Analyse structurale et dynamique par RMN des domaines N-terminaux des protéines DsbD et PilB de Neisseria meningitidis et de leur interaction, Structural and dynamics NMR analysis of PilB and DSBD N-Terminal domains and of their interaction

Marc Quinternet

Description

Sous la direction de Manh-Thong Cung
Thèse soutenue le 09 décembre 2008: INPL
Nous montrons que la structure RMN, en solution, du domaine N-terminal de DsbD de Neisseria meningitidis (nDsbD) présente, à l’état réduit, un repliement de type immunoglobuline avec un site actif adoptant une conformation fermée. Toutefois, l’analyse des mouvements internes du squelette peptique de nDsbD montre que la région dite « couvercle » de la protéine et qui protège les résidus actifs dans les formes réduite et oxydée, est dotée de mouvements internes. Cela démontre les capacités intrinsèques d’ajustement structural de nDsbD. Nous montrons aussi que les structures RMN, en solution, du domaine N-terminal de PilB de N. meningitidis (NterPilB) sous ses deux formes, réduite et oxydée, présentent un repliement de type thiorédoxine. Ces deux formes, très proches d’un point de vue structural, apparaissent comme étant globalement rigides. Par conséquent, la boucle FLHE, caractéristique de NterPilB et bordant le site actif de la protéine, ne dévoile pas de nouveaux indices structuraux et/ou dynamiques traduisant son implication dans la spécificité de substrat. Finalement, nous montrons, grâce à l’étude structurale et dynamique, en solution, d’un complexe entre nDsbD et NterPilB de N. meningitidis, que nDsbD fait preuve d’une grande adaptabilité à l’état complexé. La région « couvercle » s’ouvre pour venir se positionner au dessus de l’hélice a qui contient les cystéines actives de NterPilB. Par contre, la boucle FLHE de NterPilB ne semble pas intervenir dans la stabilisation du complexe. Nous proposons que des phénomènes dynamiques puissent faciliter d’une part, l’adaptabilité relative des deux partenaires dans le complexe, et d’autre part, la dissociation finale de ces derniers
-RMN
-Structure
-PilB
-NDsbD
-Dynamique
We show, on one hand, that the NMR solution structure of DsbD N-terminal domain from Neisseria meningitidis (nDsbD) displays, in its reduced state, an immunoglobulin fold with a closed conformation of its active site. Nonetheless, our backbone dynamics study shows that the cap-loop region of the protein, which covers active residues in both oxidized and reduced forms, displays internal motions. This illustrates the inner structural adjustment capacities of nDsbD. On the other hand, we show that NMR solution structures of the oxidized and reduced forms of N. meningitidis NterPilB display a thioredoxin-like fold. These two structures appear to be very similar and globally rigid. Consequently, the NterPilB characteristic FLHE loop, which covers one edge of the active site, does not reveal new structural and/or dynamics properties for its involvement in the substrate specificity. Finally, we point out, from the structural and dynamics study of a complex between nDsbD and NterPilB from N. meningitidis, that nDsbD exhibits a powerful adaptability in its complex state. Its cap-loop region opens and comes over the a helix containing the NterPilB active cysteines. In contrast, the NterPilB FLHE loop does not seem to play a role in the complex stabilization. We propose that internal dynamics should facilitate, on one hand, the relative adaptability between the two partners of the complex and, on the other hand, their subsequent dissociation
-NMR
-NDsbD
-PilB
-Structure
-Dynamics
Source: http://www.theses.fr/2008INPL102N/document

Sujets

• Dynamique
• NMR

Informations

• Publié par: Thesee
• Nombre de lectures: 85
• Langue: Français
• Poids de l'ouvrage: 23 Mo

Extrait

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Ecole doctorale RP2E – ED 410




Thèse
présentée pour l’obtention du titre de
Docteur de l’Institut National Polytechnique de Lorraine
(Spécialité : Génie des Procédés)

par
Marc Quinternet

Soutenue publiquement le 9 décembre 2008


Analyse structurale et dynamique par RMN des domaines
N-terminaux des protéines DsbD et PilB de
Neisseria meningitidis et de leur interaction


- Membres du jury -
Président :
M. Guy Branlant Professeur, Université Henri Poincaré, Nancy I
Rapporteurs :
M. Jean-Marc Lancelin Professeur, Université Claude Bernard, Lyon
M. Bruno Kieffer Professeur, Université Louis Pasteur/ESBS, Strasbourg
Examinateurs :
M. Bertrand Friguet Professeur, Université Pierre et Marie Curie, Paris VI
M. Manh-Thong Cung Directeur de Recherche, CNRS/INPL, Nancy
Mme Marie-Christine Averlant-Petit Chargée de Recher
Invités :
Mme Sandrine Boschi-Muller Professeur, Université Henri Poincaré, Nancy I
Mlle Pascale Tsan Maître de Conférences, Université Claude Bernard, Lyon


Laboratoire de Chimie Physique Macromoléculaire – UMR CNRS-INPL 7568
1, rue Grandville – BP 20451 – 54001 Nancy Cedex Table des matières



LISTE DES ABREVIATIONS............................................................................................................................4

AVANT PROPOS..............................................................................................................................................5

PARTIE 1 - INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................................................6

CHAPITRE 1 : CONTEXTE BIOLOGIQUE ...............................................................................................................7

I. La protéine DsbD : généralités................................................................................................................8

II. Le domaine C-terminal de DsbD (cDsbD).......................................................................................... 10
II.1. Etudes structurales à l’état libre.....................................................................................................................10
II.2. Etudes structurales à l’état complexé ............................................................................................................12

III. Le domaine transmembranaire de DsbD (tDsbD).............................................................................. 13
III.1. Les thiorédoxines..........................................................................................................................................13
III.1.1. Rôle des Trx ..........................................................................................................................................13
III.1.2. Mécanisme catalytique des Trx .............................................................................................................14
III.1.3. Aspects structuraux des Trx ..................................................................................................................15
III.1.4. Spécificité de substrat des Trx........................16
III.2. Le domaine transmembranaire de DsbD (tDsbD).........................................................................................17

IV. Le domaine N-terminal de DsbD (nDsbD)......................................................................................... 19
IV.1. Rôle fonctionnel de la formation et de l’isomérisation des ponts disulfure chez Escherichia coli .................19
IV.1.1. La disulfide oxydase DsbA et son régénérateur DsbB ..........................................................................21
IV.1.2. La protéine DsbC et son homologue DsbG...........................................................................................22
IV.1.2.1. Fonction d’isomérase .....................................................................................................................23
IV.1.2.2. Fonction de chaperon24
IV.1.3. nDsbD, activateur des voies de formation et d’isomérisation des ponts disulfure .................................25
IV.2. La voie de synthèse du cytochrome c. .........................................................................................................25
IV.2.1. Les cytochromes c bactériens et leurs systèmes de maturation ...........................................................25
IV.2.1.1. Les cytochromes c bactériens ........................................................................................................25
IV.2.1.2. Rôle des cytochromes c .................................................................................................................26
IV.2.1.3. Les différents systèmes de maturation des cytochromes c ............................................................27
IV.2.2. La protéine DsbE...................................................................................................................................28
IV.3. Le système de réparation des protéines oxydées ........................................................................................30
IV.3.1. Oxydation des méthionines par les formes activées de l’oxygène (FAO)..............................................30
IV.3.2. Conséquence de l’oxydation des méthionines ......................................................................................31
IV.3.3. Les méthionine sulfoxyde réductases ...................................................................................................31
IV.3.4. Le domaine N-terminal de PilB..............................................................................................................33
IV.4. Le domaine N-terminal de DsbD : aspects structuraux ................................................................................34
IV.4.1. Structure de nDsbD d’E. coli à l’état non lié34
IV.4.2. Les différents modes d’interaction de nDsbD sous forme de complexe ................................................35
IV.4.3. La fonction centrale de nDsbD....................38

V. Conclusion et problématique .............................................................................................................. 39

CHAPITRE 2 : LA RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE APPLIQUEE AUX PROTEINES ......................................... 41

I. Les principes de la RMN et le phénomène de résonance ................................................................... 41
I.1. Les principes...................................................................................................................................................41
I.2. Application aux protéines...............................43

II. Démarche pour l’étude structurale des protéines par RMN................................................................ 43
II.1. Attribution séquentielle.................................44
II.2. Résolution d’une structure tridimensionnelle en solution...............................................................................46
II.2.1. Les contraintes de distances spatiales ...................................................................................................46
1II.2.2. Les contraintes angulaires..................................................................................................................... 47
II.2.3. Les contraintes orientationnelles ........................................................................................................... 48
II.2.4. La modélisation moléculaire .................................................................................................................. 49
II.3. Les avancées technologiques....................................................................................................................... 50
II.3.1. L’appareillage .....................................................................................................