Chromatin at the nanolevel [Elektronische Ressource] : development of a single molecule FRET experiment and analysis of the structure and stability of individual nucleosomes / presented by Alexander Gansen

Dissertationsubmitted to theCombined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematicsof the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germanyfor the degree ofDoctor of Natural Sciencespresented byDipl.-Phys. Alexander Gansenborn in: KoblenzOral examination: 16.01.20082Chromatin at the Nanolevel -Development of a single molecule FRET experimentand analysis of the structure and stabilityof individual nucleosomes.Referees:Prof. Dr. J¨org LangowskiProf. Dr. Dr. Christoph Cremer2ZusammenfassungChromatin auf der nm-Skala -Entwicklung eines Einzelmoleku¨l-FRET Spektrometers zur Untersuchungder Struktur und Stabilit¨at einzelner NukleosomenDie Struktur und Stabilit¨at einzelner Nukleosome wird im Rahmen dieser Arbeit auf Einzel-molek¨ulebene untersucht. Beide Aspekte spielen eine entscheidende Rolle in der Chro-matinorganisation im Zellkern. Sie steuern zum Beispiel die Zug¨anglichkeit bestimmterDNA Regionen f¨ur Transkriptionsfaktoren. Auf der Ebene einzelner Nukleosome k¨onnen invitro Experimente wertvolle Informationen ¨uber die Prozesse liefern, die dynamische Struk-tur¨anderungeninnerhalbdesNukleosomshervorrufen. DazuwurdeeineexperimentellePlat-formkonzipiertundaufgebaut,welcheeserlaubt,dieKonformationfreidiffundierenderNuk-leosomezuuntersuchen. DazuwirdnukleosomaleDNAmitFluoreszenzfarbstoffenmarkiert,¨und lokale Anderungen der Nukleosomstruktur durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer(FRET) im Nanometer-Bereich nachgewiesen.
Publié le : mardi 1 janvier 2008
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Dissertation
submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of
Doctor of Natural Sciences
presented by
Dipl.-Phys. Alexander Gansen
born in: Koblenz
Oral examination: 16.01.20082Chromatin at the Nanolevel -
Development of a single molecule FRET experiment
and analysis of the structure and stability
of individual nucleosomes.
Referees:
Prof. Dr. J¨org Langowski
Prof. Dr. Dr. Christoph Cremer2Zusammenfassung
Chromatin auf der nm-Skala -
Entwicklung eines Einzelmoleku¨l-FRET Spektrometers zur Untersuchung
der Struktur und Stabilit¨at einzelner Nukleosomen
Die Struktur und Stabilit¨at einzelner Nukleosome wird im Rahmen dieser Arbeit auf Einzel-
molek¨ulebene untersucht. Beide Aspekte spielen eine entscheidende Rolle in der Chro-
matinorganisation im Zellkern. Sie steuern zum Beispiel die Zug¨anglichkeit bestimmter
DNA Regionen f¨ur Transkriptionsfaktoren. Auf der Ebene einzelner Nukleosome k¨onnen in
vitro Experimente wertvolle Informationen ¨uber die Prozesse liefern, die dynamische Struk-
tur¨anderungeninnerhalbdesNukleosomshervorrufen. DazuwurdeeineexperimentellePlat-
formkonzipiertundaufgebaut,welcheeserlaubt,dieKonformationfreidiffundierenderNuk-
leosomezuuntersuchen. DazuwirdnukleosomaleDNAmitFluoreszenzfarbstoffenmarkiert,
¨und lokale Anderungen der Nukleosomstruktur durch Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer
(FRET) im Nanometer-Bereich nachgewiesen. Unter anderem werden Messungen an ver-
schiedenen Remodellierungsfaktoren pr¨asentiert, welche deutliche Unterschiede in der Nuk-
leosomenstruktur hervorriefen. Ein Hauptaugenmerk wird ebenfalls aufdie Stabilit¨at einzel-
ner Nukleosomen gelegt. Diese wurde in Abh¨angigkeit verschiedener Faktoren wie Io-
nenst¨arke, Gesamt-Nukleosomkonzentration, AcetylierungvonHistonschw¨anzen, sowieVer-
wendungverschiedener DNASequenzenuntersucht. Eswirddemonstriert, dassNukleosom-
komplexe unter niedrigen Konzentrationen spontan dissoziieren und dabei sequenzabh¨angig
einer Struktur¨anderung unterliegen. Die dabei auftretenden Konformations¨anderungen
weisen eine Dynamik im Millisekunden-Bereich auf und nehmen mit steigender Ionenst¨arke
zu. Die Acetylierung der Histonschw¨anze wirkt sich ebenfalls destabilisierend auf die Nuk-
¨leosomstruktur aus. Das erh¨ohte Dissoziationsverhalten korreliert mit einer Offnung der
Nukleosomstruktur, welche sich haupts¨achlich in der Linker DNA Region bemerkbar macht.
IAbstract
Chromatin at the Nanolevel -
Development of a single molecule FRET experiment and analysis
of the structure and stability of individual nucleosomes
The structure and stability of individual nucleosome complexes is analysed on the single
molecule level. Both aspects are important for the organisation of chromatin inside the nu-
cleus, e.g. by controlling the accessibility of DNA to transcription factors. On the level of
individual nucleosomes in vitro experiments provide valuable information on the processes
responsible for dynamic changes in the nucleosome structure. An experimental setup is pre-
sented which monitors the conformation of freely diffusing complexes. Nucleosomal DNA
is labeled with small fluorophores and Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)
is used to monitor changes in nucleosome structure with nm accuracy. Experiments are
presented in which various remodelling factors induce detectable changes in the nucleosome
conformation. A major focus is laid on the stability of nucleosomes under the influence of
various factors such as ionic strength, total nucleosome concentration, histone tail acetyla-
tion and the use of different DNA sequences. Nucleosomes dissociate spontaneously at low
sample concentrations and sequence-specific changes in nucleosome structure occur on the
ms time scale. Histone tail acetylation also results in a destabilisation of the nucleosome
complex. The dissociation at larger ionic strength correlates with an opening of the overall
nucleosome structure which predominantly affects the linker DNA region.
IIContents
1 Chromatin - structure and function 5
1.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2 From DNA to chromatin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.3 The structure of the nucleosome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.4 Nucleosome remodeling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.4.1 ATP-dependent chromatin remodeling . . . . . . . . . . . . . . 9
1.4.2 Posttranslational modifications of histones . . . . . . . . . . . . 11
2 Theory of single molecule detection 13
2.1 Molecular photophysics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.1.2 Kinetic description of photophysical processes . . . . . . . . . . 14
2.1.3 Photodestruction and survival probability . . . . . . . . . . . . 17
2.1.4 Total fluorescence signal under continuous excitation . . . . . . 18
2.2 Confocal single molecule spectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.1 Excitation profile and fluorescence generation . . . . . . . . . . 20
2.2.2 Fluorescence detection and intermediate optics . . . . . . . . . . 21
2.2.3 Analytical description of the fluorescence signal and burst size
distribution of single molecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.2.4 Multiparticle events . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.3 Theory of Resonance Energy Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3.1 Theoretical description . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.3.2 Calculation of the single molecule FRET efficiencies . . . . . . . 30
2.4 Fluorescence fluctuation analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.4.1 Fluctuations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.4.2 Analysis of temporal dynamics by fluorescence correlation spec-
troscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.4.3 Analysis of fluctuation amplitudes - PCH and FIDA . . . . . . . 39
3 Material and methods 41
3.1 Chemicals and preparation protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.1.1 Buffer solutions and additives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.1.2 Preparation of oligonucleotide standards . . . . . . . . . . . . . 42
3.1.3 Preparation of mononucleosomes . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.1.4 Enzymatic remodeling experiments . . . . . . . . . . . . . . . . 47
III3.1.5 Preparation of vesicle encapsulated samples . . . . . . . . . . . 48
3.2 Confocal microscope systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.2.1 The Fluorescence Fluctuation Microscope . . . . . . . . . . . . 49
3.2.2 Acousto-optical intensity modulation . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.2.3 Single molecule spectrometer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.2.4 Data acquisition. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.3 Data analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.3.1 LEE-filtering of the raw data stream . . . . . . . . . . . . . . . 58
3.3.2 Single molecule data analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.3.3 Data analysis software - The program ”FRETtchen” . . . . . . 62
3.4 Detection parameters and calculation of P . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.4.1 Determination of the detection parameters . . . . . . . . . . . . 65
3.4.2 Calculation of the proximity ratio . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.5 Multiparameter fluorescence detection . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
4 System optimisation 71
4.1 Optimum fluorophore excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.2 Photostability of fluorophores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2.1 Molecular basis of photodestruction . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2.2 Comparison of different photostabilizers . . . . . . . . . . . . . 75
4.3 Optimisation of the detection efficiencies . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.3.1 Calculation of detection efficiencies . . . . . . . . . . . . . . . . 82
4.3.2 Influence of Raman scattering . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
4.3.3 Estimation of the crosstalk and the detection factor . . . . . . . 85
4.4 Optimisation of the burst selection process . . . . . . . . . . . . . . . . 85
4.4.1 Burst selection thresholds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
4.4.2 LEE filter window . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
4.5 Measures to increase the photon yield . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.5.1 Increasing the viscosity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
4.5.2 Changing the hydrodynamic radius . . . . . . . . . . . . . . . . 92
4.6 Control experiments on FRET standards . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
4.7 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
5 Stability and dynamics of nucleosomes 101
5.1 Nucleosome stability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.1.1 Stabilisation by inert protein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
5.1.2 Stabilisation by unlabeled nucleosomes . . . . . . . . . . . . . . 105
5.2 Nucleosome dynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
5.3 Detection scheme for low-FRET nucleosomes . . . . . . . . . . . . . . . 111
35.3.1 The idea behind D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
35.3.2 Experimental realisation of D . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
5.4 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
IV6 Nucleosome remodeling 119
6.1 Nucleosome repositioning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
6.1.1 Model system to detect a loop based repositioning . . . . . . . . 120
6.1.2 Thermally induced repositioning . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
6.1.3 ATP-independent remodeling - NAP1 . . . . . . . . . . . . . . . 123
6.1.4 ATP-dependent remodeling - ISWI and BRG1 . . . . . . . . . . 125
6.2 Effect of DNA sequence and histone acetylation . . . . . . . . . . . . . 131
6.2.1 Prerequisites. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
6.2.2 Influence of the DNA sequence . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
6.2.3 Effect of histone acetylation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137
6.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140
7 Concluding remarks 145
7.1 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145
7.2 Future perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148
7.2.1 Improved protocol for mobilisation assays . . . . . . . . . . . . 148
7.2.2 Analysis of immobilised nucleosomes . . . . . . . . . . . . . . . 150
VVI

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