Characterization of group III metatropic glutamate receptor C-terminal regions [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Angela Seebahn geb. Graulich

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Aus dem Institut für Biochemie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Institutsleiter: Prof. Dr. C.-M. Becker CHARACTERIZATION OF GROUP III METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR C-TERMINAL REGIONS Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Dipl. Ing. (FH) Angela Seebahn geb. Graulich aus Lauterbach Erlangen, 2009 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. R. Enz Korreferent: Prof. Dr. C.-M. Becker Tag der mündlichen Prüfung: 12. Januar 2010 Für Björn.. - I - Zusammenfassung ZUSAMMENFASSUNG Metabotrope Glutamat (mGlu) Rezeptoren sind an Kontaktstellen von Neuronen (Synapsen) lokalisiert, wo sie mit interagierenden Proteinen assemblieren und von ihnen reguliert werden. Die meisten der kürzlich entdeckten Interaktionspartner binden an die intrazellulären C-terminalen Bereiche der mGlu Rezeptoren. Diese Regionen zeichnen sich durch eine hohe Variabilität zwischen den Rezeptortypen aus und sind daher geeignete Ziele zur Rezeptorregulation durch spezifische Protein-Protein Interaktionen.
Publié le : jeudi 1 janvier 2009
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Aus dem Institut für Biochemie der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Institutsleiter: Prof. Dr. C.-M. Becker





CHARACTERIZATION OF GROUP III

METABOTROPIC GLUTAMATE RECEPTOR

C-TERMINAL REGIONS







Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg



vorgelegt von

Dipl. Ing. (FH) Angela Seebahn
geb. Graulich
aus Lauterbach



Erlangen, 2009







Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg



















Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler
Referent: Prof. Dr. R. Enz
Korreferent: Prof. Dr. C.-M. Becker

Tag der mündlichen Prüfung: 12. Januar 2010






















Für Björn..









- I -
Zusammenfassung

ZUSAMMENFASSUNG

Metabotrope Glutamat (mGlu) Rezeptoren sind an Kontaktstellen von Neuronen
(Synapsen) lokalisiert, wo sie mit interagierenden Proteinen assemblieren und von
ihnen reguliert werden. Die meisten der kürzlich entdeckten Interaktionspartner
binden an die intrazellulären C-terminalen Bereiche der mGlu Rezeptoren. Diese
Regionen zeichnen sich durch eine hohe Variabilität zwischen den Rezeptortypen aus
und sind daher geeignete Ziele zur Rezeptorregulation durch spezifische Protein-
Protein Interaktionen. Von allen mGlu Rezeptortypen (mGlu1-mGlu8) ist über die
Regulation von mGlu6 am wenigsten bekannt. Zur Identifizierung neuer
regulatorischer Proteine von mGlu6 wurden Yeast-two-Hybrid Screens mit dem
C-Terminus und weiteren intrazellulären Regionen des Rezeptors als Köderproteine
durchgeführt. Allerdings konnte keiner der aus einer bovinen retinalen cDNA Bibliothek
identifizierten potentiellen mGlu6 Bindepartner mit unabhängigen Techniken verifiziert
werden.

Während die 3-dimensionale Struktur von vielen mGlu Rezeptor Bindepartnern
beschrieben wurde, ist die Konformation der interagierenden mGlu Rezeptor C-Termini
größtenteils unbekannt. Daher wurde zur Charakterisierung der Sekundärstruktur-
gehalt, die Lokalisierung von linearen Bindemotiven und die Fähigkeit zu einer
globulären Faltung von allen Mitgliedern der Gruppe III Rezeptoren (mGlu4, mGlu6-
mGlu8) untersucht. Die Sekundärstrukturvorhersage ergab Regionen in mGlu C-
Termini, die α-helikale sowie β-Faltblatt Strukturen annehmen können, separiert von
unstrukturierten Bereichen. Durch einen kürzlich beschriebenen Algorithmus konnten
20 lineare Bindemotive in den untersuchten mGlu Rezeptor C-Termini identifiziert
werden. Diese Motive lagen präferentiell in Bereichen ohne vorhergesagte
Sekundärstruktur. Untersuchungen der C-terminalen Regionen von mGlu6, mGlu7a
und mGlu8a durch limitierte tryptische Verdaus zeigte deutlich, daß diese C-Termini
keine globuläre Faltung annehmen. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis, ergab
auch die Bestimmung von Sekundärstrukturen durch Circular Dichroismus
Experimente einen Anteil von 63-71% ungefalteter Struktur, was zudem durch
1H-NMR Experimente bestätigt werden konnte.

Zusammenfassend ergab die Charakterisierung von Gruppe III mGlu Rezeptor C-
Termini eine größtenteils ungefaltete Strukur dieser Regionen. Auf Basis der in dieser
Arbeit beschriebenen Daten wird postuliert, daß in diesen mGlu Rezeptor C-Termini
Sekundärstrukturen induziert werden können, z.B. durch die Interaktion mit
regulatorischen Proteinen, durch Rezeptor Phosphorylierung oder durch die
Nachbarschaft der Lipiddoppelschicht bzw. benachbarter intrazellulärer Regionen der
Glutamat Rezeptoren.

Parallel zu der in dieser Arbeit beschriebenen Studie wurde ein Projekt fertig gestellt,
das von einer ehemaligen Doktorandin des Labors (Melanie Rose) begonnen wurde.
Dieses Projekt betraf ein zur vorliegenden Arbeit eng verwandtes Thema (Bindung des
Gerüstproteins RanBPM an mGlu Rezeptoren) und wurde 2008 veröffentlicht (Seebahn
et al. 2008). In dieser Arbeit wird dieses Thema nicht beschrieben. - II -
Abstract

ABSTRACT

Metabotropic (mGlu) glutamate receptors are localized at synaptic specializations were
they assemble with and are regulated by interacting proteins. Most of the newly
identified interaction partners bind to the intracellular C-termini of mGlu receptors.
The highest variability between the receptor types is present within these domains,
defining them as key players for receptor regulation by specific protein-protein
interactions. Of all mGlu receptor types (mGlu1-8), nearly nothing is known about the
regulation of mGlu6. To identify potential intracellular regulators of the mGlu6
receptor signaling pathway, yeast two-hybrid screens were developed using the C-
terminus and intracellular loops of this receptor as baits for a bovine retinal cDNA
library. However, identified putative mGlu6 binding partners could not be verified by
independent techniques.

While the 3-dimensional structure of several mGlu receptor binding partners is known,
the conformation of mGlu receptor C-termini themselves is far less defined. Therefore,
the secondary structure content, the localization of predicted short linear interaction
motifs, and globular folding capabilities of group III mGlu receptor C-termini (mGlu4
and mGlu6-mGlu8) were analyzed. Secondary structure prediction for these C-termini
defined regions with intrinsic capability to adopt ordered α-helix or β-sheet
conformations, separated by longer unstructured parts. Using a recently developed
algorithm, 20 short linear binding motifs for potential new mGlu receptor interactors
were identified, the majority being localized within unstructured regions. Experiments
with limited tryptic digests of purified C-termini of mGlu6, mGlu7a and mGlu8a argued
against the formation of stable globular folds. In agreement with these data, circular
1dichroism and H-NMR spectra suggested a largely random-coiled nature (63-71%) of
these C-termini.

In summary, the characterization of intracellular C-termini of group III mGlu receptors
revealed a largely random-coiled structure of these regions. Based on the data
presented in this study, it is postulated that in the mGlu receptor C-termini analyzed,
secondary structures might be induced via interaction with regulatory proteins,
receptor phosphorylation or via neighbouring effects from the lipid bilayer or adjacent
intracellular regions of these glutamate receptors.

In parallel to the experiments performed for this thesis, a project initiated by a former
PHD student of the laboratory (Melanie Rose) was completed. This project analyzed a
topic closely related to the presented thesis (Binding of the scaffold protein RanBPM to
mGlu receptors), and resulted in a publication in 2008 (Seebahn et al. 2008). In this
thesis, this topic is not further described. - III -
Table of contents

TABLE OF CONTENTS

Page
ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................... I
ABSTRACT .............................. II
1. INTRODUCTION ..................... 1
1.1 Neurotransmission 1
1.2 Glutamatergic synapses 2
1.3 Metabotropic glutamate receptors 3
1.3.1 Structure of metabotropic glutamate receptors .......................................................... 5
1.3.2 Interaction partners of group III mGlu receptor C-termini ........................................... 8
1.4 The retina 11
1.4.1 Metabotropic glutamate receptor function in the retina .............. 13
1.5 Aim of the study 16
2. MATERIALS ........................................................................................ 17
2.1 Chemicals and reagents 17
2.2 Materials and equipment 18
2.3 Kits and enzymes 19
2.4 Plasmids 20
2.5 Oligonucleotides and cDNA-libraries 20
2.6 Microorganisms 21
2.7 Antibodies 22
2.8 DNA and protein marker 22
3. METHODS .......................................................................................... 23
3.1 Molecular biological methods 23
3.1.1 Transformation of E. coli DH5α ............................................... 23
3.1.2 Transformation of E. coli Rosetta 2(DE3) ................................. 23
3.1.3 Isolation of plasmid DNA ....................................................... 23
3.1.4 Determination of DNA concentrations ...................................... 24
3.1.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) ........................................... 24
- IV -
Table of contents
3.1.6 Restriction digest .................................................................................................. 25
3.1.7 Dephosphorylation of blunt ends ............. 26
3.1.8 Ligation of DNA-fragments ..................................................................................... 26
3.1.9 Agarose-gelelectrophoresis .................... 26
3.1.10 Sequencing ........................................................................................................ 26
3.1.11 Cloning of bait sequences used for yeast two-hybrid screens .... 27
3.1.12 Cloning of mGlu receptor C-termini for structural analysis ........ 29
3.2 Biochemical methods 30
3.2.1 Protein expression and affinity purification of fusion-proteins ..................................... 30
3.2.2 Purification of mGlu receptor C-termini for structural analysis .... 31
3.2.3 Pull-down assays .................................................................. 31
3.2.4 Discontinuous SDS-PAGE ....................... 32
3.2.5 Discontinuous Tricine-SDS-PAGE ............................................................................ 33
3.2.6 Semi dry Western Blot with chemiluminescence detection .......... 33
3.2.7 In-vitro transcription / translation system ................................................................ 34
3.2.8 Bradford-assay ..................................... 35
3.3 Yeast two-hybrid system 35
3.3.4 cDNA library amplification ...................................................................................... 36
3.3.1 Transformation of yeast cells.................. 36
3.3.2 Test of transactivation ........................... 37
3.3.3 Yeast two-hybrid screen ........................................................................................ 37
3.4 Bioanalytical methods 38
3.4.1 MALDI-TOF MS ..................................................................................................... 38
3.4.1.1 Peptid mass analysis .......................... 39
3.4.1.2 Limited proteolysis ............................. 39
3.4.2 Circular Dichroism spectroscopy ............................................................................. 39
3.4.3 Nuclear Magnetic Resonance .................. 40
3.5 Bioinformatic methods 41
4. RESULTS ............................................................................................ 42
4.1 Identification of new interaction partners for mGlu6 42
4.1.1 Characterization of the bovine retinal cDNA library .................................................... 42
4.1.2 Yeast two-hybrid screens ....................................................... 43
- V -
Table of contents
4.1.3 Verification of putative interaction partners .............................................................. 47
4.2 Prediction of secondary structure and linear interaction motifs for mGlu
receptor C-termini 48
4.3 Bacterial expression and purification of mGlu receptor C-terminal peptides 52
4.4 Limited proteolysis and mass spectrometry analysis 55
14.5 CD-Spectroscopy and H-NMR of mGlu receptor C-termini 58
5. DISCUSSION ...................................................................................... 61
5.1 MGlu6 signal transduction cascade 61
5.2 “Fishing” for new mGlu6 interaction partners 63
5.3 Expression and purification of C-terminal peptides 65
5.4 MGlu receptor C-termini do not fold in globular structures as determined by
limited proteolysis 66
5.5 Characteristics of mGlu receptor C-termini analyzed by bioinformatic and
biophysical methods 67
5.6 Perspective 71
REFERENCES ........................................................................................... 74
ABBREVIATIONS ....................... 82
PUBLICATIONS ........................ 83
APPENDIX .............................................................................................. 84
A List of figures ............................................ 84
B List of tables ............. 85
C Overview of mGlu receptor properties ........................................... 85
D List of suppliers ......................................................................... 86
E Limited proteolysis fragments of mGlu6-CT and mGlu7a-CT ............ 87
F Short linear interaction motifs predicted in group III mGlu-CT ......... 88
G Kinase consensus sites identified in group III mGlu-CT ................................................... 89
DANKSAGUNGEN ...................................................................................... 90
CURRICULUM VITAE .................. 91

- 1 -
Introduction

1. INTRODUCTION

The brain contains over 100 billion nerve cells, none of which alone has any idea who
or what we are. Only the network of cells connected by over trillions of contacts is able
to give us an impression of consciousness. The mechanisms behind seem to be highly
complex, and scientists nowadays and in the past are driven by the ambition to solve
this fascinating question. Paradoxically thinking about our brain is itself something of a
mystery because we can only think about the brain with our brain.

The contribution to today’s knowledge of how the nervous system is organized and
works at the cellular level and beyond has been made by many curious scientists.
Santiago Ramón Y Cajal around 1900, with his skills as an artist and the new staining
techniques of Camillo Golgi, drew the first detailed pictures of neuronal cells.

Other scientists like Donald O. Hebb, bringing together the neuronal network and
higher brain function like learning and behavior and Sir John C. Eccles, the first to
study synapses with electrophysiology were both pioneers at their time. Not to forget
the work of Eric R. Kandel on long term and short term potentiation on nerve cells
isolated from the marine mollusk Aplysia californica, which defines the basic principles
of learning and memory.
Up to now lots of curious scientists around the world account for the elucidation of the
mysterium, but we’re not even close in understanding the whole picture.

1.1 Neurotransmission

Synapses are functional connections with 3 nm distance between neuronal cells. They
pass electrical information unidirectionally from a presynaptic to a postsynaptic cell.
Nerve impulses travel along the presynaptic neuron by opening of voltage-gated
sodium and potassium channels, thereby depolarizing the neuron. When the signal
reaches the presynaptic terminal it activates voltage-gated calcium channels to open.
The locally high concentration of calcium entering the presynaptic active zone triggers
neurotransmitter-filled vesicles to fuse with the plasma membrane, and to release
their content into the synaptic cleft. At the postsynapse specific neurotransmitter
receptors are activated by binding of transmitter, opening ion channels and thus
transform the chemical signal back to an electrical signal, which now propagates along
the postsynaptic neuron. The decision if an action potential depolarizes the

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