Bacterial cytochrome P450 monooxygenases [Elektronische Ressource] : investigations on redox partners and optimization for whole-cell biocatalysis / vorgelegt von Marco Girhard

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Bacterial Cytochrome P450 Monooxygenases: Investigations on Redox Partners and Optimmizatioon for WWhole-Cell BBiocataalysis Inauguural-Disseertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathemaatisch-Naaturwissenschaftlicchen Fakkultät der Heinrich-Heiine-Universität Düsseldorf vorgelegt von Marco Girhard auus Dernbaach Düsseldorf, November 2010 Aus dem Institut für Biochemie, Lehrstuhl II der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Gedruckt mit der Genehmigung der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Referent: Prof. Dr. Vlada B. Urlacher Koreferent: Prof. Dr. Martina Pohl Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2010 Eidesstattliche Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Düsseldorf, 17.11.2010 ________________________ (Marco Girhard) Also lautet ein Beschluß, Daß der Mensch was lernen muß. – Doch nicht allein das Abc Bringt den Menschen in die Höh’; Nicht allein in Rechnungssachen Soll der Mensch sich Mühe machen, Sondern auch der Weisheit Lehren Muß man mit Vergnügen hören.
Publié le : vendredi 1 janvier 2010
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Bacterial Cytochrome P450 Monooxygenases:
Investigations on Redox Partners and
Optimmizatioon for WWhole-Cell BBiocataalysis





Inauguural-Disseertation




zur Erlangung des Doktorgrades
der Mathemaatisch-Naaturwissenschaftlicchen Fakkultät
der Heinrich-Heiine-Universität Düsseldorf




vorgelegt von

Marco Girhard
auus Dernbaach




Düsseldorf, November 2010





Aus dem Institut für Biochemie, Lehrstuhl II
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf


























Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der
Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf

Referent: Prof. Dr. Vlada B. Urlacher
Koreferent: Prof. Dr. Martina Pohl
Tag der mündlichen Prüfung: 17.11.2010

Eidesstattliche Erklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und nur unter
Verwendung der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe.



Düsseldorf, 17.11.2010 ________________________
(Marco Girhard)













Also lautet ein Beschluß,
Daß der Mensch was lernen muß. –
Doch nicht allein das Abc
Bringt den Menschen in die Höh’;
Nicht allein in Rechnungssachen
Soll der Mensch sich Mühe machen,
Sondern auch der Weisheit Lehren
Muß man mit Vergnügen hören. –


Frei nach Wilhelm Busch; Max und Moritz (1865) – Vierter Streich

Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:

Seiten 25-56: Gedruckt mit freundlicher Genehmigung von Springer aus der
Publikation: „Characterization of the versatile monooxygenase CYP109B1 from
Bacillus subtilis“, M. Girhard, T. Klaus, Y. Khatri, R. Bernhardt and V.B. Urlacher,
2010, Applied Microbiology and Biotechnology, 87(2):595-607.
Originalpublikation unter: http://www.springerlink.com

Seiten 57-71: Frei zugänglicher Artikel, lizenziert unter „Creative Commons“, aus der
Publikation: „Regioselective biooxidation of (+)-valencene by recombinant E. coli
expressing CYP109B1 from Bacillus subtilis in a two liquid phase system“, M.
Girhard, K. Machida, M. Itoh, R.D. Schmid, A. Arisawa and V.B. Urlacher, 2009,
Microbial Cell Factories 8:36.
Originalpublikation unter: http://www.microbialcellfactories.com

Seiten 72-99: Gedruckt mit freundlicher Genehmigung von Springer aus der
Publikation: „Regioselective hydroxylation of norisoprenoids by CYP109D1 from
Sorangium cellulosum“, Y. Khatri, M. Girhard, A. Romankiewicz, M. Ringle, F.
Hannemann, V.B. Urlacher, M.C. Hutter and R. Bernhardt, 2010, Applied
Microbiology and Biotechnology, 88(2):485-495.
Originalpublikation unter: http://www.springerlink.com

Seiten 100-106: Gedruckt mit freundlicher Genehmigung von Elsevier aus der
Publikation: „Cytochrome P450 monooxygenase from Clostridium acetobutylicum: A
new fatty acid hydroxylase“, M. Girhard, S. Schuster, M. Dietrich, P. Dürre and V.B.
Urlacher, 2007, Biochemical and Biophysical Research Communications,
362(1):114-119.
Originalpublikation unter: http://www.sciencedirect.com/science/journal/0006291X

Seiten 107-117: Gedruckt mit freundlicher Genehmigung von Elsevier aus der
Publikation: „Expression, purification and characterization of two Clostridium
acetobutylicum flavodoxins: Potential electron transfer partners for CYP152A2“, S.
Honda Malca, M. Girhard, S. Schuster, P. Dürre and V.B. Urlacher, 2010, Biochimica
et Biophysica Acta, doi:10.1016/j.bbapap.2010.06.013.
Originalpublikation unter: http://www.sciencedirect.com/science/journal/15709639

Danksagung

Ich bin vielen Personen zu Dank verpflichtet, ohne die die Erstellung dieser Arbeit
nicht möglich gewesen wäre!

Mein ganz besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Vlada Urlacher für die Überlassung
des interessanten Themas, die hervorragende Betreuung, gute Arbeitsbedingungen,
unermüdliches Interesse und Unterstützung, kritische Diskussionen und viele
hilfreiche Tipps für meine Arbeit. Außerdem möchte ich mich für die
Erstbegutachtung meiner Arbeit bedanken.

Frau Prof. Dr. Martina Pohl danke ich für die freundliche Übernahme des Koreferats.

Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Rolf D. Schmid und Herrn Prof. Dr. Bernhard Hauer für
Ihre Unterstützung und die hervorragenden Arbeitsbedingungen während meiner Zeit
am Institut für Technische Biochemie an der Universität Stuttgart.

Herrn Dr. Akira Arisawa möchte ich stellvertretend für alle Kollegen der Firma
Mercian Corporation danken, die meinen dreimonatigen Forschungsaufenthalt in
Japan zu einem unvergesslichen Erlebnis gemacht haben.

Frau Prof. Dr. Rita Bernhard und Herrn Dr. Yogan Khatri danke ich für die fruchtbare
Kooperation und hervorragende Zusammenarbeit mit dem Institut für Biochemie der
Universität des Saarlandes.

Für die Zusammenarbeit im Sesquiterpenprojekt danke ich Herrn Dr. Jens Schrader
und Herrn Dr. Dirk Holtmann (Dechema e.V.).

Danke auch an Herrn Prof. Dr. Peter Dürre und Frau Stefanie Schuster vom Institut
für Mikrobiologie und Biotechnologie an der Universität Ulm für die Klonierung und
Überlassung von Plasmiden mit Genen aus C. acetobutylicum.

Mein Dank gilt ferner allen Diplomstudenten und Forschungspraktikanten, die mich
während meiner Arbeit unterstützt haben. Im einzeln waren dies: Tobias Klaus,
Sumire Honda Malca, Björn Mückschel, Svetlana Tihovsky, Marion Iwanizwa und
Sebastian Kriening.

Das gute Arbeitsklima und die freundschaftliche Zusammenarbeit mit meinen
Arbeitskollegen des Instituts für Biochemie, Lehrstuhl II und den ehemaligen
Kollegen des Instituts für Technische Biochemie haben ebenfalls zum Gelingen
meiner Arbeit beigetragen.

Für die finanzielle Unterstützung danke ich der Arbeitsgemeinschaft internationaler
Forschungsgemeinschaften (AiF) im Rahmen des Forschungsvorhabens 14781 N/2
(Entwicklung eines bioelektrochemischen Verfahrens zur selektiven in vitro
Hydroxylierung von Sesquiterpenen mit molekularbiologisch optimierten P450-
Monooxygenasen), sowie der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem
Ministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst des Landes Baden-Württemberg
im Rahmen des Sonderforschungsbereiches 706 (Katalytische Selektivoxidationen
von C–H-Bindungen mit molekularem Sauerstoff).

Zum Schluss möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mich während
meines Studiums immer in jeder Hinsicht unterstützt haben, und bei meinen
Freunden, die mir Rückhalt und Aufmunterung gaben, wenn es mit der Arbeit mal
schlechter lief. VI |
Table of contents
Zusammenfassung ................................................................................................ VIII
Abstract ..................................................................................................................... X
1. Introduction ................................................................................................ 1
1.1. Industrial biocatalysis (White biotechnology) ............................................. 1
1.1.1. Bulk and fine chemicals ................................................................................ 1
1.1.2. Flavors and fragrances ................................................................................. 2
1.2. Cytochrome P450 monooxygenases ............................................................ 4
1.2.1. Sources, functions and nomenclature ........................................................... 4
1.2.2. Structure ....................................................................................................... 5
1.2.3. Substrate binding .......................................................................................... 7
1.2.4. Catalytic mechanism ..................................................................................... 8
1.2.5. Catalyzed reactions .................................................................................... 11
1.2.6. Industrial application of P450s: Examples and limitations .......................... 12
1.3. Electron transfer proteins ............................................................................ 14
1.3.1. Topology ..................................................................................................... 14
1.3.2. Reductases, ferredoxins and flavodoxins ................................................... 16
1.3.2.1. Reductases ....................................................................................................... 17
1.3.2.2. Ferredoxins ....................................................................................................... 18
1.3.2.3. Flavodoxins ....................................................................................................... 20
1.4. Aim of the work ............................................................................................. 22
2. Results .......................................................................................................23
2.1. List of publications and publication manuscripts ..................................... 23
2.1.1. Accepted manuscripts in peer reviewed journals ........................................ 23
2.1.2. Reviews in peer reviewed books ................................................................ 24
2.1.3. Patents ........................................................................................................ 24
2.2. CYP109B1 from Bacillus subtilis and CYP109D1 from Sorangium
cellulosum ..................................................................................................... 25
2.2.1. Manuscript: Characterization of the versatile monooxygenase CYP109B1
from Bacillus subtilis ................................................................................... 25
2.2.1.1. Abstract ............................................................................................................. 26
2.2.1.2. Introduction ....................................................................................................... 26
2.2.1.3. Materials and methods ..................................................................................... 29
2.2.1.4. Results and discussion ..................................................................................... 35Table of contents | VII
2.2.1.5. Discussion ........................................................................................................ 47
2.2.1.6. Acknowledgements ........................................................................................... 48
2.2.1.7. Conflict of interest ............................................................................................. 49
2.2.1.8. References (to chapter 2.2.1) ........................................................................... 49
2.2.1.9. Supplementary Material .................................................................................... 54
2.2.2. Manuscript: Regioselective biooxidation of (+)-valencene by recombinant
E. coli expressing CYP109B1 from Bacillus subtilis in a two liquid phase
system ........................................................................................................ 57
2.2.2.1. Supplementary Material70
2.2.3. Manuscript: Regioselective hydroxylation of norisoprenoids by CYP109D1
from Sorangium cellulosum ........................................................................ 72
2.2.3.1. Abstract ............................................................................................................. 73
2.2.3.2. Introduction ....................................................................................................... 73
2.2.3.3. Material and methods ....................................................................................... 75
2.2.3.4. Results .............................................................................................................. 81
2.2.3.5. Discussion ........................................................................................................ 89
2.2.3.6. Acknowledgments ............................................................................................. 92
2.2.3.7. References (to chapter 2.2.3) ........................................................................... 92
2.2.3.8. Supplementary Material .................................................................................... 98
2.3. CYP152A2 from Clostridium acetobutylicum .......................................... 100
2.3.1. Manuscript: Cytochrome P450 monooxygenase from Clostridium
acetobutylicum: A new -fatty acid hydroxylase ....................................... 100
2.3.2. Manuscript: Expression, purification and characterization of two Clostridium m flavodoxins: Potential electron transfer partners for
CYP152A2 ................................................................................................ 107
2.3.2.1. Supplementary Material .................................................................................. 116
3. Discussion and Outlook .........................................................................118
3.1. Cytochrome P450 monooxygenases for biocatalysis ............................. 118
3.1.1. Screening, protein expression and purification ......................................... 118
3.1.2. Substrate and product spectra .................................................................. 119
3.1.2.1. Substrate and product spectrum of CYP109B1 ............................................. 119
3.1.2.2.ectrum of CYP152A2 121
3.1.3. Activity reconstitution ................................................................................ 122
3.2. Whole-cell biocatalysis .............................................................................. 123
4. References ...............................................................................................125
5. Appendix ..................................................................................................138 VIII |
Zusammenfassung
Die Selektivoxidation von C-H Bindungen stellt in der synthetischen organischen
Chemie ein weitgehend ungelöstes Problem dar. Diese Reaktion kann hingegen von
Cytochrom P450 Monooxygenasen (P450 oder CYP) bei Raumtemperatur in einem
einzigen Reaktionsschritt bewerkstelligt werden, was diese Enzymklasse für
industrielle Biotransformationen hochinteressant macht. Cytochrom P450 Enzyme
gehören zur Familie Häm b enthaltender Monooxygenasen und katalysieren die
Spaltung von molekularem Sauerstoff, wofür zwei Elektronen benötigt werden. Diese
werden in den meisten Fällen ausgehend von den Cofaktoren NADH oder NADPH
über externe Redoxproteine (Reduktasen und Flavodoxine oder Ferredoxine) auf die
Hämdomäne des P450 übertragen.
Durch die Entdeckung und Charakterisierung neuer P450 mit unterschiedlichen
Substratspezifitäten und Aktivitäten wird die Diversität von biotechnologisch
relevanten Reaktionen bzw. Produkten erweitert. Dafür steht ein stetig wachsender
Pool von derzeit mehr als 18.000 annotierten P450-Sequenzen zur Verfügung.
Allerdings wurde bisher nur ein Bruchteil dieser neuen P450 funktionell exprimiert
und charakterisiert. Ursächlich dafür sind unter anderem folgende Limitierungen:
1) Die Identifizierung von geeigneten Redoxpartnern, die sowohl für die Herstellung
der P450-Aktivität, als auch eine effiziente Biokatalyse mit P450 essentiell notwendig
sind, ist oftmals schwierig. So befinden sich zum Beispiel die Gene von
physiologischen Redoxproteinen meist nicht vor- oder nachgelagert des P450-Gens
im Genom. 2) Ferner ist die physiologische Funktion neuer P450 oft unbekannt, so
dass keine Aussagen über deren potentielle Substrate getroffen werden können, was
die Suche und Auswahl geeigneter P450-Kandidaten zeit- und arbeitsintensiv macht.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neue bakterielle P450 Enzyme,
CYP109B1 aus Bacillus subtilis und CYP152A2 aus Clostridium acetobutylicum
charakterisiert, ihre oxidative Aktivität mit Hilfe von verschiedenen Redoxpartnern
hergestellt, und das biotechnologische Potential beider Enzyme untersucht.
CYP109B1 wurde mittels Durchmusterung einer Bibliothek von 242 rekombinant in
E. coli exprimierten P450 aus Bakterien und Pilzen gefunden, da es als einziger
Kandidat das verwendete Substrat (+)-Valencen regio- und chemoselektiv zu
Nootkatol und (+)-Nootkaton oxidierte. (+)-Nootkaton ist ein Aromastoff, der
natürlicherweise in lediglich geringen Mengen in Grapefruitölen vorkommt und
Einsatz als Duft- und Geschmacksstoff in Parfüms und Lebensmitteln findet. Im
Folgenden wurde die Produktion von (+)-Nootkaton im größeren Maßstab mit einem

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