER
PR Jean-Claude DEBOUZY
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Dans la vie, les hommes sont tributaires les uns
des autres. Il y a donc toujours quelqu'un à maudire
ou à remercier.
Madeleine Ferron

Remerciements

Mes remerciements chaleureux s’adressent tout d’abord :


A Monsieur le Professeur FESSY pour avoir bien voulu participer au jury et pour
l’honneur qu’il me fait en acceptant de juger cette thèse.


A Monsieur le Docteur Mohamed SKIBA et Monsieur le Docteur Yves
CHANCERELLE pour m’avoir accordé une partie de leur temps afin d’examiner ce mémoire,
d’en être le rapporteur.


L’ensemble de ce travail a reçu le soutien financier de la DGA au titre du POR6 CT4,
PEA n°010807. N’oublions pas le Service de Santé des Armées, l’Armée de l’Air et la
Gendarmerie Nationale pour m’avoir fait découvrir l’armée et assuré mon soutien financier
personnel durant cette période.
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Un grand merci à Monsieur le Professeur Jean-Claude Debouzy qui porta la casquette
de directeur de laboratoire avec de grandes qualités scientifiques, suivi de directeur de thèse
avec un énorme travail pour améliorer ma rédaction en anglais, mais surtout un ami qui m’a
fait découvrir les réunions scientifiques du mercredi. Une petite citation de Hans Christian
Andersen pour résumer :

La reconnaissance est la mémoire du cœur.


Je remercie tout particulièrement le Docteur David Crouzier, qui a toujours été présent
et qui a joué le rôle de co-directeur de thèse. Merci pour ton éternelle bonne humeur, ton
positivisme, tes encouragements, les longues discutions non scientifiques, pour la
participation de tes lapins et tout le reste.


Un merci à Madame Maëlle Thorand, ma partenaire de bureau, sans qui la thèse
n’aurait pas été aussi agréable, et encore désolé pour la musique.


J’adresse mes remerciements à tout le reste de l’équipe de biophysique Christine,
Vincent, Raymonde, Anne pour leurs sympathies et leurs amitiés.


Je souhaite adresser un merci à toutes les personnes qui m’ont aidé à réaliser ce travail
mais surtout apporté leurs amitiés : la VSSA team bien sur (une grande famille), le Bat 18
(Tomtom la barre des 34 min est possible, les shim de Patrick, les motards, les
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travailleurs……), le service informatique qui a résolu tout mes problèmes, la restauration qui
m’a nourri matin, midi et soir, et toutes les personnes avec qui j’ai travaillé et surtout discuté.


Merci à l’ensemble du personnel du laboratoire de la faculté de pharmacie de Tour et
plus particulièrement aux Professeurs Cécile Enguehard-Gueiffier et Alain Gueiffier pour
leurs participations pratiques et techniques mais surtout pour leur aide.

















A mes parents, Brigitte et Pierre, mon frère Christophe et à
toute ma famille, qui m’on toujours soutenu dans mes décisions et
surtout qui ont toujours été présents pour moi.
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Le chercheur doit être libre de tenter des expériences
audacieuses, de soutenir des théories révolutionnaires,
voire paradoxales. Il doit disposer du droit à
l'erreur.
Pierre Joliot





Internet est le produit d’une combinaison unique de
stratégie militaire, de coopération scientifique et
d’innovation contestataire.
Manuel Castells



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Résumé

La MAP kinase p38 régule la transduction du signal en réponse à un stress environnemental.
Les inhibiteurs spécifiques de p38, qui sont connus pour bloquer la production de cytokines
pro-inflammatoires, mais peuvent également intervenir sur le phénomène d’apoptose.
C’est dans cette dernière optique que de nouvelles structures d’inhibiteurs ont été
synthétisées. Ces structures, après caractérisation par RMN, ont ensuite été évaluées en
termes de mécanisme d’action et de disponibilité biologique. Outre les méthodes classiques
cette évaluation a finalement fait appel aux techniques HR-MAS.
Les sept molécules ainsi synthétisées ont été regroupées en trois familles (1a, 2a-c, 3a-c).
Bien que les propriétés physico-chimiques de ces motifs soient très différentes, il en ressort
une potentialité d’action commune en tant qu’inhibiteur de la MAP kinase p38.
Mots clés : RMN ; Inflammation ; Apoptose ; Monocyte.

Abstract

p38 MAP Kinase regulates the signal’s transduction in response to an environmental stress.
The specific p38 inhibitors, which are known to bloc the pro inflammatory (cytokines)
production, can intervene on the (apoptosis) phenomenon too.
This is in this last perspective that news inhibitors’ structures have been synthesized. These
structures, after RMN characterization, have been estimated in term of the mechanics of an
action and biological ability. As well as the classical methods, this evaluation finally requires
HR-MAS technics.
The 7 molecules synthesized in this manner have been in 3 families regrouped (1a, 2a-c, 3a-
c). Although the physic-chemical properties of these motives are very different, it stands out a
common potentiality of action as an MAP Kinase p38 inhibitor

Keyword : NMR ; Inflammation ; Apoptosis ; Monocyte.

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INTRODUCTION ........................................................1

INTRODUCTION GENERALE.................................4

1 ) Physiologie et environnement cellulaire ........................................................................ 5
1.1. Cycle cellulaire........................................................................................................... 5
1.1.1. Les différentes phases du cycle cellulaire.......................................................... 6
1.1.1.1. Interphase ................................................................................................... 7
1.1.1.2. La phase mitotique ..................................................................................... 7
1.1.2. Contrôle du cycle cellulaire................................................................................ 9
1.2. L’inflammation......................................................................................................... 11
1.2.1. Généralités........................................................................................................ 11
1.2.2. La réponse inflammatoire................................................................................. 11
1.2.3. Les médiateurs de l’inflammation.................................................................... 12
1.2.3.1. Les médiateurs plasmatiques.................................................................... 13
1.2.3.2. Les médiateurs cellulaires ........................................................................ 14
1.2.4. L’inflammation et les voies de signalisation intracellulaire............................. 15
1.3. Le processus de mort cellulaire par apoptose........................................................... 17
1.3.1. Caractéristiques morphologiques ..................................................................... 18
1.3.2. Caractéristiques biochimiques.......................................................................... 19
1.3.3. Les principaux effecteurs de l’apoptose........................................................... 20
1.4. Les protéines kinases................................................................................................ 24
1.4.1. Introduction ...................................................................................................... 24
1.4.2. Généralités........................................................................................................ 24
1.4.3. Différentes classes d’inhibiteurs ...................................................................... 25
1.4.4. La famille des p38 MAP Kinases..................................................................... 26
1.4.4.1. Propriétés et structure des p38 ................................................................. 26
1.4.4.2. Régulation de la voie d’activation de p38................................................ 29
1.4.4.3. L’inflammation et p38.............................................................................. 30
1.4.4.4. L’apoptose et p38..................................................................................... 30
1.4.4.5. Le cycle cellulaire et p38 ......................................................................... 31
1.4.4.6. Les inhibiteurs de p38 en développement ................................................ 32
2 ) Etude des interactions................................................................................................... 34
2.1. L’ADN ..................................................................................................................... 34
2.1.1. L’hélice ADN................................................................................................... 34
2.1.2. La chaîne phosphodiester................................................................................. 36
2.1.3. La torsion des sucres ........................................................................................ 37
2.1.3.1. Le concept de pseudorotation et de stabilité du sucre.............................. 37
2.1.3.2. La liaison glycosidique............................................................................. 39
2.1.4. Polymorphisme de l’ADN................................................................................ 39
2.2. Les phospholipides et les membranes ...................................................................... 41
2.2.1. La membrane biologique.................................................................................. 41
2.2.2. Les phospholipides........................................................................................... 43
2.2.2.1. La structure............................................................................................... 44
2.2.2.2. Le polymorphisme lipidique .................................................................... 45
2.2.2.3. Fluidité de la membrane........................................................................... 45
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2.2.3. Le modèle membranaire................................................................................... 47
3 ) Méthode d’étude par RMN .......................................................................................... 49
3.1. Etude des interactions par RMN .............................................................................. 49
3.1.1. Les interactions avec les membranes modèles................................................. 49
31
3.1.1.1. La RMN- P ............................................................................................. 49
23.1.1.2. La RMN- H.............................................................................................. 51
3.1.2. Les interactions avec l’ADN............................................................................ 52
3.1.2.1. RMN à une dimension.............................................................................. 52
3.1.2.2. RMN à deux dimensions.......................................................................... 54
3.2. Etude par RMN HR-MAS........................................................................................ 55
3.2.1. Etude des cellules............................................................................................. 55
3.2.2. La RMN HR-MAS : Avantages et limitations................................................. 56
3.2.2.1. La vitesse de rotation................................................................................ 56
3.2.2.2. L’effet de la température.......................................................................... 57
3.2.2.3. Observation simultanée des métabolites et des lipides ............................ 57

TRAVAIL EXPERIMENTAL..................................59

1 ) Etude des propriétés physico-chimiques des drogues.................................................. 60
1.1. Généralités de l’étude............................................................................................... 60
1.2. Les molécules synthétisées....................................................................................... 60
1.3. Analyse des composés de la famille 3...................................................................... 62
1.3.1. Interactions drogue/membrane......................................................................... 62
1.4. Interaction drogue/membrane : Approche par HR-MAS......................................... 97
1.4.1. Résultats de l’étude .......................................................................................... 97
1.4.2. Conclusion...................................................................................................... 102
1.4.3. Interaction drogue/ADN................................................................................. 104
1.5. Analyse des composés de la famille 1 et 2............................................................. 106
1.5.1. Interaction drogue/membrane ........................................................................ 106
1.5.2. Interaction drogue/ADN................................................................................. 106
1.6. Appendice : Essai de solubilisation en milieu aqueux. .......................................... 107
2 ) Etude des propriétés inhibitrices des drogues ............................................................ 109
2.1. Sélection de la méthode RMN adaptée à la problématique ................................... 109
2.1.1. Evaluation du stress mécanique de l’échantillon à l’angle magique : Validation
du modèle ....................................................................................................................... 109
2.1.2. Analyse métabolomique par RMN de cellules THP-1................................... 139
2.2. Analyse du potentiel inhibiteur des composées des familles 1, 2 et 3 ................... 167

CONCLUSION ET PERSPECTIVES ...................200

ANNEXES .................................................................205

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...............245

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