Caractérisation Structurale et Fonctionnelle de deux Enzymes de la Famille des Aldéhyde déshydrogénases : la Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase de B. stearothermophilus et l'Erythrose-4-Phosphate Déshydrogénase d'E. coli. : structures cristallographiques d'intermédiaires réactionnels et de complexes enzyme-substrat, Structural and functional characterization of two enzymes belonging to the aldehyde dehydrogenase family : the Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from B. stearothermophilus and the Erythrose-4-phosphate dehydrogenase from E. coli.

De
Publié par

Sous la direction de Catherine Corbier, Claude Didierjean
Thèse soutenue le 20 octobre 2008: Nancy 1
Si la GAPDH est une enzyme bien caractérisée sur le plan biochimique et structural, la contribution de ses deux sites de reconnaissance anionique lors de la catalyse reste incomprise et nécessitait la détermination des structures de l'intermédiaire thioacylenzyme et du complexe enzyme-produit. Ce manuscrit présente la mise au point des conditions de cristallisation et d'accumulation de l'intermédiaire thioacylenzyme (suivi par microspectrophotométrie) et du complexe enzyme-produit, la résolution et l'analyse des structures cristallographiques correspondantes ainsi que les implications pour le mécanisme catalytique. Les résultats obtenus mettent notamment en évidence un mouvement de va-et-vient du substrat au cours de la catalyse entre les deux sites de reconnaissance anionique qui est lié à l'étape d'échange du cofacteur. Bien que structuralement proche des GAPDH, l’E4PDH est une enzyme pour laquelle peu de données sont disponibles. De nombreuses questions restent donc posées concernant notamment les déterminants de l'affinité pour le cofacteur, la nature du site de reconnaissance anionique, ou encore le mécanisme d'activation de la molécule d'eau nécessaire à une étape d'hydrolyse efficace. Sont présentées dans ce manuscrit trois structures cristallographiques de l'E4PDH d'E. coli, sous forme apoenzyme, en présence de phosphate ou en complexe avec un analogue de cofacteur. L'analyse de ces structures a notamment permis de caractériser l'unique site de reconnaissance anionique de l'enzyme, de proposer des hypothèses quant à la faible affinité de l'enzyme pour le cofacteur, et d'identifier un candidat possible pour l'activation de la molécule d'eau hydrolytique.
-Aldéhydes déshydrogénases
-Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
Even if GAPDH is well characterized from a biochemical and structural point of view, the contribution of its two anion recognition sites to catalysis is still matter of debate. This work presents the crystallization, the strategy for the accumulation of the thioacylenzyme intermediate and for the obtaining of the enzyme-product complex, the resolution and analysis of the corresponding crystallographic structures and the implications in terms of reaction mechanism. The results mainly shed light on the existence of a flip-flop movement of the substrate between the two anion recognition sites during catalysis which is related to the cofactor exchange step. Although structurally related to GAPDHs, the E4PDH is an enzyme fairly less characterized. Many interrogations thus remain on the determinants of cofactor affinity, on the nature of the anion recognition site or on the mechanism of activation of the water molecule that is needed for an efficient hydrolysis step. This dissertation presents the resolution of three crystallographic structures of the E4PDH from E. coli, under the apoenzyme form, in the presence of phosphate or in complex with a cofactor analog. The analysis f these structures allows the characterization of the unique anion recognition site of this enzyme, to propose structural hypotheses to explain the low affinity of this enzyme for its cofactor and also to identify possible candidates for the activation of the nucleophilic water molecule.
Source: http://www.theses.fr/2008NAN10091/document
Publié le : mercredi 26 octobre 2011
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http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm FACULTÉ DES SCIENCES ET TECHNIQUES Na ncy-Univers ité
U.F.R SCIENCES & TECHNIQUES BIOLOGIQUES
~ .Université ÉCOLE DOCTORALE BIOLOGIE SANTÉ ENVIRONNEMENT
Henri Poincaré
Thèse
présentée pour l'obtention du titre de
Docteur de l'Université Henri Poincaré, Nancy 1
en Enzymologie Moléculaire et Biologie Structurale
par Sébastien MONIOT
Caractérisation Structurale et Fonctionnelle de deux Enzymes de la Famille des
Aldéhyde déshydrogénases : la Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase de
B. stearothermophilus et l'Erythrose-4-Phosphate Déshydrogénase d'E. coli.
Structures cristallographiques d'intermédiaires réactionnels et de complexes
enzyme-substrat.
Soutenue le 20 octobre 2008
Membres du Jury :
Monsieur Dominique BOURGEOIS Directeur de Recherche, CNRS, UJF, Grenoble,
rapporteur.
Monsieur Guy BRANLANT Professeur des Universités, UHP, Nancy 1, examinateur.
Monsieur Gérard BRICOGNE Directeur de Recherche, Global Phasing Limited,
Cambridge, Royaume-Uni, examinateur.
Madame Catherine CORBIER Professeur des Universités, UHP, Nancy 1, directeur de
thèse.
Monsieur Claude DIDIERJEAN Maître de Conférences - HDR, UHP, Nancy 1, co-
directeur de thèse.
Madame Michèle REBOUD-RAVAUX Professeur des Universités, UPMC, Paris VI, rapporteur.
Membre Invité :
Monsieur Claude LECOMTE Professeur des Universités, UHP, Nancy 1.
LABORATOIRE DE CRISTALLOGRAPHIE ET DE MODÉLISATION
DES MATÉRIAUX MINÉRAUX ET BIOLOGIQUES
Groupe Biocristallographie, UMR CNRS-UHP 7036, Faculté des
Institut Jean BarriolSciences et Techniques, 54500 Vandoeuvre-lès-Nancy.
ChImie et Physlque MoIécuJ res et BI U IresCe travail a été réalisé au Laboratoire de Cristallographie et de Modélisation des Matériaux
Minéraux et Biologiques (UMR CNRS-UHP 7036), dirigé par Monsieur le Professeur Claude
Lecomte. Je tiens à lui exprimer mes profonds remerciements pour m'avoir accueilli dans son
laboratoire où j'ai trouvé une très agréable ambiance de travail et dans lequel j'ai pu acquérir une
formation scientifique en cristallographie des rayons X.
J'exprime ma respectueuse reconnaissance à Madame le Professeur Michèle Reboud-
Ravaux et Monsieur le Docteur Dominique Bourgeois pour l'honneur qu'ils me font d'avoir accepté
d'évaluer ce travail en tant que rapporteurs et à Messieurs le Docteur Gérard Bricogne et le
Professeur Guy Branlant pour avoir accepté de juger cette thèse.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Madame le Professeur Catherine Corbier qui a
dirigé ce travail tout en me laissant une liberté de mouvement que j'ai beaucoup appréciée. Je la
remercie pour l'encadrement de qualité dont elle m'a fait profiter, pour sa disponibilité, sa patience
et sa grande générosité. Je lui suis particulièrement reconnaissant de m'avoir toujours accordé sa
confiance et de m'avoir toujours soutenu au cours de ces années, et en particulier dans les moments
plus difficiles. Je tiens également à remercier Monsieur le Docteur Claude Didierjean qui dirige
l'équipe de Biocristallographie du LCM3B et qui a co-encadré ce travail. Son expérience dans
l'obtention et l'analyse des structures cristallographiques de protéines a été très bénéfique sur la
qualité de ces travaux. Je lui suis également reconnaissant de m'avoir accorder son amitié
Je tiens également à remercier les différentes personnes qui, par leur collaboration, ont
contribué à ce travail de thèse. Les Professeurs Guy Branlant et Sandrine Boschi-Muller du MAEM
pour les discussions scientifiques pertinentes lors de l'analyse de mes résultats et Alexandre
Kriznick, pour m'avoir toujours fourni des échantillons protéiques de qualité ; Messieurs le
Professeur Andrea Mozzarelli et le Docteur Stefano Bruno de l'Université de Parme, pour leur
hospitalité et leur disponibilité lors de mes deux voyages en Italie et pour les discussions
scientifiques fructueuses concernant la microspectrophotométrie et la GAPDH ; Monsieur le
Docteur Clemens Vonrhein de Global Phasing pour son implication dans le délicat affinement des
structures de GAPDH avec le logiciel Buster-TNT et pour ses remarques pertinentes concernant
leurs interprétations.
J'exprime également ma profonde reconnaissance envers les Docteurs Frédérique Tete-
Favier et Guillermo Mulliert pour m'avoir transmis leurs connaissances en cristallographie et en
informatique, pour leur conseils éclairés tout au long de ce travail de thèse. Leur gentillesse et leur disponibilité m'ont été très précieuses.
J'adresse mes profonds remerciements à Monsieur le Directeur de Recherche André Aubry,
qui était directeur de l'équipe Biocristallographie au moment de mon arrivée au laboratoire, pour
son précieux soutien et sa sympathie, ainsi qu'au Professeur Omar B. Shawkataly avec qui j'ai
partagé de très agréables moments lors de son séjour en France.
Je tiens également à remercier Moutsé, Cha San, Hélène, William, Mickael, Bertrand, Brice
Helena, Dorothée et El-Eulmi qui ont été des compagnons de thèse très agréables et précieux. J'ai
partagé avec eux de formidables expériences et n'oublierai jamais leur soutien et leur amitié.
Je remercie Monsieur le Professeur Eric Chabrière, aujourd'hui à l'AFMB de Marseille, avec
lequel j'ai travaillé sur le sujet de la protéine DING qui m'a permis d'acquérir une expérience en
cristallographie à haute résolution.
Je remercie aussi toute l'équipe du LCM3B, chercheurs, techniciens et personnels
administratifs qui ont contribué à faire de ces cinq années passées au laboratoire une expérience si
bénéfique et assurément inoubliable. Je pense tout particulièrement à Sandrine Mathiot et
Alexandre Bouché pour leur aide et leur disponibilité et au Docteur Benoît Guillot pour son aide
dans la découverte de la haute résolution.
Je remercie également mes collègues enseignants et techniciens de l'IUT de Nancy-Brabois,
au sein duquel j'ai pu acquérir une expérience de l'enseignement. Leur disponibilité et leurs conseils
m'ont été très précieux et ont largement contribué aux très agréables souvenirs que me laisse cette
expérience.
Je remercie les membres des lignes de lumière de l'ESRF (ID14, BM30A, BM14, ID23 et
ID29) et de DESY (X11, X12, X13) sur lesquelles j'ai pu réaliser les différentes collectes de
données de diffraction au cours de ma thèse.
J'exprime enfin ma plus profonde reconnaissance à ma famille : mes frères Thierry et Hervé
et ma soeur Nadège pour avoir partagé ma vie durant ce travail et qui ont dû plus d'une fois
supporter mon stress et mon emploi du temps ; mes parents qui m'ont permis de faire ces études,
pour leurs perpétuels encouragements et leur confiance sans lesquels je n'aurais pu réussir.
Pour finir, un grand merci à Camille pour cette relecture estivale mais néanmoins attentive !Liste des Abréviations
(Bst)GAPDH Glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (de Bacillus
stearothermophilus)
(Eco)E4PDH Erythrose-4-phosphate déshydrogénase (d'Escherichia coli)
1,3-DPG (1,3DPG) 1,3-diphosphoglycérate
3-CAPAD 3-(chloroacétyl)pyridine adénine dinucléotide
3PG 3-phosphoglycérate
4PE 4-phosphoérythronate
Å Angstroem
ALDH Aldéhyde Déshydrogénase
apo (forme) Forme de la protéine n'ayant pas fixé sa molécule de cofacteur
B (Facteur) Facteur d'agitation thermique (en Ų)
Cα Carbone α
Da Dalton
DESY Deutschen Elektronen-Synchrotron
DTT Dithiothréitol
E4P Erythrose-4-phosphate
EDTA Acide éthylène diamine-tétraacétique
EMBL European Molecular Biology Laboratory
ESRF European Synchrotron Radiation Facility
Fc, F Facteur de structure calculécalc
FIP French beamline for Investigations of Proteins
Fo, F Facteur de structure observéobs
G3P Glycéraldéhyde-3-phosphate
holo Forme de la protéine ayant fixé sa molécule de cofacteur
IAA Acide iodoacétique
k Constante de vitessecat
K Constante de MichaëlisM
-1M Molaire (mol.L )
NAD(P) Nicotinamide adénine dinucléotide (phosphate)
PDB Protein Data Bank (banque de données des structures de protéines de
Brookhaven)PEG Polyéthylène glycol
PLP Pyridoxal-5'-phosphate
rmsd "root mean square deviation" écart quadratique moyen
SA Sulfate d'ammonium
TF Transformée de Fourier
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride Table des matières
Chapitre I :Étude Bibliographique...............................................9
Partie A : La Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase (GAPDH)....2
A.1. Les différentes classes de GAPDH...............................................................................2
A.2. Rôles physiologiques de la GAPDH.............................................................................3
A.3. Structures des GAPDH phosphorylantes....................................................................4
A.3.1. Structure primaire...................................................................................................4
A.3.2. Structure tridimensionnelle.....................................................................................4
A.3.2.1. Structure globale..........................................................................................4
A.3.2.2. Structure d'un monomère.............................................................................5
A.3.2.2.1. Le domaine de fixation du cofacteur.............................................................5
Le sous-site de fixation de l'adénosine.....................................................................6
Le pyrophosphate du NAD......................................................................................6
Le sous-site de fixation du nicotinamide..................................................................6
Transition apo-holo et conséquence sur la réactivité de l'enzyme............................7
A.3.2.2.2. Le domaine catalytique.................................................................................8
A.4. Le mécanisme catalytique de la GAPDH....................................................................9
A.4.1. L'acylation...............................................................................................................9
A.4.2. La désacylation.....................................................................................................10
A.5. Apport des études enzymologiques et structurales à la compréhension du
mécanisme réactionnel........................................................................................................11
A.5.1. Rôles des résidus du site actif...............................................................................11
A.5.1.1. Les résidus essentiels : cystéine et histidine..............................................11
A.5.1.2. Les sites de reconnaissances anionique......................................................12
A.5.1.2.1. Le site Ps....................................................................................................13
A.5.1.2.2. Le site Pi.....................................................................................................14
A.5.1.2.3. Apport de la mutagenèse-dirigée à l'étude des sites de reconnaissance
anionique.....................................................................................................................15
A.5.2. Structures cristallographiques de complexes enzyme-substrat.............................16
A.5.2.1. Structure de l'intermédiaire hémithioacétal de la GAPDH d'E. coli sous
forme apoenzyme.....................................................................................................17
A.5.2.2. Structure d'un complexe ternaire de la GAPDH de T. cruzi avec le NAD et
un inhibiteur covalent de la cystéine catalytique.....................................................18
A.5.2.3. Structure du complexe ternaire de type Michaelien de la BstGAPDH
(GAPDH - NAD - G3P)...........................................................................................19Partie B : L'érythrose-4-Phosphate déshydrogénase (E4PDH)...............21
B.1. Introduction.................................................................................................................21
B.2. Réaction catalysée par l'E4PDH et mécanisme réactionnel....................................22
B.3. Structures de l'E4PDH............23
B.3.1. Structure primaire.................................................................................................23
B.3.2. Structure tridimensionnelle...................................................................................24
B.3.2.1. Structure quaternaire..................................................................................24
B.3.2.1.1. Structure des monomères............................................................................25
Le domaine de fixation du cofacteur......................................................................25
Le domaine catalytique..........................................................................................26
B.3.2.1.2. Le site actif de l'enzyme..............................................................................26
Les résidus catalytiques..........................................................................................26
Le(s) site(s) de reconnaissance anionique..............................................................27
Objectifs des travaux de thèse.....................................................28
Chapitre II :Matériel et Méthodes..............................................30
Partie A : Principe de l'étude des protéines par cristallographie des
rayons X.....................................................................................................31
A.1. Préambule....................................................................................................................31
A.2. Principes généraux de la cristallisation des macromolécules biologiques..............31
A.2.1. Qu'est ce qu'un cristal ?........................................................................................31
A.2.2. Préparation de la protéine.....................................................................................32
A.2.3. Cristallogenèse......................................................................................................32
A.2.3.1. La diffusion de vapeur...............................................................................33
A.2.3.2. La méthode "batch"....................................................................................33
A.2.3.3. Un processus multi-paramétrique..............................................................34
A.3. Collecte et traitement des données de diffraction.....................................................35
A.3.1. Acquisition des données.......................................................................................35
A.3.1.1. Le rayonnement X......................................................................................35
A.3.1.1.1. Les Synchrotrons........................................................................................36
A.3.1.2. Préparation des cristaux : la cryocristallographie......................................37
A.3.1.3. Protocole de collecte..................................................................................38
A.3.2. Le traitement des données....................................................................................39
A.3.2.1. Indexation : détermination des paramètres de maille.................................39
A.3.2.2. Intégration des réflexions...........................................................................40
A.3.2.3. Mise à l'échelle et réduction du jeu de données.........................................40
A.3.2.4. Évaluation de la qualité du jeu de données................................................41
A.4. Résolution de structures par la cristallographie......................................................43
A.4.1. Le problème de la phase.......................................................................................43A.4.1.1. Les différentes méthodes de phasage.........................................................43
Méthode du remplacement isomorphe.......................................................................44
Diffusion anomale......................................................................................................44
Méthode de phasage direct.........................................................................................45
Le remplacement moléculaire....................................................................................46
A.4.2. Affinement du modèle..........................................................................................47
A.4.3. Les cartes de densité électronique........................................................................48
A.4.4. Validation du modèle............................................................................................49
Partie B : Procédures expérimentales.......................................................51
B.1. Généralités....................................................................................................................51
B.1.1. Les échantillons protéiques...................................................................................51
B.1.2. Les essais de cristallisation...................................................................................52
B.2. Cristallisation de la GAPDH......................................................................................53
B.2.1.1. Trempage des cristaux................................................................................54
B.3. Cristallisation de l'E4PDH..........................................................................................55
B.4. Collecte des données de diffraction............56
B.5. Phasage et affinement des structures cristallographiques.......................................57
Chapitre III : Contribution à l'étude du mécanisme réactionnel
de la Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase..................59
Partie A : Résultats....................................................................................60
A.1. Contexte et principaux résultats................................................................................60
A.2. Structure de l'intermédiaire réactionnel thioacylenzyme de la GAPDH de type
sauvage.................................................................................................................................62
A.2.1. Stratégie................................................................................................................62
A.2.2. Cristallogenèse et essais préliminaires de trempage des cristaux d'holoenzyme en
présence de substrat (G3P)..............................................................................................63
A.2.3. Expériences de microspectrophotométrie - Optimisation des conditions de
trempage .........................................................................................................................64
A.2.3.1. Préambule......64
A.2.3.2. Résultats des expériences de microspectrophotométrie.............................65
A.2.3.2.1. Expériences d'alkylation des cristaux de GAPDH......................................65
A.2.3.2.2. Incubation des cristaux de GAPDH holoenzyme en présence du substrat. .65
A.2.4. Enregistrement des données de diffraction...........................................................67
A.2.4.1. Cristaux PEG..............................................................................................67
A.2.4.2. Cristaux SA................................................................................................68
A.2.5. Présentation de la structure et qualité du modèle.................................................69
A.2.6. Étude du site actif de l'enzyme.............................................................................71
A.2.6.1. Conformation de l'intermédiaire réactionnel GAPDH-G3P-NADH..........71

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