Compréhension et prédiction de l'énantiosélectivité des lipases, Comprehension and prediction of lipases enantioselectivity

De
Publié par

Sous la direction de Magali Remaud-simeon
Thèse soutenue le 19 janvier 2010: INSA de Toulouse
Cette étude a porté sur l’analyse de l’énantiosélectivité de la lipase de Burkholderia cepacia (BCL) pour les acides 2-substitués, synthons chiraux d’intérêt pharmaceutique, avec pour objectif d’examiner le rôle de l’accès au site actif enfoui de BCL sur l’énantiosélectivité et de développer une procédure d’ingénierie permettant de créer des mutants d’énantiosélectivité améliorée. Pour traiter le problème, une nouvelle approche de calcul, basée sur des algorithmes de planification de mouvements issus de la robotique a été développée. Elle permet l’exploration conformationnelle des espaces multi-dimensionnels contraints et a été appliquée au calcul des trajectoires de plusieurs racémiques dans le site actif de BCL et à l’identification de résidus pouvant potentiellement gêner le déplacement du substrat le long du site actif. Les résultats obtenus in silico ont révélé une corrélation qualitative avec les valeurs d’énantiosélectivité et ont permis de proposer des cibles de mutagénèse. Sur cette base, l’ingénierie du site actif de BCL a été entreprise pour moduler sélectivement l’accès des énantiomères R et S à la triade catalytique. Un système d’expression hétérologue de BCL chez E. coli compatible avec une expression en microplaque, a été développé. Une librairie de 57 (3x19) mono-mutants sur les positions : Leu17, Val266 et Leu287 a été construite par iPCR puis criblée en utilisant une procédure à moyen débit pour identifier les variants actifs pour l’hydrolyse du pNPB. L’énantiosélectivité de ces mutants a ensuite été évaluée pour l’hydrolyse du racémique (R,S)-2 bromophényl acétate de 2-chloro-éthyle, par utilisation d’une nouvelle procédure de criblage en deep-wells. Ce crible a permis de mettre en évidence plusieurs mutants dont les plus prometteurs ont été caractérisés. Ainsi les mutants Leu17Ser et Leu17Met présentent une augmentation de l’énantiosélectivité d’un facteur 10 accompagnée d’une augmentation de leur activité d’un facteur 4 à 5. Le mutant Val266Gly présente, quant à lui, une inversion de l’énantiosélectivité pour le substrat d’intérêt. L’étude des trajectoires par les techniques de planification combinée à une représentation sous la forme de carte de voxels a été réalisée en parallèle. Pour les mutants sélectionnés, une bonne corrélation a été observée entre les résultats obtenus in silico et expérimentalement. De plus, cela a permis de proposer de nouvelles combinaisons de mutations ayant conduit à l’identification de deux double-mutants Leu17Met/Val266Met et Leu17Ser/Leu287Ile d’énantiosélectivité supérieure à 150 pour le substrat modèle, révélant ainsi l’intérêt de l’approche semi-rationnelle proposée
-Algorithmes de planification du mouvement
-Lipase de Burkholderia cepacia
-Mutagénèse dirigée
-Système d’expression hétérologue chez E. coli
-Criblage
-Énantiosélectivité
-Modélisation moléculaire
-Accessibilité du substrat
This work has been focused on the understanding of the Burkholderia cepacia lipase (BCL) enantioselectivity towards 2-substituted acids which are chiral building blocks of pharmaceutical interest. The main objective of this work was the investigation of the potential role of substrate accessibility toward the buried active site of BCL on enantioselectivity and the development of an engineering procedure for the design of enantioselective mutants. To study further this hypothesis, a novel computational approach, based on motion-planning algorithms, originally used in robotics, was developed. It allows the conformational exploration of constrained high-dimensional spaces and was applied to the computation of trajectories for a set of racemates within the catalytic site. This methodology also enables the identification of residues potentially hindering substrates displacement along the active site. Results obtained in silico were correlated qualitatively with experimental values of enantioselectivity. On the basis of these results, engineering of the narrow active site of BCL has been undertaken to modulate selectively the access of R and S enantiomers to the catalytic triade. An heterologous expression system of BCL in E. coli compatible with production at microplate scale was developed. A library of 57 (3x19) variants targeted at positions Leu17, Val266 and Leu287 was built by iPCR and subsequently screened using a medium-throughput procedure to identify active variants against pNPB hydrolysis. Next, the enantioselectivity of these mutants was evaluated towards a given racemate, the (R,S)-2-chloro ethyl 2-bromophenylacetate, using a novel screening procedure developed in deep wells. Such screening enabled the identification of several variants amongst which the most promising were characterized. Mutants Leu17Ser and Leu17Met showed a remarkable 10-fold increase of their enantioselectivity and a 4- and 5-fold improvement of their specific activity. Compared to the wild-type enzyme, mutant Val266Gly displayed a reversed enantioselectivity for the substrate of interest. Investigation of the trajectories using motion-planning techniques combined to a voxel map representation was carried out. For selected variants, a fair correlation was observed between in silico and experimental results. Moreover, this enabled us to suggest novel combinations of mutations that led to the identification of two double-mutants Leu17Met/Val266Met and Leu17Ser/Leu287Ile showing an enantioselectivity value higher than 150 for the racemic substrate, revealing thus the effiency of the semi-rational strategy
-Motion planning algorithms
-Burkholderia cepacia lipase
-Directed mutagenesis
-E. coli heterologous expression
-Screening
-Enantioselectivity
-Molecular modeling
-Substrate accessibility
Source: http://www.theses.fr/2010ISAT0002/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
Lecture(s) : 136
Nombre de pages : 282
Voir plus Voir moins


THÈSE
présentée devant
L’Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse

en vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE
N° d’ordre : 1021

Spécialité : Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries
Filière : Ingénieries Microbienne et Enzymatique

par Vincent Lafaquière
Ingénieur INSA Toulouse


COMPRÉHENSION ET PRÉDICTION DE
L’ÉNANTIOSÉLECTIVITÉ DES LIPASES


Soutenue le 19 Janvier 2010 devant la commission d’examen :

Brigitte KERFELEC Chargée de Recherche CNRS, INSERM U624, Marseille
Juan HERMOSO Professeur, Instituto de Quimica-Fisica Rocasolano-CSIC, Madrid
Éric DUBREUCQ Professeur, SupAgro, Montpellier
Pierre MONSAN Professeur INSA, Toulouse
Isabelle ANDRÉ Chargée de Recherche CNRS, LISBP-INSA, Toulouse
Magali REMAUD-SIMÉON Professeur INSA, Toulouse




Cette thèse a été préparée au Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés
(UMR CNRS 5504, UMR INRA 792) de l'INSA de Toulouse, dans le cadre de l’école doctorale
SEVAB.










Nom : LAFAQUIÈRE Prénom : Vincent

Titre : Compréhension et prédiction de l’énantiosélectivité des lipases.

Spécialité : Microbiologie et Biocatalyse Industrielles
Directrices de thèse : Magali Remaud-Siméon et Isabelle André
Année : 2010 (19 Janvier) Lieu : Toulouse N° d’ordre : 1021 Pages : 282

RESUME :
Cette étude a porté sur l’analyse de l’énantiosélectivité de la lipase de Burkholderia cepacia (BCL) pour les acides 2-
substitués, synthons chiraux d’intérêt pharmaceutique, avec pour objectif d’examiner le rôle de l’accès au site actif enfoui
de BCL sur l’énantiosélectivité et de développer une procédure d’ingénierie permettant de créer des mutants
d’énantiosélectivité améliorée. Pour traiter le problème, une nouvelle approche de calcul, basée sur des algorithmes de
planification de mouvements issus de la robotique a été développée. Elle permet l’exploration conformationnelle des
espaces multi-dimensionnels contraints et a été appliquée au calcul des trajectoires de plusieurs racémiques dans le site
actif de BCL et à l’identification de résidus pouvant potentiellement gêner le déplacement du substrat le long du site actif.
Les résultats obtenus in silico ont révélé une corrélation qualitative avec les valeurs d’énantiosélectivité et ont permis de
proposer des cibles de mutagénèse. Sur cette base, l’ingénierie du site actif de BCL a été entreprise pour moduler
sélectivement l’accès des énantiomères R et S à la triade catalytique. Un système d’expression hétérologue de BCL chez
E. coli compatible avec une expression en microplaque, a été développé. Une librairie de 57 (3x19) mono-mutants sur les
positions : Leu17, Val266 et Leu287 a été construite par iPCR puis criblée en utilisant une procédure à moyen débit pour
identifier les variants actifs pour l’hydrolyse du pNPB. L’énantiosélectivité de ces mutants a ensuite été évaluée pour
l’hydrolyse du racémique (R,S)-2 bromophényl acétate de 2-chloro-éthyle, par utilisation d’une nouvelle procédure de
criblage en deep-wells. Ce crible a permis de mettre en évidence plusieurs mutants dont les plus prometteurs ont été
caractérisés. Ainsi les mutants Leu17Ser et Leu17Met présentent une augmentation de l’énantiosélectivité d’un facteur 10
accompagnée d’une augmentation de leur activité d’un facteur 4 à 5. Le mutant Val266Gly présente, quant à lui, une
inversion de l’énantiosélectivité pour le substrat d’intérêt. L’étude des trajectoires par les techniques de planification
combinée à une représentation sous la forme de carte de voxels a été réalisée en parallèle. Pour les mutants sélectionnés,
une bonne corrélation a été observée entre les résultats obtenus in silico et expérimentalement. De plus, cela a permis de
proposer de nouvelles combinaisons de mutations ayant conduit à l’identification de deux double-mutants
Leu17Met/Val266Met et Leu17Ser/Leu287Ile d’énantiosélectivité supérieure à 150 pour le substrat modèle, révélant
ainsi l’intérêt de l’approche semi-rationnelle proposée.

MOTS CLÉS :
Lipase de Burkholderia cepacia, mutagénèse dirigée, système d’expression hétérologue chez E. coli, criblage,
énantiosélectivité, modélisation moléculaire, algorithmes de planification du mouvement, accessibilité du substrat
JURY :
Brigitte KERFELEC, Chargée de Recherche CNRS, INSERM U624, Marseille/ Rapporteur
Juan HERMOSO, Professeur, Instituto de Quimica-Fisica Rocasolano-CSIC, Madrid/ Rapporteur
Éric DUBREUCQ, Professeur, SupAgro, Montpellier/ Examinateur
Pierre MONSAN, Professeur INSA, Toulouse
Isabelle ANDRÉ, Chargée de Recherche CNRS, LISBP-INSA, Toulouse/ Directrice de thèse
Magali REMAUD-SIMÉON, Professeur INSA, Toulouse/ Directrice de thèse
Soutenance prévue le 19 janvier 2010, à l’Institut National des Sciences Appliquées de Toulouse
École Doctorale : SEVAB (Sciences Ecologiques, Vétérinaires, Agronomiques et Bioingénieries)
Laboratoire : Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés UMR5504 CNRS/INSA, UMR792 INRA/INSA.
3




Name: LAFAQUIÈRE First name: Vincent

Title: Comprehension and prediction of lipases enantioselectivity.

Speciality: Industrial Microbiology and Biocatalysis
Supervisors: Magali Remaud-Siméon and Isabelle André

thYear: 2010 (January, 19) Pages: 28

ABSTRACT:
This work has been focused on the understanding of the Burkholderia cepacia lipase (BCL) enantioselectivity towards 2-
substituted acids which are chiral building blocks of pharmaceutical interest. The main objective of this work was the
investigation of the potential role of substrate accessibility toward the buried active site of BCL on enantioselectivity and
the development of an engineering procedure for the design of enantioselective mutants. To study further this hypothesis,
a novel computational approach, based on motion-planning algorithms, originally used in robotics, was developed. It
allows the conformational exploration of constrained high-dimensional spaces and was applied to the computation of
trajectories for a set of racemates within the catalytic site. This methodology also enables the identification of residues
potentially hindering substrates displacement along the active site. Results obtained in silico were correlated qualitatively
with experimental values of enantioselectivity. On the basis of these results, engineering of the narrow active site of BCL
has been undertaken to modulate selectively the access of R and S enantiomers to the catalytic triade. An heterologous
expression system of BCL in E. coli compatible with production at microplate scale was developed. A library of 57
(3x19) variants targeted at positions Leu17, Val266 and Leu287 was built by iPCR and subsequently screened using a
medium-throughput procedure to identify active variants against pNPB hydrolysis. Next, the enantioselectivity of these
mutants was evaluated towards a given racemate, the (R,S)-2-chloro ethyl 2-bromophenylacetate, using a novel screening
procedure developed in deep wells. Such screening enabled the identification of several variants amongst which the most
promising were characterized. Mutants Leu17Ser and Leu17Met showed a remarkable 10-fold increase of their
enantioselectivity and a 4- and 5-fold improvement of their specific activity. Compared to the wild-type enzyme, mutant
Val266Gly displayed a reversed enantioselectivity for the substrate of interest. Investigation of the trajectories using
motion-planning techniques combined to a voxel map representation was carried out. For selected variants, a fair
correlation was observed between in silico and experimental results. Moreover, this enabled us to suggest novel
combinations of mutations that led to the identification of two double-mutants Leu17Met/Val266Met and
Leu17Ser/Leu287Ile showing an enantioselectivity value higher than 150 for the racemic substrate, revealing thus the
effiency of the semi-rational strategy.

KEY WORDS:
Burkholderia cepacia lipase, directed mutagenesis, E. coli heterologous expression, screening, enantioselectivity,
molecular modeling, motion planning algorithms, substrate accessibility
JURY:
Brigitte KERFELEC, Research Scientist CNRS, INSERM U624, Marseille
Juan HERMOSO, Professor, Instituto de Quimica-Fisica Rocasolano-CSIC, Madrid
Éric DUBREUCQ, Professor, SupAgro, Montpellier
Pierre MONSAN, Professor INSA, Toulouse
Isabelle ANDRÉ, Research Scientist CNRS, LISBP-INSA, Toulouse
Magali REMAUD-SIMÉON, Professor INSA, Toulouse
thDefense planned January, the 19 2010 at National Institute of Applied Sciences in Toulouse
Doctorate school: SEVAB (Ecological, Veterinary and Agronomic Sciences and Bioengineering)
Laboratory: Laboratory for Biosystems and Chemical Engineering UMR5504 CNRS/INSA, UMR792 INRA/INSA.

5






Publications


Control of Lipase Enantioselectivity by Engineering the Substrate Binding Site and
Access Channel.
V. Lafaquière, S. Barbe, S. Puech-Guenot, D. Guieysse, J. Cortés, P. Monsan, T. Siméon, I.
André and M. Remaud-Siméon. ChemBioChem., sous presse (2009).


Insights into lid movements of Burkholderia cepacia lipase inferred from molecular
dynamics simulations.
S. Barbe, V. Lafaquière, D. Guieysse, P. Monsan, M. Remaud-Siméon, I. André, Proteins:
Structure, function, bioinformatics. 2009, 77, (3), 509-523.


A structure-controlled investigation of lipase enantioselectivity by a path-planning
approach.
D. Guieysse, J. Cortés, S. Puech-Guenot, S. Barbe, V. Lafaquière, P. Monsan, T. Siméon, I.
André, and M. Remaud-Siméon, ChemBioChem, 9, (2008) 1308-1317.


Small-scale production of Burkholderia cepacia ATCC21808 lipase adapted to high-
throughput screening.
S. Puech-Guenot, V. Lafaquière, D. Guieysse, L. Landric-Burtin, P. Monsan, and M.
Remaud-Siméon., J Biomol Screen. 13 (2008) 72-79.


Communications par affiche


Towards a predictive model of Burkholderia cepacia lipase enantioselectivity using a
robotic-based path planning approach.
S. Barbe, V. Lafaquière, S. Guenot, D. Guieysse, J. Cortés, T. Siméon, P. Monsan, I. André,
M. Remaud-Siméon (2007). Groupe de Graphisme et Modélisation Moléculaire,
L’Escandille, France.


A structured-controlled lipase enantioselectivity investigated by a path planning
approach.
V. Lafaquière, S. Barbe, S. Guenot, D. Guieysse, J. Cortés, T. Siméon, P. Monsan, I. André
and M. Remaud-Siméon.
ESF-EMBO Symposium on Protein Design and Evolution for Biocatalysis , Sant Feliu, Spain:
25-30 October 2008.

approach.
V. Lafaquière, S. Barbe, S. Guenot, D. Guieysse, J. Cortés, T. Siméon, P. Monsan, I. André
and M. Remaud-Siméon.
Journée chimie-Biologie , Toulouse, 2 Juin 2009.
7





















































Tout d’abord, je tiens à remercier mes deux directrices de thèse : Magali Remaud-Siméon et
Isabelle André pour leur enthousiasme à l’égard de ce projet mais également toute l’expertise
qu’elles ont apporté pour conduire à la réussite de celui-ci.
Magali, merci pour tes encouragements et tes idées lorsque les manips ne fonctionnaient pas.
Isa, merci pour ta disponibilité de chaque instant, ton professionnalisme et ton aide dans les
moments difficiles.

Je tiens également à remercier Pierre Monsan pour son enthousiasme, son dynamisme et sa
bonne humeur.

Je remercie Brigitte Kerfelec, Juan Hermoso et Eric Dubreucq pour avoir accepté d’être
rapporteurs et pour l’attention qu’ils ont portée à ce travail.

La qualité du travail présenté ici est le fruit d’un travail d’équipe. J’ai pour cela profité de
l’expérience et de l’efficacité de Sophie Barbe et de David Guieysse.
Merci à Sophie pour m’avoir fait découvrir le monde merveilleux de la modélisation
moléculaire et de la robotique. Tu as toujours été disponible pour m’expliquer le
fonctionnement de ces techniques et pour être venu à mon secours lorsque j’étais bloqué par
des messages d’erreurs que je ne comprenais pas.
Merci à David pour avoir synthétisé les substrats, pour ton expertise en ce qui concerne la
partie chimie de ce projet et la mise en œuvre de BCL.

Je tiens aussi à remercier Thierry Siméon et Juan Cortès du Laboratoire d’Analyse et
d’Architecture des Systèmes (LAAS) pour leur collaboration fructueuse durant ces trois ans.

Je remercie également tous mes collègues de l’EAD1 avec qui j’ai eu énormément de plaisir à
travailler : Etienne, Flo, Gaby, Yoann, Alain, Laurence, Sandra, Mike, Sandrine(s), Régis,
Hélène, Faten, Claire(s), Sophie(s), Fernando, Mélanie, Marine (alias Jeanne), Péco, Manue,
Didier, Nicolas … Je tiens à vous exprimer une grande sympathie et je vous souhaite le
meilleur.

Merci à Sophie Puech-Guenot, ma maître de stage de master, avec qui j’ai eu énormément de
plaisir à travailler. Merci pour tous tes conseils et pour avoir pris le temps de m’apprendre
tout ce que tu sais ….

Merci à Elise, « ma copine de sport », toujours souriante et dynamique. C’est un vrai bonheur
de travailler avec des personnes comme toi qui sont à la fois compétentes, dynamiques et
toujours souriantes.

Merci à Olivier et Romain pour avoir pris le temps de faire du sport avec moi lorsque j’avais
besoin de me détendre.

Merci à Stef (alias Google) pour sa culture encyclopédique et ses réponses à tout.

Merci au 3T (Nelly, Sabrina et Nico) pour les pauses café bien sympas …. et pour avoir pris
avec humour mes petites blagounettes …

Je tiens aussi à remercier toutes les personnes du LISBP et tout particulièrement « ma copine
de rédaction » Claire Saulou. Tu m’as énormément soutenu tout au long de cette épreuve ….



Merci Papa, Maman et Gwendo pour avoir toujours été là pour moi surtout dans les moments
difficiles.


Merci à tous mes copains : la « dream team » de médecine : Lolo, Jojo, Xav et à Sylvain que
je connais depuis les bacs à sables. Et merci à tout ceux que j’ai connu depuis : Charlotte,
Béa, Laureline, Phil et Adi, Romain, Sophie et Jean-Phi, Guillaume et Claire (et leur petite
Mélanie), Yannick et Caro…..




Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.

Diffusez cette publication

Vous aimerez aussi