Analyse des Substratspektrums der ClpCP-Protease aus Corynebacterium glutamicum [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Jens-Eric Schweitzer

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Analyse des Substratspektrums der ClpCP-Protease aus Corynebacterium glutamicum Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf vorgelegt von Jens-Eric Schweitzer aus Friedberg/Hessen Düsseldorf, im Mai 2007 Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Biotechnologie I des Forschungszentrums Jülich unter der Leitung von Professor Dr. rer. nat. Michael Bott durchgeführt. Gedruckt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Referent: Professor Dr. rer. nat. Michael Bott Institut für Biotechnologie I Arbeitsgruppe Biochemie Forschungszentrum Jülich GmbH Korreferent: Privat-Dozent Dr. rer. nat. Ulrich Schulte Institut für Biochemie Arbeitsgruppe Mitochondrienbiogenese Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Tag der mündlichen Prüfung: 25. Juni 2007 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis Abkürzungen……………………………………………………………...………..…IV 1 Zusammenfassung ......................................................................................1 2 Einleitung......................................................................................................5 2.1 Aufbau ATP-abhängiger Proteasen................................................................5 2.2 Aufbau und Domänenstruktur von Clp-Proteasen ......
Publié le : lundi 1 janvier 2007
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Analyse des Substratspektrums
der ClpCP-Protease
aus Corynebacterium glutamicum



Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf




vorgelegt von

Jens-Eric Schweitzer
aus Friedberg/Hessen

Düsseldorf, im Mai 2007


Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Biotechnologie I des Forschungszentrums
Jülich unter der Leitung von Professor Dr. rer. nat. Michael Bott durchgeführt.



Gedruckt mit Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf








Referent: Professor Dr. rer. nat. Michael Bott
Institut für Biotechnologie I
Arbeitsgruppe Biochemie
Forschungszentrum Jülich GmbH

Korreferent: Privat-Dozent Dr. rer. nat. Ulrich Schulte
Institut für Biochemie
Arbeitsgruppe Mitochondrienbiogenese
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf







Tag der mündlichen Prüfung: 25. Juni 2007

Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen……………………………………………………………...………..…IV
1 Zusammenfassung ......................................................................................1
2 Einleitung......................................................................................................5
2.1 Aufbau ATP-abhängiger Proteasen................................................................5
2.2 Aufbau und Domänenstruktur von Clp-Proteasen ..........................................6
2.3 Funktion der Clp-Protease .............................................................................8
2.4 Substraterkennung und Adaptoren von Clp-Proteasen ..................................9
2.5 ATP-abhängige Proteolyse in Corynebacterium glutamicum........................11
2.6 Ziele der Arbeit ............................................................................................15
3 Material und Methoden..............................................................................16
3.1 Chemikalien und Enzyme ............................................................................16
3.2 Stammlösungen...........................................................................................16
3.3 Bakterienstämme und Plasmide...................................................................17
3.3.1 Bakterienstämme..................................................................................................17
3.3.2 Plasmide ...............................................................................................................18
3.4 Oligonukleotide ............................................................................................20
3.5 Nährmedien .................................................................................................22
3.6 Kultivierungsbedingungen und Stammhaltung von Bakterien.......................23
3.6.1 Kultivierung von E. coli-Stämmen.........................................................................23
3.6.2 Kultivierung von C. glutamicum-Stämmen ...........................................................23
3.6.3 Stammhaltung von Bakterien ...............................................................................23
3.6.4 Bestimmung des Wachstums von Bakterien-Kulturen .........................................24
3.7 Molekularbiologische Methoden...................................................................24
3.7.1 Isolierung von DNA...............................................................................................24
3.7.1.1 Plasmid-Isolierung ............................................................................................24
3.7.1.2 Isolierung chromosomaler DNA........................................................................24
3.7.1.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarose-Gelen ......................................25
3.7.2 Reinigung und Konzentration von DNA................................................................25
3.7.2.1 Reinigung von PCR-Produkten.........................................................................25
3.7.2.2 Konzentration von DNA-Lösungen mit Mikrokonzentratoren ...........................25
3.7.3 Bestimmung der DNA-Konzentration ...................................................................25
3.8 Rekombinante DNA-Techniken....................................................................26
3.8.1 Restriktion.............................................................................................................26
II Inhaltsverzeichnis
3.8.2 5’-Dephosphorylierung von linearer Plasmid-DNA ...............................................26
3.8.3 Ligation..................................................................................................................26
3.8.4 Agarose-Gelelektrophorese..................................................................................27
3.9 Klonierungsexperimente .............................................................................. 28
3.9.1 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen nach der Rubidiumchlorid-Methode .......28
3.9.2 Herstellung elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen.........................................28
3.9.3 Transformation Rubidiumchlorid-kompetenter E. coli-Zellen................................29
3.9.4 Elektroporation elektrokompetenter C. glutamicum-Zellen...................................29
3.9.5 Amplifizierung von DNA-Fragmenten durch Polymerasekettenreaktion (PCR) ...30
3.9.6 Kolonie-PCR .........................................................................................................31
3.9.7 Konstruktion von Deletionsmutanten ....................................................................31
3.9.8 Ortsgerichtete Mutagenese...................................................................................32
3.9.9 DNA-Sequenzanalyse...........................................................................................34
3.10 Biochemische Methoden.............................................................................. 34
3.10.1 Zellaufschluss von C. glutamicum mit Glasperlen................................................34
3.10.2 Zellaufschluss mit einer French-Press-Zelle.........................................................35
3.10.3 Reinigung von Proteinen mit StrepTag-II..............................................................35
3.10.4 Entfernung von ClpP-ST aus dem Eluat der StrepTactin-
Affinitätschromatographie .....................................................................................36
3.10.5 Konzentration von Proteinen.................................................................................36
3.10.6 Proteinbestimmung mit dem BCA-Test ................................................................36
3.10.7 N-terminale Sequenzanalyse von Proteinen ........................................................37
3.10.8 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ................................................................37
3.10.9 Western-Blot .........................................................................................................37
3.10.10 Bestimmung der Halbwertszeit von Proteinen......................................................38
3.10.11 Färbung von Proteinen in SDS-Gelen mit kolloidalem Coomassie Brilliant
Blau .......................................................................................................................39
3.10.12 Silberfärbung von Proteinen in SDS-Gelen ..........................................................39
3.10.13 Zweidimensionale Gelelektrophorese von Proteinen ...........................................40
3.10.14 MALDI-ToF Massenspektrometrie........................................................................41
4 Ergebnisse..................................................................................................43
4.1 „Fangen“ von Clp-Protease-Substraten in vivo ............................................ 43
4.1.1 Konstruktion der Substratfallenstämme................................................................44
4.1.1.1 Deletion der Gene smpB, clpE und clpX in dem Stamm C. glutamicum
P -clpP1P2 .....................................................................................................45 tetA
4.1.1.2 Gerichtete Mutagenese von clpP1 und clpP2...................................................46
TRAP TRAP
4.1.1.3 Konstruktion von ClpCP1 und ClpCP2 .................................................48
4.1.2 Co-Reinigung von Substraten mit ClpP ................................................................49
4.1.3 Kontrollen zur Spezifität der Co-Reinigung...........................................................53
Inhaltsverzeichnis III
4.1.3.1 Versuche zur Konstruktion eines Stammes mit Deletionen von clpC, clpE
und clpX ............................................................................................................53
4.1.3.2 Versuche zur Reinigung von aktivem ClpP1 und ClpP2 ..................................54
4.1.3.3 Reinigung von ClpP1 mit einem N-terminalen StrepTag-II...............................57
4.1.3.4 Reinigung der -Ketoglutarat-Dehydrogenase.................................................59
4.2 Identifizierung von potentiellen Substraten der ClpCP-Protease ..................62
4.3 Ableitung und Überprüfung von Erkennungsmotiven ...................................68
4.3.1 Ableitung der Sequenzmotive...............................................................................68
4.3.2 Überprüfung der Relevanz der abgeleiteten Motive.............................................70
4.3.3 Einfluss des N-Terminus von ClgR auf dessen Stabilität.....................................75
4.4 Bioinformatische Auswertung möglicher Substrate der ClpXP-Protease ......76
5 Diskussion..................................................................................................79
5.1 Identifizierung von potentiellen Substraten der ClpCP-Protease ..................79
5.1.1 Co-Reinigung von potentiellen Substraten mit inaktivem ClpP1 und ClpP2........79
5.1.2 Kontrollen zur Spezifität der Co-Reinigung ..........................................................80
5.1.3 Identifizierung der mit ClpP1 bzw. ClpP2 co-gereinigten Proteine.......................82
5.2 Ableitung und Überprüfung potentieller Erkennungsmotive von ClpC ..........83
5.3 ClpCP-abhängige Degradation der putativen Substrate...............................84
5.4 ClgR – ein konditionales Substrat der ClpCP-Protease................................90
5.5 Potentielle Substrate der C. glutamicum ClpXP-Protease............................92
5.6 Ausblick .......................................................................................................93
6 Literatur ......................................................................................................95
7 Anhang......................................................................................................110


aIV Abkürzungen
Abkürzungen

Ø Aminosäure mit hydrophober Seitenkette
2D zweidimensional
A Adenin, Ampere
Å Angström
abs. absolut
ATC Anhydrotetracyclin
bp Basenpaar(e)
BSA Rinderserumalbumin
bzw. beziehungsweise
C Cytosin
°C Grad Celsius
ca. circa
CHAPS 3-(3-(Cholamidopropyl)-dimethyl-ammonio-1-propansulfonat
Delta
Da Dalton
dH O destilliertes Wasser 2
d/ddATP Desoxy-/Didesoxy-Adenosin-5’-triphosphat
d/ddCTP Desoxy-/Didesoxy-Cytidin-5’-triphosphat
d/ddGTP Desoxy-/Didesoxy-Guanosin-5’-triphosphat
d/ddTTP Desoxy-/Didesoxy-Thymidin-5’-triphosphat
DFP Diisopropylmonofluorophosphat
DMF N,N-Dimethylformamid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP Desoxyribonukleotid-5’-triphosphat
DTT Dithiothreitol
et al. und andere
G Guanin
g Gramm
2
g (-fache) Erdbeschleunigung (9,81 m/s )
gr. groß(e, es)
h Stunde
IPTG Isopropyl- -D-thiogalaktosid
3
k Kilo- (10 )
kb Kilobasenpaare
kl. klein(e, es)
l Liter
-3m milli- (10 )
-6
mikro- (10 )
M molar (mol/l)
MCS multiple cloning site
min Minute
MOPS Morpholinopropansulfonsäure
-9
n nano- (10 )
N jede Nukleinsäure
Na EDTA Ethylendiamintetraacetat, Dinatriumsalz 2
Ohm
Orf offener Leserahmen
-12
p pico- (10 )

WDmbAbkürzungen V
p.A. pro Analysi
pH negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
pI isoelektrischer Punkt
PMSF Phenylmethylsulfonylchlorid
ppm Teilchen pro Million
R Purin (Adenin oder Guanin)
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
S Svedberg, (Cytosin oder Guanin)
SDS Natriumdodecylsulfat
sog. sogenannte (r, n)
spec. Spezies
T Thymin
TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TE Tris-EDTA-Puffer
T Schmelztemperatur der DNA m
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
UE Untereinheit
Upm Umdrehungen pro Minute
USA Vereinigte Staaten von Amerika
V Volt
vgl. vergleiche
v/v Volumen pro Volumen
W Watt, (Adenin oder Thymin)
w/v Gewicht pro Volumen
X jede Aminosäure
Y Pyrimidin (Cytosin oder Thymin)
z. B. zum Beispiel


Drei- und Ein-Buchstabencode der Aminosäuren

Alanin Ala A Leucin Leu L
Arginin Arg R Lysin Lys K
Asparagin Asn N Methionin Met M
Asparaginsäure Asp D Phenylalanin Phe F
Cystein Cys C Prolin Pro P
Glutamin Gln Q Serin Ser S
Glutaminsäure Glu E Threonin Thr T
Glycin Gly G Tryptophan Trp W
Histidin His H Tyrosin Tyr Y
Isoleucin Ile I Valin Val V

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