Characterization of inflammatory pathomechanisms of COPD in in vitro and in vivo models [Elektronische Ressource] = Charakterisierung von Entzündungsmechanismen der COPD in In-vitro- und In-vivo-Modellen / vorgelegt von Ružica Puljić

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Characterization of inflammatory pathomechanisms of COPD in in vitro and in vivo models Charakterisierung von Entzündungsmechanismen der COPD in in vitro und in vivo Modellen n Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Vorgelegt von Ružica Pulji ć aus Wesel Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 29.06.2007 Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. E. Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. G. Lee Zweitberichterstatter: Prof. Dr. K. Brune Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Mai 2003 - Mai 2007 am Institut für experimentelle und klinische Pharmakologie und Toxikologie der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg. Habe die Gelassenheit, Dinge hinzunehmen, die du nicht ändern kannst; den Mut, die Dinge zu ändern, die du ändern kannst und die Weisheit, das eine vom anderen zu unterscheiden. DANKSAGUNGAn dieser Stelle möchte ich mich bei allen Leuten bedanken, die mich im Zusammenhang mit dieser Arbeit fachlich unterstützt, inspiriert und weitergebracht haben.
Publié le : lundi 1 janvier 2007
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Characterization of inflammatory
pathomechanisms of COPD in in vitro
and in vivo models


Charakterisierung von
Entzündungsmechanismen der COPD
in in vitro und in vivo Modellen n









Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades





Vorgelegt von
Ružica Pulji ć
aus Wesel

Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Universität Erlangen-Nürnberg


























Tag der mündlichen Prüfung: 29.06.2007


Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. G. Lee
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. K. Brune





Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Mai 2003 - Mai 2007 am Institut für
experimentelle und klinische Pharmakologie und Toxikologie der Friedrich-
Alexander Universität Erlangen-Nürnberg.



























































Habe die Gelassenheit, Dinge hinzunehmen, die du nicht ändern kannst;
den Mut, die Dinge zu ändern, die du ändern kannst
und die Weisheit, das eine vom anderen zu unterscheiden.










DANKSAGUNG
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen Leuten bedanken, die mich im
Zusammenhang mit dieser Arbeit fachlich unterstützt, inspiriert und
weitergebracht haben. Besonderer Dank gilt:

meinem Doktorvater PD. Dr. A. Pahl für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe,
Gewährleistung größtmöglicher Freiheit beim Bearbeiten des Forschungsthemas,
seinen fachlichen Rat und vielfältige Unterstützung.
dem GRK 592 für die finanzielle Förderung und wissenschaftliche Ausbildung.
Spezieller Dank gilt vor allem meiner Betreuungskommission Prof. H. Schulze-
Koops und Prof A. Gessner für das Interesse an dieser Arbeit. Zusätzlich danke
ich allen Kollegiaten, die mir mit Rat und Tat zur Seite standen und besonders
dem „harten Kern“ für den - meistens Abend füllenden - geistigen Austausch.
Prof. Szelenyi und Prof. Fey möchte ich danken für die vielen Gespräche,
hilfreichen Ratschläge und ihr unermüdliches Engagement.
Prof. Dr. Peter Barnes, sowie Prof. Maria Belvisi und ihrer Arbeitsgruppe für die
sehr herzliche Aufnahme bei meinem Gastaufenthalt in ihrem Labor.
meinen alten und neuen Arbeitskollegen Ingrid, Renata, Meixia, Sandra, Uwe,
Evi, Brigitte, Ewald, Alex, Steffi und Katrin, für die angenehme und entspannte
Arbeitsatmosphäre, sowie den zahlreichen Diskussionen während so mancher
Mensabesuche und Kaffeepausen.
allen Institutsangestellten, vor allem Annette, Eva und Irena, die mir den Uni-
Alltag deutlich verschönert haben und keine Langeweile aufkommen ließen.
Dr. Markus Biburger gebührt mein spezieller Dank. Seine unübertroffene
Hilfsbereitschaft und konstruktive Kritik bereicherte diese Arbeit in nicht
unerheblichem Maße.
bei meinen Freunden und Bekannten, die für einen Ausgleich zwischen dem
beruflichen und privaten Leben gesorgt haben und immer motivierende Worte
parat hatten.
ganz besonderem Dank schulde ich meinen Eltern, Stojan und Anica, sowie
meinen Geschwistern, Brigita und Marko, für die in allen Bereichen gegebene
Unterstützung. Ohne sie wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen.



CONTENTS
Summary.........................................................................................................7
Zusammenfassung ...........................................................................................9
CHAPTER 1: Introduction............................................................................. 11
1.1 BACKGROUND OF COPD 11
1.1.1 Definition................................................................................................................ 11
1.1.2 Differences and similarities between asthma and COPD.......................................... 12
1.1.3 Genetics.................................................................................................................. 13
1.2 PATHOGENESIS ............................................................................................ 15
1.2.1 Inflammation........................................................................................................... 15
1.2.2 Protease/anti-protease imbalance............................................................................ 15
1.2.3 Oxidative stress....................................................................................................... 16
1.2.4 Raised alveolar cell apoptosis.................................................................................. 16
1.3 INFLAMMATORY RESPONSE IN COPD........................................................ 17
1.3.1 Inflammatory cells in COPD.................................................................................... 18
1.3.1.1 Neutrophils..................................................................................................... 18
1.3.1.2 Macrophages.................................................................................................. 18
1.3.1.3 T lymphocytes................................................................................................ 19
1.3.2 Chemokines............................................................................................................ 20
1.3.2.1 IL- 8............................................................................................................... 20
1.3.2.2 MCP-1 ........................................................................................................... 20
1.3.3 Cytokines in COPD................................................................................................. 21
1.3.3.1 TNF-α 21
1.3.3.2 GM-CSF......................................................................................................... 21
1.3.3.3 IFN-γ.............................................................................................................. 22
1.3.3.4 IL-17 22
1.4 THERAPY OF COPD ...................................................................................... 23
1.4.1 Smoking cessation .................................................................................................. 23
1.4.2 Bronchodilators....................................................................................................... 24
1.4.3 Theophylline........................................................................................................... 24
1.4.4 Inhaled corticosteroids............................................................................................. 24
1.4.5 Other pharmacological treatment ............................................................................ 25
CONTENTS


1.5 FUTURE THERAPY ........................................................................................ 25
1.5.1 Anti-inflammatory treatment ................................................................................... 25
1.5.2 Protease inhibitors .................................................................................................. 27
1.5.3 Antioxidants............................................................................................................ 27
1.6 ANIMAL MODELS OF COPD ......................................................................... 27
1.6.1 Mouse models......................................................................................................... 27
1.6.2 LPS......................................................................................................................... 28
1.7 THESIS PLAN ................................................................................................. 29
CHAPTER 2: Materials and Methods ............................................................. 30
2.1 MATERIALS .................................................................................................... 30
2.1.1 Substances.............................................................................................................. 30
2.1.2 Oligonucleotides ..................................................................................................... 31
2.1.3 Antibodies............................................................................................................... 32
2.1.4 Media ..................................................................................................................... 32
2.2 METHODS ...................................................................................................... 33
2.2.1 Preparation of PBMC.............................................................................................. 33
+ +2.2.2 Preparation of CD4 and CD8 T cells.................................................................... 33
+ +2.2.3 CD4 /CD8 T cell treatment and culture................................................................. 33
2.2.4 A549 cell treatment and culture............................................................................... 34
2.2.5 Preparation of cigarette smoke conditioned medium ............................................... 34
2.2.6 RT-PCR .................................................................................................................. 35
2.2.7 ELISA ..................................................................................................................... 36
2.2.8 Neutrophil isolation................................................................................................. 36
2.2.9 Animals................................................................................................................... 36
2.2.10 LPS-induced lung inflammation.......................................................................... 37
2.2.10.1 Mouse model of acute lung inflammation ....................................................... 37
2.2.10.2 of sub-acute lung inflammation................................................. 37
2.2.10.3 Mouse model of chronic lung inflammation .................................................... 37
2.2.10.4 of chronic/acute lung inflammation........................................... 37
2.2.11 Measurement of lung function............................................................................. 38
2.2.12 Treatment........................................................................................................... 38
2.2.13 Bronchoalveolar lavage sampling........................................................................ 38
2.2.14 Tissue sampling and processing .......................................................................... 39
2.2.15 Total counts and cytospin preparations............................................................... 39
2 CONTENTS


2.2.16 Flow cytometry................................................................................................... 40
2.2.17 Determination of serine protease activity............................................................. 40
2.2.18 of MMP activity............................................................................ 41
2.2.19 Immunohistochemistry........................................................................................ 41
2.2.20 Histology ............................................................................................................ 41
2.2.20.1 Basic morphological staining (H&E) ............................................................... 41
2.2.20.2 Determining the number of mucus containing cells ......................................... 42
2.2.21 Emphysema........................................................................................................ 42
CHAPTER 3: Results..................................................................................... 43
3.1 STUDIES IN CELL CULTURE......................................................................... 43
3.1.1 Production of human IL-17 isoforms by activated T lymphocytes ............................ 43
+ +3.1.2 Inhibition of IL-17 expression in CD4 and CD8 cells by different
pharmacological inhibitors ...................................................................................... 44
3.1.3 Lung epithelial cells are capable of producing various chemokines .......................... 47
3.1.4 Lung epithelial cells are producing chemokines after stimulation with supernatants
+ +of CD4 and CD8 cells.......................................................................................... 48
3.1.5 Inhibition of IL-8 and MCP-1 production by inhibiting IL-17 with different
pharmacological inhibitors 49
3.1.6 Smoke induces chemokines in lung epithelial cells................................................... 50
3.1.7 resistant to dexamethasone.......................................... 51
3.1.8 Inhibition of IL-8 and MCP-1 production by inhibiting IL-17 with a neutralizing Ab. 52
3.2 ANALYSIS OF INFLAMMATORY MECHANISMS IN DIFFERENT MOUSE
MODELS ......................................................................................................... 53
3.2.1 LPS-induced influx of neutrophils in BAL fluid........................................................ 54
3.2.2 Influx of cells is accompanied by an increase of TNF-α, MIP-2 and KC in BAL fluid 55
3.2.3 Immediate-early induction of GM-CSF after LPS challenge ..................................... 56
3.2.4 αGM-CSF treatment reduces cell influx into LPS-challenged lungs .......................... 57
3.2.5 αatment prevents cytokine and chemokine accumulation in BAL fluid.. 58
3.2.6 Inflammatory cell influx in a sub-acute mouse model............................................... 59
3.2.7 cell influx in a chronic mouse model .................................................. 61
+3.2.8 Characterization of CD3 cells in BAL, blood, lungs, lymph nodes and spleen......... 63
3.2.8.1 BAL fluid........................................................................................................ 64
3.2.8.2 Lung .............................................................................................................. 65
3.2.8.3 Blood, lymph nodes and spleen...................................................................... 66

3 CONTENTS


3.2.9 Classification of lymphocytes in Th or Th subsets.................................................. 66 1 2
3.2.10 Effector activity of T lymphocytes in different organs........................................... 71
3.2.11 Inflammatory cell profile in different LPS models ................................................ 72
3.2.12 Characterization of lymphocyte populations in different LPS models................... 74
3.2.13 Expression of activation marker CD49d/CD25.................................................... 78
3.2.13.1 CD25 ............................................................................................................. 78
3.2.13.2 CD49d ........................................................................................................... 80
3.2.14 Activation of serine proteases.............................................................................. 83
3.2.15 Activation of matrix metalloproteases.................................................................. 86
3.2.16 Cytokine involvement in different mouse models ................................................ 87
3.2.16.1 IL-17 and IFN-γ.............................................................................................. 87
3.2.16.2 TNF-α, KC, MIP-2 and IFN-γ expression in lung tissue.................................... 91
3.2.17 Effects of dexamethasone and rolipram treatment in chronic LPS-induced
inflammation ...................................................................................................... 93
3.3 ADDITIONAL CHARACTERISTIC FEATURES OF COPD IN THE CHRONIC
MOUSE MODEL ............................................................................................. 99
3.3.1 Mucus containing cells............................................................................................. 99
3.3.2 Emphysema.......................................................................................................... 100
3.3.3 Lung function test............................................................................................................101
CHAPTER 4: Discussion ............................................................................. 103
4.1 STUDIES IN CELL CULTURE....................................................................... 104
4.1.1 IL-17 production in activated lymphocytes ............................................................ 104
4.1.2 Chemokine production by epithelial cells after lymphocyte stimulation.................. 105
4.1.3 on by epithelial cells after CSCM stimulation.......................... 106
4.2 INFLAMMATORY MECHANISMS IN DIFFERENT MOUSE MODELS ......... 108
4.2.1 LPS induced influx of neutrophils in BAL fluid ...................................................... 108
4.2.2 Characterization of the inflammatory response to LPS in the
mouse model ........................................................................................................ 110
4.2.3 Activation marker.................................................................................................. 111
4.2.4 Classification of lymphocytes in Th and Th subsets ............................................. 111 1 2
4.2.5 Role of cytokines and chemokines in lung inflammation models............................ 113
4.2.5.1 KC, MIP-2, TNF-α, IFN-γ ............................................................................. 113
4.2.5.2 IL-17............................................................................................................ 113

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