Characterisation of the Salmonella pathogenicity island 4-encoded proteins SiiE, SiiA and SiiB [Elektronische Ressource] : a new mechanism of bacterial adhesion = Charakterisierung der Salmonella-Pathogenitätsinsel-4-kodierten Proteine SiiE, SiiA und SiiB / vorgelegt von Carolin Wagner

De
Characterisation of the Salmonella Pathogenicity Island 4-encoded proteins SiiE, SiiA and SiiB: a new mechanism of bacterial adhesion Charakterisierung der Salmonella Pathogenitätsinsel 4-kodierten Proteine SiiE, SiiA und SiiB: ein neuer Mechanismus der bakteriellen Adhäsion Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Carolin Wagner aus Forchheim Als Dissertation genehmigt von der Naturwissen- schaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 01. April 2011 Vorsitzender der Prüfungskommision: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Michael Hensel Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski „Inmitten der Schwierigkeiten liegt die Möglichkeit“ -Albert Einstein- DANKSAGUNG Mein erster Dank richtet sich an Prof. Dr. Michael Hensel, der es mir ermöglichte in seiner Arbeitsgruppe dieses spannende Thema zu bearbeiten und mir dabei stets hilfreich zur Seite stand. Dabei möchte ich mich besonders für die Betreuung über die weite Entfernung zwischen Erlangen und Osnabrück bedanken und für die Möglichkeit, meine Arbeit in Erlangen fertigzustellen. Prof. Dr.
Publié le : samedi 1 janvier 2011
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Characterisation of the Salmonella Pathogenicity
Island 4-encoded proteins SiiE, SiiA and SiiB:
a new mechanism of bacterial adhesion


Charakterisierung der Salmonella Pathogenitätsinsel 4-
kodierten Proteine SiiE, SiiA und SiiB:
ein neuer Mechanismus der bakteriellen Adhäsion




Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.


vorgelegt von
Carolin Wagner

aus Forchheim




Als Dissertation genehmigt von der Naturwissen-
schaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg








Tag der mündlichen Prüfung: 01. April 2011

Vorsitzender der
Prüfungskommision: Prof. Dr. Rainer Fink

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Michael Hensel

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski
































„Inmitten der Schwierigkeiten liegt die Möglichkeit“
-Albert Einstein-
DANKSAGUNG

Mein erster Dank richtet sich an Prof. Dr. Michael Hensel, der es mir ermöglichte in seiner
Arbeitsgruppe dieses spannende Thema zu bearbeiten und mir dabei stets hilfreich zur Seite stand.
Dabei möchte ich mich besonders für die Betreuung über die weite Entfernung zwischen Erlangen und
Osnabrück bedanken und für die Möglichkeit, meine Arbeit in Erlangen fertigzustellen.
Prof. Dr. Christian Bogdan möchte ich danken, dass er mir auch nach dem Umzug der Arbeitsgruppe
nach Osnabrück die Möglichkeit gab über einen langen Zeitraum noch am Institut weiterzuarbeiten.
Prof. Dr. Burkovski möchte ich für die Anfertigung des Zweitgutachtens danken und Prof. Dr. Yves
Muller und Dr. Frederik Börnke für das Abnehmen der Prüfung.
Weiterhin möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Mikrobiologischen Institutes bedanken, die
durch ihre Arbeit in der Nährbodenküche, beim Einkauf, in der Spülküche und in der
computertechnischen und handwerklichen Betreuung meine Arbeit erheblich erleichterten. Besonderer
Dank gilt den Sekretärinnen, die zusätzliche Arbeit auf sich nahmen um mir ein Weiterarbeiten in
Erlangen nach dem Umzug der Arbeitsgruppe zu ermöglichen.
Für die erfolgreiche Zusammenarbeit möchte ich mich bei den Arbeitsgruppen um Prof. Dr. Yves
Muller und Prof. Dr. Tilmann Schäffer, hier besonders Christoph Braunsmann, sowie Dr. Dirk Linke,
Dr. Heinz Schwarz und Dr. York Stierhof vom MPI und ZMBP Tübingen bedanken.
Ein ganz besonderer Dank gilt allen Mitarbeitern unserer Arbeitsgruppe, die durch tatkräftige
Unterstützung und die Schaffung einer angenehmen Atmosphäre zum Gelingen der Arbeit beigetragen
haben. Der allergrößte Dank gilt dabei Petra und Steffi, die mir ausnahmslos in allen Lagen hilfreich
zur Seite standen und die durch ihre Freundschaft das Leben im und außerhalb des Labors
verschönerten. Den Mitgliedern der LG-AGH, Petra, Steffi, Anja und Sandra danke ich für die
wöchentliche Trainingsstunde rund um den Schweißtropfenpfad, Tina und Britta für die schöne
gemeinsame, wenn auch zu kurze, Zeit.
Dani, Barbara und Anja danke ich für ihre technische und auch moralische Unterstützung, Roman für
die Weitergabe des SPI4-Projektes und Ralf für die mikroskopische Hilfe. Weiterhin danke ich allen,
die durch gemeinsame Unternehmungen das Leben außerhalb des Labors bereicherten. Den
Mitgliedern der AG Gessner danke ich für die freundliche Aufnahme während der Schreibphase.
Steffi, Petra, Deepak, Jörg, Claudia und natürlich Michael danke ich fürs Korrekturlesen.
Melanie und Claudia danke ich für ihren unübertrefflichen Einsatz während ihren Diplomarbeiten, die
schöne gemeinsame Zeit und bei Melanie für die Fußball-Debatten, auch wenn wir dabei
unterschiedlicher Auffassung sind. Bessere Diplomanden kann man sich einfach nicht wünschen.
Zum Schluss möchte ich noch den wichtigsten Personen in meinem Leben danken: meinen Eltern für
die moralische und finanzielle Unterstützung während meiner gesamten Studien- und Promotionszeit
und für ihre Liebe. Außerdem meinem Bruder Christian und meiner Schwägerin Dayane und meiner
Oma, die stets mit großem Interesse meine Studien- und Promotionszeit verfolgte und mit dem ein
oder anderen Kuchen versüßte. Einen ganz besonderen Dank an Richard, der mich immer in jeglicher
Form unterstützte und motivierte. Danke für deine Geduld und Liebe! TABLE OF CONTENT

I ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY .................................................................................................... 1
1 ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................................................. 1
2 SUMMARY.................. 3
II INTRODUCTION ....................................................................................................................................... 4
1 SALMONELLA ENTERICA .............................................................................................................................. 4
2 PATHOGENICITY OF SALMONELLA ENTERICA............................................................................................... 7
3 PATHOGENICITY ISLANDS ENCODE THE MAJORITY OF SALMONELLA ENTERICA VIRULENCE FACTORS ....... 10
4 ADHESIVE MECHANISMS OF SALMONELLA ENTERICA ................................................................................ 13
4.1 Miscellaneous adhesive structures................................................................................................ 14
4.2 Fimbrial adhesins.......................................................................................................................... 15
4.2.1 Chaperone-usher assembled fimbrial adhesins ......................................................................................... 16
4.2.2 Thin aggregative fimbriae: assembly through nucleation pathway........................................................... 18
4.2.3 Type IV pili .............................................................................................................................................. 19
4.2.4 Long polar fimbriae.................................................................................................................................. 20
4.3 Non-fimbrial adhesins................................................................................................................... 21
4.3.1 Autotransported adhesins.......................................................................................................................... 21
4.3.2 Adhesins secreted by type I secretion systems ......................................................................................... 23
5 SIIE AS VIRULENCE FACTOR ENCODED IN SPI4........................................................................................ 25
5.1 Genetic organisation and regulation of SPI4................................................................................ 25
5.2 Interplay of SPI4 with SPI1........................................................................................................... 28
5.3 SiiE is secreted via a type I secretion system 28
5.4 Domain organisation of SiiE..... 30
5.5 Possible functions of SiiA and SiiB ............................................................................................... 32
III AIM OF THE WORK............................................................................................................................... 34
IV MATERIAL AND METHODS ................................................................................................................ 35
1 MATERIAL............................................................................................................................................... 35
1.1 Chemicals and materials............................................................................................................... 35
1.2 Bacterial strains............................................................................................................................ 36
1.3 Plasmids........................................................................................................................................ 39
1.4 Oligonucleotides ........................................................................................................................... 40
1.5 Antibodies...................................................................................................................................... 46
1.6 General media for cultivation of bacteria and mammalian cells .................................................. 47
2 METHODS................. 48
2.1 Cultivation of bacteria.......... 48
2.2 Cell culture methods...................................................................................................................... 48
2.2.1 Cultivation of mammalian cells................................................................................................................ 48
2.2.2 Cell culture assays .................................................................................................................................... 49
i TABLE OF CONTENT
2.2.2.1 Invasion assays............................................................................................................................... 49
2.2.2.2 Adhesion assays............. 50
2.2.2.3 Binding assay for recombinant proteins......................................................................................... 50
2.3 Genetic methods............ 51
2.3.1 Generation of SiiE expression plasmids.......... 51
2.3.2 Sequencing ............................................................................................................................................... 52
2.3.3 Electro-transformation.............................................................................................................................. 52
2.3.4 Site-directed mutagenesis of siiB.............................................................................................................. 53
2.3.5 Generation of reporter fusions in siiA and siiB by Red-mediated recombination ..................................... 53
2.3.6 P22 transduction ....................................................................................................................................... 54
2.3.7 Construction of siiE deletion mutants by the use of the TetAR replacement-method............................... 55
2.4 Enzymatic assays............ 56
2.4.1 Quantification of alkaline phosphatase activity ........................................................................................ 56
2.4.2 Quantification of β-galactosidase activity................................................................................................. 57
2.5 Protein biochemical and immunological methods ........................................................................ 58
TM2.5.1 Coupling of SiiE antiserum with DyLight 488 ..................................................................................... 58
2.5.2 SDS-polyacrylamid gel electrophoresis.................................................................................................... 59
2.5.3 Detection of proteins using Coomassie-staining....................................................................................... 60
2.5.4 Western Blot and immunological detection of proteins............................................................................60
2.5.5 Far Western Blot....................................................................................................................................... 61
2.5.6 Synthesis and purification of recombinant proteins.................................................................................. 62
2.5.7 Methods to determine SiiE retention ........................................................................................................ 63
2.5.7.1 Microscopic analysis of SiiE retention on the bacterial surface ..................................................... 63
®2.5.7.2 Quantification of SiiE on bacterial cell surface using the Odyssey Imaging System ................... 63
2.5.7.3 Immunomagnetic separation of bacteria retaining SiiE (SIMPLE assay)....................................... 64
2.5.7.4 Quantification of SiiE retention using flow cytometry................................................................... 65
2.5.8 Quantification of secreted SiiE in culture supernatants by ELISA ........................................................... 66
2.5.9 Isolation of SiiE from culture supernatants for electron microscopy and AFM........................................ 66
2.5.10 Preparation of SiiE for electron microscopy............................................................................................. 66
2.5.11 Atomic force microscopy (AFM) ............................................................................................................. 66
2.6 Bioinformatics............................................................................................................................... 67
V RESULTS................................................................................................................................................... 68
1 DETAILED MOLECULAR ANALYSIS OF SIIE .............................................................................................. 68
1.1 Visualisation of SiiE and experimental proof of its repetitive structure........................................ 68
1.2 Interaction of SiiE with the host cell ............................................................................................. 71
1.2.1 Characterisation of mutants with deletions in the C-terminal domains of SiiE......................................... 71
1.2.2 Generation of recombinant SiiE and its capacity to bind to the host cell.................................................. 73
1.2.3 Involvement of sugar structures in SiiE-mediated invasion process of Salmonella.................................. 77
1.3 Role of SiiE secretion and retention for Salmonella invasion....................................................... 81
1.3.1 Correlation between SiiE retention and Salmonella invasion ................................................................... 81
1.3.2 Impact of deletions in chromosomal siiE on retention and secretion of SiiE............................................ 83
1.3.3 Influence of extracellular ions and pH on SiiE retention .......................................................................... 90
2 CHARACTERISATION OF THE FUNCTION OF SIIA AND SIIB 93
2.1 Analyses of the topology of SiiA and SiiB in the inner membrane ................................................ 93
ii TABLE OF CONTENT
2.1.1 Prediction of the topology of SiiA and SiiB by bioinformatic tools ......................................................... 93
2.1.2 Construction of reporter enzyme fusions at different sites of SiiA and SiiB ............................................ 94
2.1.3 Topology of SiiA and SiiB ....................................................................................................................... 96
2.2 Impact of SiiA and SiiB on SPI4-mediated functions .................................................................... 98
2.2.1 Involvement of SiiA and SiiB in the adhesion and invasion process and in SiiE secretion ...................... 98
2.2.1.1 Generation of defined point mutations and deletions in SiiB......................................................... 99
2.2.1.2 Influence of mutations in SiiB on Salmonella invasion and adhesion.......................................... 101
2.2.2 Analysis of SiiA and SiiB-mediated retention of SiiE by the use of different methods.......................... 102
2.2.2.1 Visualisation of SiiE on the bacterial envelope by immunostaining ............................................ 102
2.2.2.2 Application of flow cytometry to determine the distribution of retained SiiE on the bacterial cell
envelope ....................................................................................................................................... 103
2.2.2.3 Enrichment of SiiE-retaining Salmonella using the ‘SIMPLE’ assay .......................................... 105
2.2.2.4 Quantification of SiiE-positive Salmonella by the use of dot blot ............................................... 108
VI DISCUSSION........................................................................................................................................... 111
1 THE SPI4-MEDIATED INVASION IS DEPENDENT ON GLYCOSTRUCTURES ................................................ 112
2 RETENTION OF SIIE IS TIGHTLY REGULATED BY ENVIRONMENTAL FACTORS AND BY THE FUNCTION OF
SIIA AND SIIB................................................................................................................................................. 115
2.1 Establishing of different methods to detect surface-localised SiiE ............................................. 115
2.2 Both SiiE retention and subsequent secretion are essential requirements for Salmonella
pathogenesis................................................................................................................................ 119
2.3 Regulation of SiiE retention occurs by changes in environmental conditions and is controlled by
SiiA and SiiB ............................................................................................................................... 128
2.4 Combined model for the mechanism that lead to retention and release of SiiE.......................... 132
3 CONCLUDING REMARKS AND OUTLOOK ................................................................................................ 135
VII LITERATURE.................................................................................................................................... 137
VIII LIST OF FIGURES............................................................................................................................ 148
IX LIST OF TABLES................................................................................................................................... 150
X LIST OF ABBREVIATIONS................................................................................................................. 151
XI LIST OF PUBLICATIONS .................................................................................................................... 156




iii I Zusammenfassung / Summary
I ZUSAMMENFASSUNG / SUMMARY
1 Zusammenfassung
Salmonella enterica ist ein vielseitiger Krankheitserreger, dem es gelingt, nach Kolonisierung
des Darmepithels in die Wirtszelle einzudringen, um dort zu überleben. Der erste wichtige
Schritt während der Pathogenese ist dabei allerdings die Adhäsion an die Wirtszelle. Hierfür
besitzt Salmonella eine große Vielfalt an Adhäsinen, die unterschiedliche Wirtsspezifitäten
besitzen und die Kolonisierung verschiedener Gewebe ermöglichen. Um eine überflüssige
Adhäsin-Synthese und das Erkennen durch das Immunsystem zu vermeiden, werden diese
Adhäsine jedoch nicht gleichzeitig exprimiert. Zusätzlich wird ihre Oberflächen-Präsentation
geregelt. Während der hoch-invasiven Phase exprimiert Salmonella nicht nur die
Komponenten der Salmonella Pathogenitätsinsel 1 (SPI1), welche die Invasion in die
Wirtszelle vermitteln, sondern auch SPI4. Die Notwendigkeit von SPI4 wurde zwar lange Zeit
nicht erkannt, konnte aber kürzlich nachgewiesen werden. Die Funktion von SPI4 wird
benötigt für die Adhäsion an und Invasion in polarisierte Epithelzellen. Im Vergleich zu nicht-
polarisierten Epithelzellen, ähneln polarisierte Epithelzellen eher den Wirtszellen, welche
Salmonellen während der Infektion begegnen. SPI4 kodiert für das riesige Adhäsin SiiE, die
Komponenten eines Typ-I-Sekretionssystems (T1SS), welches SiiE sekretiert und SiiA und
SiiB mit bislang unbekannter Funktion. Die Freisetzung eines Adhäsins in das umgebende
Medium ist jedoch ungewöhnlich, da Adhäsine normalerweise sowohl an die Wirtszelle
binden als auch am Bakterium festgehalten werden. Während nicht-fimbrielle Adhäsine, wie
OmpA oder YadA in die äußere Bakterienmembran über die Bildung von β-barrel Strukturen
integrieren, ist der Mechanismus, wie Typ-I-sekretierte Adhäsine wie SiiE an der Wirtszelle
festgehalten werden, bislang völlig unbekannt. Daher wurde in einem Teil dieser Arbeit der
Mechanismus der Verankerung von SiiE analysiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass das
Zurückhalten von SiiE, das möglicherweise im Sekretionskanal während der Sekretion
erfolgt, durch Umweltfaktoren wie den pH-Wert und die Ionenstärke des umgebenden
Mediums reguliert wird. Zusätzlich zur Zurückhaltung von SiiE konnte auch die
Notwendigkeit der Freisetzung von SiiE für die Invasion von Salmonella gezeigt werden.
Weiterhin wurde die Funktion der Domänen von SiiE erforscht. Während N-terminale SiiE
Domänen, hierbei besonders die coiled coil Domäne und die β-sheet Domänen, für die
Verankerung und Freisetzung von SiiE notwendig waren, wurden die C-terminalen Domänen
für die Adhäsion an die Wirtszelle benötigt. Zur Charakterisierung des Wirtszell-Rezeptors
wurden Lektin-Blockade Experimente durchgeführt. Dabei konnte eine Rolle von GlcNAc-
1 I Zusammenfassung / Summary
enthaltenen Zuckerstrukturen im Invasionsprozess von Salmonella beobachtet werden. Im
zweiten Teil der Arbeit wurde die Membran-Topologie von SiiA und SiiB bestimmt und
deren Funktion analysiert. Hierbei wurde die Rolle von SiiA und SiiB in der Regulierung der
Retention von SiiE durch verschiedene Methoden gezeigt. Zusammenfassend wurde ein
Modell entwickelt, welches den Mechanismus der Verankerung und Freisetzung von SiiE mit
der Funktion von SiiA, SiiB und der Regulierung über Umweltfaktoren kombiniert. Diese
Arbeit zeigt einen völlig neuartigen Mechanismus auf, wie Typ-I-sekretierte Adhäsine
verankert werden können und wie akzessorische Proteine wie SiiA und SiiB auf diesen
Prozess einwirken.
2 I Zusammenfassung / Summary
2 Summary
Salmonella enterica is an intriguing pathogen which is able to colonise the gut epithelium
followed by invasion of underlying tissues and survival within the host cells. However, the
first important step for the pathogenic process remains the adhesion to host tissues.
Salmonella possess a huge variety of adhesins that exhibit distinct host cell specificities and
allow the colonisation of different kinds of tissues. To avoid redundant adhesin synthesis and
immune recognition, not all the adhesins are expressed simultaneously. Additionally, their
temporal presentation on the surface is regulated. During its high invasive phase, Salmonella
expresses not only Salmonella pathogenicity island 1 (SPI1), which mediates invasion of host
cells, but also SPI4. The importance of this island was previously not recognized, but it was
shown recently that the function of SPI4 is absolutely required for adhesion to, and invasion
of, polarised epithelial cells. Compared to non-polarized cells, polarized epithelial cells
resemble more closely the organization of host cells encountered by Salmonella during
infection. SPI4 encodes the giant adhesin SiiE, SiiA and SiiB with so far unknown functions,
and the components of a type I secretion system (T1SS) which secretes SiiE. The release of
an adhesin into the medium is very uncommon, as adhesins usually bind to host cells as well
as to bacteria. Whereas non-fimbrial adhesins like OmpA or YadA integrate into the outer
membrane via formation of β-barrel structures, the mechanism by which type I-secreted
adhesins like SiiE attach to the membrane was unknown so far. Therefore, the attachment of
SiiE to the bacterial envelope was investigated: the retention of SiiE, which possibly occurs
inside the type I secretion channel during secretion, was regulated by environmental factors
like pH and ionic strength of the surrounding medium. In addition to retention, release of SiiE
from the bacterial envelope was substantial for Salmonella invasion. Furthermore, the domain
functions of SiiE were analysed. Whereas the N-terminal domains of SiiE, especially the
coiled coil domain and β-sheet domains, were required for SiiE retention and release, the
C-terminal moiety of SiiE mediated adherence to the host cell. To characterise the host cell
receptor of SiiE, lectin blockade experiments were performed and indicated a role of GlcNAc-
containing glycostructures in the invasion process of Salmonella. In the second part, the
membrane topology of SiiA and SiiB was determined and the function of SiiA and SiiB was
investigated. Thereby, their role in the regulation of SiiE retention was shown by different
methods. A model was developed, which combines the mechanism of SiiE retention and
release with the function of SiiA, SiiB and the regulation by environmental factors. This study
reveals a complete new mechanism how type I-secreted adhesins can be retained and how
accessory proteins like SiiA and SiiB are involved in this process.
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