Analyzing the regulation of the subcellular localization of {β-catenin [beta-catenin] by fluorescence recovery after photobleaching [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Eva Isabelle Krieghoff

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Analyzing the Regulation of the Subcellular Localization of β-catenin by Fluorescence Recovery After Photobleaching Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Eva Isabelle Krieghoff aus Bonn Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder Erstberichterstatter: Prof. Dr. J. Behrens Zweitberichterstatter: Prof. Dr. T. Winkler Tag der Doktorprüfung: 6. April 2006 II Danksagung So viele Menschen haben mich während meiner Doktorarbeit begleitet und unterstützt, dass ich unmöglich alle im Einzelnen erwähnen kann. Ich danke allen Mitarbeitern der Experimentellen Medizin II für Hilfe in Computer- und Pipettierfragen, wissenschaftliche und nichtwissenschaftliche Diskussionen, Mitbringen von Schokolade, Obst und Gemüse, Zellaussaat, Literatursuche und eine gute Arbeitsatmosphäre. Besonders bedanke ich mich • bei Prof. Dr. Jürgen Behrens für die Möglichkeit, unter sehr guten Arbeitsbedingungen eine Dissertation in einem spannenden Bereich der Zell- und Molekularbiologie anzufertigen; • bei Prof. Dr. Thomas Winkler für die Übernahme des Zweitgutachtens; • bei PD Dr.
Publié le : dimanche 1 janvier 2006
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Analyzing the Regulation of the Subcellular
Localization of β-catenin by Fluorescence
Recovery After Photobleaching










Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades













vorgelegt von
Eva Isabelle Krieghoff
aus Bonn







Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg



































Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. D.-P. Häder

Erstberichterstatter: Prof. Dr. J. Behrens

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. T. Winkler

Tag der Doktorprüfung: 6. April 2006
II
Danksagung

So viele Menschen haben mich während meiner Doktorarbeit begleitet und
unterstützt, dass ich unmöglich alle im Einzelnen erwähnen kann. Ich danke allen
Mitarbeitern der Experimentellen Medizin II für Hilfe in Computer- und Pipettierfragen,
wissenschaftliche und nichtwissenschaftliche Diskussionen, Mitbringen von
Schokolade, Obst und Gemüse, Zellaussaat, Literatursuche und eine gute
Arbeitsatmosphäre.

Besonders bedanke ich mich
• bei Prof. Dr. Jürgen Behrens für die Möglichkeit, unter sehr guten
Arbeitsbedingungen eine Dissertation in einem spannenden Bereich der Zell-
und Molekularbiologie anzufertigen;
• bei Prof. Dr. Thomas Winkler für die Übernahme des Zweitgutachtens;
• bei PD Dr. Robert Slany als Zweitprüfer;
• bei Dr. Bernhard Mayr für methodische, statistische, formulierungs- und
computertechnische Beratung und zahllose Diskussionen über meine gesamte
Arbeit und die Interpretation von FRAP-Daten und damit de facto für die
Ermöglichung des FRAP-Projekts;
• bei Sigrid Weiler für die gute Zusammenarbeit auf den TIP-1-Projekt;
• bei Angela Döbler für die Lösung bürokratischer Probleme und für
Milchschaum am frühen Morgen;
• bei Felix und Christel für die Begleitung durch sämtliche Höhen und Tiefen der
letzten Jahre
• bei meiner Familie für die Unterstützung in jeder Hinsicht;
• und bei Torsten für alles.
IIIIndex

1 SUMMARY.......................................................................................................... 1
2 ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................... 2
3 INTRODUCTION................................................................................................. 3
3.1 The dual role of β-catenin..................................................................................................................3
3.2 β-catenin domains...............................................................................................................................5
3.3 β-catenin nuclear entry and exit......................................................................................................6
3.4 β-catenin regulators............................................................................................................................8
3.5 Live cell microscopy and FRAP analysis......................................................................................9
3.6 Elucidation of enrichment mechanisms by FRAP.....................................................................10
3.7 Detection of anchorage....................................................................................................................11
3.8 Aim of this work.................................................................................................................................12
4 MATERIALS AND METHODS.......................................................................... 13
4.1 Buffers and Media..............................................................................................................................13
4.1.1 Cloning procedures...................................................................................................................... 13
Western Blot and Co-IP 14
4.1.2 Yeast Two Hybrid .......................................................................................................................... 15
4.1.3 Cell Culture, Immunofluorescence and FRAP....................................................................... 17
4.1.4 Reporter assays ............................................................................................................................ 17
4.2 Kits.........................................................................................................................................................18
4.3 Enzymes................18
4.4 Technical Equipment........................................................................................................................18
4.5 Organisms............19
4.6 Cell Culture and Transfection.........................................................................................................19
4.7 Constructs............20
4.7.1 β-catenin and derivatives ............................................................................................................... 20
4.7.2 Interactors.......... 21
4.7.3 Activators.......................................................................................................................................... 22
4.7.4 Control proteins 22
4.7.5 Mammalian Two Hybrid.................................................................................................................. 22
4.7.6 Yeast Two Hybrid ............................................................................................................................ 23
4.7.7 Oligonucleotides for cloning 23
4.7.7.1 FRAP project oligonucleotides .................................................................................................. 23
4.7.7.2 Yeast Two Hybrid oligonucleotides........................................................................................... 25
4.8 Reporter assays.................................................................................................................................25
4.9 Co-Immunoprecipitation and Western Blot.................................................................................26
4.10 Immunofluorescence........................................................................................................................26
4.11 Yeast Two Hybrid screening...........................................................................................................27
4.12 Live cell imaging and FRAP assays..............................................................................................27
5 RESULTS.......................................................................................................... 29
5.1 YFP- β-catenin is functional in cell adhesion and Wnt signalling..........................................29
5.2 Establishing the experimental system.........................................................................................31
5.2.1 β-catenin localization................................................................................................................... 31
5.2.2 Nucleo-cytoplasmic shuttling.................................................................................................... 31
5.2.3 β-catenin mobility within one compartment .......................................................................... 34
5.3 Fine-mapping of transport activities within the β-catenin molecule....................................36
5.4 Impact of additional transport on β-catenin shuttling..............................................................42
5.5 Influence of APC................................................................................................................................46
5.6 APC truncation....49
5.7 Influence of axin and axin2/conductin.........................................................................................50
5.8 CRM-1 dependence of β-catenin cytoplasmic enrichment.....................................................53
5.9 Influence of E-cadherin....................................................................................................................55
5.10 Export in the absence of „facilitated diffusion“.........................................................................57
5.11 Influence of TCF4 on YFP- β-catenin.............................................................................................58
5.12 f BCL9 and Pygopus2..................................................................................................59
5.13 Influence of β-catenin on BCL9/Pygopus....................................................................................61
5.14 Independence of the observed effects of CFP-tags of the β-catenin interactors.............63
5.15 Influence of 14-3- ζ on β-catenin.....................................................................................................65
5.16 f CBP................................................................................................................................66
5.17 Influence of TIP-167
5.18 Insertion: TIP-1 and APC..................................................................................................................69
5.19.1 Perfusion experiments............................................................................................................ 72
5.19.2 Transfection of activators ...................................................................................................... 72
5.19.3 Effects on β-catenin in the presence of interactors........................................................ 73
5.20 Influence of other pathways77
6 DISCUSSION .................................................................................................... 79
6.1 Regulation of β-catenin beyond degradation.............................................................................79
6.2 Adaptation of FRAP analyses to detect regulation...................................................................80
V
6.3 Interpretation of FRAP data.............................................................................................................82
6.4 Significance of FRAP data for the in vivo situation..................................................................84
6.5 Maximization of effects....................................................................................................................86
6.6 Complementation of FRAP data.....................................................................................................88
6.7 Further tasks.......................................................................................................................................90
7 LITERATURE.................................................................................................... 95
8 ABBREVIATIONS............................................................................................102
9 ANNEX: HALF RECOVERY TIMES ................................................................103
9.1 compartment bleach experiments (Half Recovery Times in minutes)............................... 103
9.2 point bleach experiments (Half Recovery Times in seconds).............................................. 105
10 PUBLICATION .............................................................................................107

VISummary
1 Summary

β-catenin is the central signal transducer of the canonical Wnt signalling pathway. In
unstimulated cells, β-catenin links cell adhesion molecules of the cadherin family to
the actin cytoskeleton at adherens junctions. Any free β-catenin is phosphorylated by
GSK3 β and Casein Kinase 1 ε in a destruction complex also containing the tumour
suppressor APC and one of the scaffold proteins axin or axin2/conductin, leading to
β-catenin ubiquitination and proteasomal degradation. Activation of the Wnt pathway
inhibits the destruction complex and the stabilized β-catenin enters the nucleus and
co-activates Wnt target genes in a complex with TCF transcription factors and very
likely also BCL9/Pygopus. The aim of this study was to functionally characterize
mechanisms that modulate the transcriptional activity of β-catenin independently of
its regulated degradation.
Many β-catenin interactors can alter the subcellular distribution of β-catenin. Most
prominently, TCFs and the BCL9/Pygopus complex enrich β-catenin in the nucleus,
whereas APC and axin shift it to the cytoplasm. Particularly for APC, but also for axin
it had been suggested that those proteins actively export β-catenin from the nucleus
in a CRM-1 dependent manner, but it had not been shown that either factor really
accelerates the nuclear exit kinetics of β-catenin. Within this work, I therefore
established an experimental system based on live cell imaging and fluorescence
recovery after photobleaching (FRAP) that allows the direct visualization of the
impact of specific factors on the subcellular localization, on the mobility within a given
compartment and most importantly on the kinetics of the nucleo-cytoplasmic shuttling
of fluorescently labelled β-catenin. I found that distinct regions within the β-catenin
protein contribute to its efficient intrinsic nucleo-cytoplasmic shuttling or to its nuclear
or cytoplasmic enrichment. The analysis of the effects of a variety of β-catenin
interactors showed that APC, axin and axin2, TCF4, BCL9, the PDZ protein TIP-1
which I also identified as an APC interactor in a Yeast Two Hybrid screen, and a
fragment of the transcriptinal co-activator CBP slowed down β-catenin shuttling and
also in part its intranuclear or intracytoplasmic mobility to varying degrees, indicating
that they regulate the subcellular localization of β-catenin via retention rather than
transport. Activation of the Wnt pathway by Wnt-3a, in contrast, led to a slight
acceleration of β-catenin shuttling; however, the underlying mechanism remains to
be identified. FRAP analysis has thus proved a useful tool to determine important
regulatory mechanisms within the Wnt pathway.
1Zusammenfassung
2 Zusammenfassung

β-Catenin ist das zentrale Signalmolekül innerhalb des kanonischen Wnt-
Signaltransduktionsweges. In unstimulierten Zellen verbindet β-Catenin an
Adhärenzverbindungen Zelladhäsionsmoleküle der Cadherin-Familie mit dem
darunterliegenden Aktin-Zytoskelett, und freies β-Catenin wird von GSK3 β und Casein-
Kinase 1 ε phosphoryliert. Das geschieht innerhalb eines „Zerstörungs“-Komplexes, der
außerdem den Tumorsuppressor APC und eins der Strukturproteine Axin oder
Axin2/Conductin enthält, und führt zur Ubiquitinierung und letztendlich zum
proteasomalen Abbau von β-Catenin. Die Aktivierung des Wnt- Signalwegs hemmt den
Zerstörungskomplex, das stabilisierte β-Catenin dringt in den Zellkern ein und koaktiviert
Wnt-Zielgene zusammen mit Transkriptionsfaktoren der TCF-Familie und wahrscheinlich
auch mit BCL9 und Pygopus.
Das Ziel dieser Untersuchung war die funktionelle Charakterisierung von Mechanismen,
die die transkriptionelle Aktivität von β-Catenin unabhängig von seiner Degradation
regulieren. Viele β-Catenin-Interaktoren können die Lokalisation von β-Catenin in der
Zelle ändern. Die bekanntesten sind TCF-Faktoren und BCL9/Pygopus, die β-Catenin im
Zellkern anreichern, und APC und Axin mit dem entgegengesetzten Effekt. Besonders
für APC, aber auch für Axin wurde vorgeschlagen, dass sie in Abhängigkeit von CRM-1
β-Catenin aktiv aus dem Zellkern exportieren, aber eine Beschleunigung der
Exportkinetik von β-Catenin durch einen dieser Faktoren wurde nicht gezeigt. In dieser
Arbeit habe ich daher ein auf Lebendzell-Mikroskopie und Fluoreszenzerholung nach
Fotobleichen (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) basierendes System
entwickelt, das die direkte Beobachtung der Effekte ermöglicht, die bestimmte Faktoren
auf die Lokalisation, Beweglichkeit und vor allem die Hin- und Herbewegung zwischen
Kern und Zytoplasma („shuttling“) ausüben. Damit konnte ich zeigen, dass spezifische
Bereiche des β-Catenin-Proteins eine Rolle für seine Translokation oder seine Verteilung
zwischen Kern und Zytoplasma spielen. Untersuchungen zum Einfluss verschiedener β-
Catenin-Bindungspartner ergaben, dass APC, Axin und Axin2, TCF4, BCL9, das PDZ-
Protein TIP-1, welches ich auch als neuen Interaktor für APC identifizieren konnte, und
ein Fragment des transkriptionellen Koaktivators CBP alle die Translokation von β-
Catenin zwischen Kern und Zytoplasma und zum Teil auch seine Beweglichkeit
innerhalb eines Kompartiments herabsetzen. Das deutet darauf hin, dass sie β-Catenin
vor allem durch Zurückhalten in einem Zellkompartiment regulieren, nicht durch aktiven
Ex- oder Import. Aktivierung des Wnt-Signalweges durch Wnt-3a führte dagegen zu
einer leichten Verschnellerung des β-Catenin-Shuttlings, wobei der zugrundeliegende
Mechanismus noch der Klärung bedarf. FRAP-Untersuchungen stellen also ein
nützliches Werkzeug dar, um wichtige regulatorische Mechanismen innerhalb des Wnt-
Signalweges aufzuklären.

2Introduction
3 Introduction

3.1 The dual role of β-catenin

β-catenin (or armadillo in Drosophila) has two major functions within eukaryotic cells
(Fig.1). On the one hand, β-catenin mediates the formation of stable adherens
junctions by simultaneously binding to cell-cell adhesion molecules of the cadherin
family such as E-cadherin and to α-catenin, a protein which can both directly and
indirectly bind to the underlying actin cytoskeleton (for a review on cell adhesion, see
(Perez-Moreno et al., 2003)); recent evidence suggests that the link between
cadherin complexes and actin may be indirect because binding of α-catenin to β-
catenin and actin or actin associated proteins appears to be mutually exclusive
(Drees et al., 2005; Yamada et al., 2005). On the other hand, β-catenin is the major
signal transducer within the canonical Wnt signalling pathway, acting as a
transcriptional co-activator in a complex with LEF/TCF transcription factors (Behrens
et al., 1996; Molenaar et al., 1996). In unstimulated cells, β-catenin protein is
continuously produced, but any free, cytoplasmic β-catenin is phosphorylated by the
β-catenin destruction complex and thereby earmarked for proteasomal degradation.
The core components of this destruction complex are the tumour suppressor
Adenomatous Polyposis Coli (APC) (Rubinfeld et al., 1993; Su et al., 1993), the
scaffold proteins axin or conductin/axin2 (Behrens et al., 1998; Hart et al., 1998;
Kishida et al., 1998), and two serine/threonine kinases, Casein Kinase 1 ε (CK1 ε) and
Glycogen Synthase Kinase 3 β (GSK3 β) (Liu et al., 2002; Rubinfeld et al., 2001),
which phosphorylate four critical residues in the β-catenin N-terminus, namely S45,
T41, S37 and S33. This phosphorylation leads to ubiquitination of β-catenin protein
by the β-TrCP ubiquitin ligase complex and its rapid degradation at the proteasome
(Aberle et al., 1997). When Wnt ligands bind to their receptors, Frizzled (Bhanot et
al., 1996) and LRP5/6 (Pinson et al., 2000; Tamai et al., 2000), GSK3 β is inactivated
by a largely unknown mechanism involving the Dishevelled protein (Boutros and
Mlodzik, 1999; Klingensmith et al., 1994; Noordermeer et al., 1994). In parallel axin,
the scaffold of the destruction complex, is recruited to the membrane and
destabilized, in a process that is currently under intense investigation and involves
the interplay of several protein kinases (Davidson et al., 2005; Mi et al., 2005; Zeng
et al., 2005).
3Introduction

Fig. 1: Schematic view of the Wnt signalling pathway.
Under basal conditions β-catenin is a component of cadherin-based adherens junctions and excess cytoplasmic
β-catenin is degraded at the proteasome. Upon binding of Wnts, β-catenin is stabilized, enters the nucleus and
co-activates TCF target genes.


This ultimately leads to the stabilization and thus to the accumulation of β-catenin, to
its subsequent entry into the nucleus and to the activation of Wnt target genes, which
are implicated in stem cell maintenance, proliferation and invasion. A recently
characterized complex of B-Cell Lymphoma 9 (BCL9; legless in Drosophila) and its
nuclear interaction partner Pygopus (Kramps et al., 2002; Thompson et al., 2002) has
been reported to further enhance the transcription of those target genes both by
recruiting β-catenin into the nucleus (Townsley et al., 2004) and by directly
functioning as co-transcription factors in the TCF/ β-catenin complex (Hoffmans et al.,
2005; Stadeli and Basler, 2005). In up to 80% of sporadic and inherited colorectal
cancers, β-catenin is aberrantly stabilized due to truncating mutations in the APC
gene, which eliminate the APC SAMP repeats that interact with axin or conductin,
4

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