Analysis of the mechanism of induction of selected tetracycline repressor variants using molecular dynamics simulations and protein-ligand docking [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Ute Seidel

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Analysis of the Mechanism of Induction of selected Tetracycline Repressor Variants using Molecular Dynamics Simulations and Protein-Ligand Docking Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universtät Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Ute Seidel aus Nürnberg Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universtät Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 20.12. 2007 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. T. Clark Zweitberichterstatter: W. Hillen Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Januar 2004 bis November 2007 am Computer-Chemie-Centrum der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg. Danksagung Meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Tim Clark möchte ganz herzlich dafür danken, dass er mich für die Computer Chemie begeistert hat. Außerdem für das wunderbare Arbeitsklima und insbesondere für die Hilfsbereitschaft in allen Lebenslagen. In diesem Zusammenhang möchte ich mich auch bei Moni Clark bedanken. Danke Moni und Tim – danke für alles! Bei Dr. Harald Lanig möchte ich mich für die gute Betreuung, die unbezahlbaren Ratschläge und die interessanten Diskussionen rund um das Thema Proteinmodeling während der letzten vier Jahre bedanken. Herzlichen Dank schulde ich Dr.
Publié le : mardi 1 janvier 2008
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Analysis
of the Mechanism of Induction
of selected Tetracycline Repressor Variants
using
Molecular Dynamics Simulations
and Protein-Ligand Docking



Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universtät Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades



vorgelegt von


Ute Seidel
aus
Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Friedrich-Alexander-Universtät Erlangen-Nürnberg























Tag der mündlichen Prüfung: 20.12. 2007
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. T. Clark
Zweitberichterstatter: W. Hillen

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Januar 2004 bis November 2007 am
Computer-Chemie-Centrum der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.

Danksagung
Meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Tim Clark möchte ganz herzlich dafür danken,
dass er mich für die Computer Chemie begeistert hat. Außerdem für das wunderbare
Arbeitsklima und insbesondere für die Hilfsbereitschaft in allen Lebenslagen. In
diesem Zusammenhang möchte ich mich auch bei Moni Clark bedanken. Danke
Moni und Tim – danke für alles!
Bei Dr. Harald Lanig möchte ich mich für die gute Betreuung, die unbezahlbaren
Ratschläge und die interessanten Diskussionen rund um das Thema
Proteinmodeling während der letzten vier Jahre bedanken.
Herzlichen Dank schulde ich Dr. Matthias Hennemann für die endlose Geduld mit der
er sich all meinen Computerfragen und Problemen gewidmet hat.
Auch bei Dr. Frank „Bub“ Beierlein und Dr. Olaf Othersen möchte ich mich bedanken.
Sie haben mir mit ihren umfassenden Kenntnissen stets beiseite gestanden und
unsere gemeinsamen Projekte engagiert unterstützt.
Bei Isa Bundesmann bedanke ich mich ganz herzlich für die vielen aufmunternden
„Frauengespräche“ und allen Mitgliedern der Arbeitsgruppe möchte ich für die
angenehme Zusammenarbeit und die stetige Hilfsbereitschaft danken.
Dr. N. van Eikema Hommes Danke ich für die Hilfe bei den für mich unlösbaren
Hard- und Softwareproblemen.
Bei Dr. Oliver Scholz und Dr. Chris Berens bedanke ich mich für die Durchführung
und Auswertung der in vivo Tests, sowie die anregenden Diskussionen über TetR.
Ein besonderer Dank auch an meinen Freund Stefan für die sorgfältige Lektüre des
Manuskripts, die vielen klugen Hinweise und natürlich für sein Verständnis und seine
Geduld.
Für die finanzielle Unterstützung während der letzten Jahre möchte ich mich sowohl
bei meinem Vater also auch beim SFB 473 bedanken. Ohne diese Unterstützung
wäre es mir nicht möglich gewesen diese Arbeit anzufertigen.


Zusammenfassung
Diese Arbeit befasst sich mit der Anwendung von Moleküldynamik (MD) Simulationen
zur Studie der Auswirkung der Induktorbindung auf die Proteinumlagerungen im
Tetrazyclin Repressor (TetR). Hierbei wurden insbesondere der Induktionsmechanis-
mus des Tetrazyclinrepressors der Klasse D sowie einer Mutante mit reversem
Phänotyp der Klasse BD (revTetR (BD)) mit Hilfe von Langzeitsimulationen
aufgeklärt. Weiterhin wird eine High Throughput Docking Methode zum Auffinden
neuer Induktoren sowie Anti-Induktoren (Antagonisten) für das TetR (D) System
vorgestellt.

Simulationen am Wildtyp Tet Repressor TetR (D)
Moleküldynamiksimulationen wurden verwendet, um den Induktiosmechanismus des
Tetrazyclinrepressors aufzuklären. Dazu wurden MD-Simulationen mit und ohne
Induktor über einen Zeitraum von 50 ns durchgeführt. Als Induktoren wurden
Tetrazyclin und Anhydrotetrazyclin eingesetzt. Die Ergebnisse der langen MD-
Simulationen erlauben es uns das genaue Bindungsmotiv (Pharmakophor) für die
Induktion und die Strukturänderungen in der Bindetasche zu bestimmen. Diese
Erkenntnis fungiert als wichtige Voraussetzung, den Induktionsmechanismus
aufklären zu können und weiterhin dient sie als Basis für die zukünftige Entwicklung
eines neuen Antibiotikums, das den Resistenztmechanismus nicht hervorruft.
Die Auswertungen beider Simulationen deckten signifikante Unterschiede in den
Strukturen und dem dynamischen Verhalten auf, die sich auf die An- bzw.
Abwesenheit eines Induktors zurückführen lassen. Die Analyse der Normal-
schwingungen mit niedrigen Frequenzen (Low-Frequency Normal Modes, LFNM)
zeigte, dass der induzierte Zustand von TetR durch eine extrem niederfrequente
Schwingung mit einer großen Ähnlichkeit zur „Induktions-Mode“ gekennzeichnet
wird. Die „Induktions-Mode“ selbst wurde aus dem Unterschied der
Röntgenstrukturen des induzierten und nicht induzierten Repressorproteins
gewonnen. Die Animation der LFNM Schwingung aus der Simulation von TetR mit
ATc zeigte eindeutig, dass in der Röntgenstruktur nicht aufgelöste Bereiche des
Proteins eine bedeutende Rolle für die Induktion spielen. Insbesondere konnte die

flexible Schleife zwischen den Helices 8 und 9 als zentrale Regionen der
Induktionsbewegung identifiziert werden.

Schematische Darstellung der Unterschiede in den Bindungsinteraktionen zwischen TetR und
den Induktoren Tetrazyclin und Anhydrotetrazyclin.
Weitere Vergleiche der Aufenthaltswahrscheinlichkeiten der α-Kohlenstoffatome und
der Wechselwirkungsenergien zwischen Residuen für mit Tetrazyklin bzw. 5a,6-
Anhydrotetrazyklin induzierte und nicht-induzierte Strukturen zeigen einen
eindeutigen Induktionsmechanismus auf. Dieser hätte so nicht aus den
Röntgenstrukturen abgeleitet werden können, da diese speziell in diesem Abschnitt
nicht komplett aufgelöst sind. Weiterhin wurden die Abstände zwischen Aminosäuren
aus dem in den Kristallstrukturen nicht aufgelösten Bereich ermittelt, so dass
Aminosäurereste, die eine Schlüsselrolle für die Induktion spielen, identifiziert
werden konnten.
Alle Ergebnisse aus diesen Untersuchungen weisen in eine gemeinsame Richtung
für den Induktionsmechanismus. Dabei wird, wie in der Abbildung unten vereinfacht
dargestellt, in der Bindetasche Aspartat 156 mit Hilfe des Induktors vom Magnesium
verdrängt. Dadurch wird eine Kaskade an weiteren Umlagerungen ausgelöst, die
letztendlich zum Auflösen der Salzbrücke (Lys47’-Asp22) führt. Als Resultat aus den
Ergebnissen, die aufgrund der Analysen gewonnen wurden, lässt sich schließen,
dass diese Umlagerungen ursächlich für das Auseinanderweichen der Bindeköpfe
verantwortlich sind. Der ursprünglich über die Salzbrücke Lys47’-Asp22“ fixierte

ideale Bindungsabstand wird vergrößert und ist nun nicht mehr komplementär zum
Abstand der DNA-Helixfurche. Die Bindungsaffinitat des Tet Repressors zum Operon
wird somit herabgesetzt und TetR diffundiert von der DNA ab. Dieser Mechanismus
steht in guter Übereinstimmung mit den experimentellen Ergebnissen, hätte jedoch
nicht aus den Kristallstrukturen alleine abgeleitet werden können.
a)
b)

Schematische Darstellung des Induktionsmechanismus basierend auf den MD Analysen für
TetR a) nicht-induzierter Zustand and b) induzierter Zustand mit Tc. Die großen Kreise
repräsentieren die DNA-Bindeköpfe.

Simulationen am inversen Phänotyp revTetR (BD)
Ebenso wie für den Wildtyp wurden auch für den inversen Phänotyp (revTetR)
Langzeitsimulationen von 50 ns durchgeführt. Die inverse Mutante von TetR zeichnet
sich dadurch aus, dass sie im Gegensatz zu TetR (D) in Abwesenheit und nicht in
der Abwesenheit eines Induktors induziert ist. Dieser Phänotyp wird dadurch
verursacht, dass der DNA-Bindekopfabstand im leeren revTetR zu kurz ist, um an die

DNA zu binden. Durch die Bindung eines Induktors weichen die Bindeköpfe genauso
wie im Wildtyp auseinander. Im Gegensatz zum Wildtyp TetR (D) jedoch, wo die
Vergrößerung des Abstands zur Induktion führt, wird hierdurch beim inversen
Phänotyp der ideale Bindekopfabstand erreicht.
Low Frequency Nomal Mode Analysen zeigen, dass der inverse Charakter von
revTetR anhand der Kriterien, die ursprünglich für den Wildtyp aufgestellt wurden,
von den Simulationen gut wiedergegeben wird. Ebenso wie für TetR (D) konnte auch
hier eine LFNM mit einer sehr niederfrequenten Schwingung identifiziert werden, die
für die inverse Mutante ohne Induktor (hier: induziert) diagnostisch ist.


Schematischer Vergleich der Phasen zwischen der “Induktionsmoden”-Low-Frequency Normal
Vibrations von TetR (BD) (rot) and revTetR ohne Induktor (blau).
Mit Hilfe der Auswertungen wurde aufgezeigt, dass der Mechanismus weitgehende
Übereinstimmungen mit dem Wildtyp aufweist. Es muss jedoch ein anderer Weg
bzw. eine andere Interaktionkaskade gewählt werden, um die Induktion von der
Bindetasche zur Effektorstelle weiterleiten zu können. Über die Interaktionsenergien,
sowie die Abstandsanalysen, konnten die Aminosäuren, die maßgeblich an der
Umschaltung zwischen den beiden Zuständen beteiligt sind, identifiziert und ein

Mechanismus für die Induktion des inversen Phänotyps abgeleitet werden. Wie in der
folgenden Abbildung schematisch dargestellt, verlaufen die entscheidenden
Interaktionen für den induzierten Zustand horizontal, wohingegen die für den nicht-
induzierten Zustand vorwiegen vertikal ausgeprägt sind. Anhand der Auswertungen
konnte herausgefunden werden, dass die Interaktion im leeren revTetR zwischen der
mutierten Aminosäure Glu95 und His62 für den inversen Charakter verantwortlich ist.
Diese verkürzt zusammen mit der Salzbrücke zischen Glu22 und Lys47’ den
Bindekopfabstand. Die Interaktion von Glu95 zu His62 wird durch die
Induktorbindung aufgelöst, da das benachbarte His63 in die ATc-Bindung involviert
ist.


Aminosäuren welche maßgeblich an der Umschaltung zwischen induziertem (blau) und nicht-
induziertem (rot) Zustand beteiligt sind.
Dadurch kann Helix 4 in eine „Wildtyp-Konfiguration“ relaxieren, was ein Umschalten
zwischen den beiden Interaktionsmustern zur Folge hat. Ein Wechsel zwischen den
beiden Konformationen wird also ähnlich wie im Falle von TetR (D) durch die
Komplexierung von ATc initiiert, und die für den Mechanismus von TetR (D)
postulierte intermonomere Salzbrücke ist auch im inversen Mechanismus
konserviert.

High Throughput virtual Docking der Maybridge Datenbank
Das Programm QXP wurde eingesetzt, um die Maybridge Datenbank mit ca. 53.000
Strukturen nach Verbindungen zu durchsuchen, die an TetR (D) binden. Um die
Verlässlichkeit des verwendeten Docking-Algorithmus zu validieren, wurden vorab
die bekannten Strukturen Tc und ATc als Liganden verwendet. Für beide Moleküle
lieferten die Berechnungen ein zur Kristallstruktur vergleichbares Ergebnis.
Verwendet wurde ein flexibles Docking, wobei jedoch aus Rechenzeitgründen nur ein
Ausschnitt um die Bindetasche herangezogen wurde.
Mittels dem in der folgenden Abbildung erläutertem Screening-Verfahren und einer
empirischen Scoring-Funktion wurden alle Verbindungen bewertet. Die erhaltenen
vorausgesagten Bindungsaffinitäten wurden dann nach pI, also der Summe aller
Bindungsbeiträge, sortiert. Hierbei wurde festgestellt, dass die expliziten
Wechselwirkungen unterrepräsentiert waren, so dass die Kandidaten in einer
weiteren Analyse nach ihren Wasserstoffbrückenenergien sortiert wurden.
Kandidaten mit guten expliziten Wechselwirkungen wurden trotz schlechter pI-Werte
weiterhin berücksichtigt. Dieses erste, schnelle Screening und die anschließenden
Analysen, wurden als Auswahlkriterium für ein zweites Docking herangezogen. So
konnten 60 Kandidaten für ein weiteres, ausführlicheres Screening gefunden werden.
Für dieses wurde zusätzlich noch ein größeres TetR Modell von 38 Å Radius um die
Bindetasche herangezogen. Dabei sollte überprüft werden, ob eine Verbesserung
des gefundenen Bindungsmodus möglich ist. Wie wir erwartet hatten, konnte durch
das erweiterte Sampling eine Verbesserung des Bindungsmodus erreicht werden,
u. a. indem sterische Abstoßungen und interne Spannungen abgebaut wurden. Auch
die Wasserstoffbrückenenergien wurden verbessert, da durch das schnelle
Screening nicht alle Interaktionen gefunden wurden. Für die Verbindungen, die
ursprünglich nur aufgrund ihrer guten expliziten Interaktionen gewählt wurden,
brachte das erweiterte Screening deutlich verbesserte Bindungskonstanten, die z. T.
auf dem Niveau von Tc liegen. Somit konnten 7 Verbindungen für einen biologischen
Test vorgeschlagen werden. Einer der getesteten Kandidaten zeigte dabei eine
ähnliche Aktivität wie der Induktor Doxycycline. Gleichzeitig war jedoch die
gemessene Proteinkonzentration um ein dreifaches erhöht. Daraus lässt sich
vermuten, dass diese Verbindung toxisch ist und sich deshalb nicht als Induktor für
TetR eignet. Es konnte jedoch Kandidaten gefunden werden, die eine ähnliche
berechnete Bindungsaffinität wie Tetrazyclin oder Anhydrotetrazyclin aufweisen.

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