Conception, étude structurale et propriétés fonctionnelles de nouveaux peptidomimes antigéniques pour une immunothérapie antitumorale

De
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Sous la direction de Stéphane Quideau
Thèse soutenue le 26 novembre 2010: Bordeaux 1
Des peptides antigéniques sont présentés à la surface des cellules cancéreuses ou infectées par un virus pour être reconnus par des cellules du système immunitaire. Cette reconnaissance déclenche alors une réponse immunitaire spécifique contre les cellules présentatrices ciblées. L'objectif de ce projet est de stimuler cette réponse immunitaire afin qu'elle soit un moyen thérapeutique pour détruire spécifiquement les cellules cancéreuses ou infectées. Toutefois, les peptides antigéniques ne peuvent pas être administrés tels quels, du fait de leur pauvre stabilité en milieu biologique. Il est donc nécessaire de les modifier afin qu’ils soient plus résistants. Le défi de ce projet est de synthétiser des peptidomimes bio-résistants, capables de reproduire la même réponse immunitaire que celle du peptide antigénique naturel.
-Peptidomimes
-Synthèse sur support solide
-Immunothérapie
Abstract
-Peptidomimetics
-Solid phase synthesis
-Immunotherapy
Source: http://www.theses.fr/2010BOR14114/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
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N° ORDRE : 4114
THESE DE DOCTORAT

PRESENTEE A

L’UNIVERSITE DE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES
Par Marion TARBE
POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR
SPECIALITE : CHIMIE ORGANIQUE

CONCEPTION, ETUDE STRUCTURALE ET PROPRIETES
FONCTIONNELLES DE NOUVEAUX PEPTIDOMIMES ANTIGENIQUES
POUR UNE IMMUNOTHERAPIE ANTITUMORALE


Directeur de thèse : Pr Stéphane QUIDEAU

Soutenue le 26 Novembre 2010

Après avis de :
P. DUMY : Professeur, Université Joseph Fourier, Grenoble I
D. HOUSSET : Directeur de recherche (CNRS), Université Joseph Fourier, Grenoble I

Devant la commission d’examen formée de :
P. DUMY Professeur, Université Grenoble I Rapporteur
D. HOUSSET Directeur de recherche (CNRS), Université Grenoble I Rapporteur
B. PFEIFFER Les Laboratoires Servier, Croissy-sur-Seine Examinateur
J.-M. AIZPURUA Professeur, Université du Pays-Basque Examinateur
C. DOUAT-CASASSUS Chargée de recherche (CNRS), Université Bordeaux I Examinateur
S. JAVERZAT Professeur, Université Bordeaux I Président de Jury
S. QUIDEAU Professeur, Université Bordeaux I Directeur de thèse

-2010- b
Remerciements

Cette thèse, réalisée au sein de l’Institut Européen de Chimie et Biologie (IECB), est
l’aboutissement de trois années de travail de recherche dans le groupe Synthèse de l’Institut
des Sciences Moléculaires (ISM). Je tiens à remercier les directeurs de l’IECB, le Dr Jean-
Jacques Toulmé et le Dr Ivan Huc ainsi que le Dr Philippes Garrigues et le Pr Eric Fouquet,
respectivement directeurs de l’ISM et du groupe Synthèse, pour m’avoir accueillie dans leur
laboratoire. Ces travaux ont été financés par Les laboratoires Servier après sélection par la
Société Française de Chimie Thérapeutique. Je remercie chaleureusement le Dr Bruno
Pfeiffer qui a suivi ce travail avec intérêt pendant ces trois ans.

Je tiens tout d’abord à remercier le Pr Stéphane Quideau pour m’avoir accueillie dans son
équipe. Il m’a permis de vivre une expérience de thèse riche en rencontres et en
rebondissements.

Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance au Dr Céline Douat-Casassus qui m’a
encadrée et guidée depuis mon stage de master 2 et tout au long de cette thèse. Merci pour
tout le temps que tu m’as consacrée, notamment pour la relecture de ce manuscrit. Merci pour
tes précieux conseils, ta confiance, tes encouragements…et tout le reste !

Je remercie sincèrement le Pr Pascal Dumy et le Dr Dominique Housset d’avoir accepté de
juger ce travail en tant que rapporteurs ainsi que le Pr Sophie Javerzat d’avoir accepté de
présider ce jury.

Je souhaite également remercier toutes les personnes qui ont contribuées aux différents projets
présentés dans ce manuscrit : Nathalie Marchand-Geneste pour son aide en modélisation
moléculaire, l’équipe du Pr Brian M. Baker pour les résolutions de structures, l’équipe du Pr
Andrew K. Sewell pour les tests biologiques, le Pr Txusmari Aizpurua et Itxaso Azcune qui
n’ont pas hésiter à nous confier leurs molécules -lactame. Leurs compétences, leur
motivation et leur investissement ont permis de mener à bien les différents projets qui nous
réunissaient.


i Bien évidemment, le quotidien de ces trois années a été rythmé par de nombreuses rencontres
et échanges avec les différents membres de l’équipe et des équipes voisines. Je tiens donc à
tous les remercier pour leurs conseils, leur bonne humeur et leur sympathie.

Je commencerai tout d’abord par les modélisateurs callées toutes la journée devant leur ordi :
Jean-mimi, à quand une petite bière sur le vieux port ?!; Clément dit "Piou", Judith, Jean; les
RMNistes, Axelle pour ton énergie contagieuse, Cécile pour ta gentillesse (alors cette
autoroute, ça roule ?) Les massistes : Katel, merci pour tes dépannages express et ton calme à
toute épreuve… Stéphane, mes après-midis de spectro de masse ne seront plus les mêmes sans
tes sifflotements! Passons au premier étage : Sabrina, Natacha, Cécile, les pauses déjeuners à
discuter recherche de champignons et vignes ; Fred merci d’avoir partagé avec moi le stress et
les galères de la JJC ; Stéph, tu m’as fait découvrir les sushis et bien d’autres choses ; tu
mérites vraiment d’être heureux, alors fais attention à toi… Je n’oublie pas les filles de
l’administration, Annie, Sandra et Stéphanie et de l’accueil, Coralie, Françoise et Samantha
pour leur gentillesse et tous les petits services rendus.

Viennent ensuite les chimistes du second : Benoit sur son petit coin de paillasse, merci d’avoir
écouté ma soutenance à la veille du jour J ; Bobby et le Swing…l’un ne va pas sans l’autre !
Jone, la voyageuse solitaire…alors ce congrès en Inde ? Simon, tes imitations et ton accent à
couper au couteau ! Neil, pour ton calme et ta sympathie ; El tranquilo Oscar, jamais
stressé…comment fais-tu ? Marissa, à quand ta prochaine visite à l’alambic ? Tiny et Stain, le
pays de l’Armagnac vous attend ! Seb et Michael, pour nos soirées passées ensemble pendant
votre trop bref séjour ; Lucille, Claire, Thomas, Elisabeth, Marc, Vania, Guillaume, Yannick,
Tracey, Claude, Gosia, Nico…
Je n’oublie pas nos voisins biologistes, Margo, Cécile, Rosina (bientôt ton tour !), Daniel,
Carmelo, Eric, Denis,…les chimistes ne sont pas toujours responsables des mauvaises
odeurs !

Je tiens également à remercier tous les membres de l’équipe que j’ai côtoyés au fil de ces trois
années, pendant une période plus ou moins longue. Tout d’abord, les personnes qui m’ont
accueillie à mon arrivée en thèse, à savoir les anciens thésards : Gigi, le vrai breton du groupe,
dix colonnes en même temps, c’est beaucoup trop ! Comme tu peux le voir, mon bouclier m’a
permis d’arriver au bout ; Mélanie, merci pour toutes nos discussions et bons moments passés
ensemble, ta simplicité et ton humanité ; Gaëlle, Sophie, Anne-Laure, Delphine, et les
ii permanents : Rémi, merci pour tes conseils d’HPLC et pour nos discussions sur le monde et la
vie ; Laurent, Denis.
Il y a aussi eu des gens de passage : la bella Anna, ta mémorable Rose, ton grand sourire et
nos séances de gym…pleins de bons souvenirs ! Mamezelle Gueroux, je suis vraiment
heureuse que tu ais atterri en stage chez nous ; tes bonhommes ballons qui décorent le bureau,
les pauses café du matin et ta bonne humeur vont me manquer ; bon courage pour ta thèse.
Leire, merci pour ta générosité et ta simplicité…promis, à bientôt à Donostia ! Merci aussi à
Elodie que j’ai encadrée durant son stage de licence. Je pense également à Jaime, Neela,
Richard, Ada et Vanessa que n’ai pas eu l’occasion de vraiment connaître.
Ensuite, les petits nouveaux : Romain (où en sont tes couplages peptidiques ?), Cyril et
Hélène, déjà très complices dans le rangement du laboratoire, et Emilie, la dernière arrivée
dans le labo des filles (désolé Rémi…), toujours de bonne humeur; bon courage à vous tous
pour cette nouvelle aventure ! Mélanicita, un grand merci pour ton positivisme, tes
discussions pleines de bon sens et tes playlists ! Manu, bien sûr, tes cours d’italien, les pauses
café, nos discussions sur tant de choses ; j’espère que tu trouveras le job que tu mérites. Dans
la continuité des post-docs, Céline F., dernière arrivée, merci pour tes bons conseils à
quelques semaines de la soutenance…juste un peu déçu que l’on ne se soit pas connu plus tôt,
bonne continuation. Sa « prédécesseuse », Séverine et son chouchou…tout une histoire !
J’espère que ta nouvelle vie à Anger, entre carottes et étudiants, se déroule comme tu le veux.
Enfin pour finir dans la série des post-docs, Stefan, bien évidemment, merci pour tes exercices
en chimie et tes précieux conseils en la matière…mais pas « que » !

Un grand merci ensuite, et le mot est faible, à la cuvée de docteurs 2010 avec qui j’ai partagé
pendant ces trois ans l’expérience de doctorant. La miss, je n’oublierai pas nos cours de
cardio-box dantesques, nos soirées essayages, tes Pouah (que j’essaie d’exporter à Marseille)
et nos discussions mas longues sur l’avenir..., ça y est, on y est! Tony, tes cours privés de
mécanismes réactionnels, ta dévotion et tous le reste!…à quand le prochain "femmes
actuelles" ? Et est-ce que tu es disponible le 1 octobre 2007 ?...parce que je fais un petit truc
pour mon anniversaire (mieux vaut tard que jamais…) Marine, ou plutôt "madame la
collaboratrice Servier", nos trois ans (et même cinq ans) passés ensemble ont été riches en
rebondissements : depuis les attributions de bourses de thèse jusqu’à nos embauches
respectives, on en a fait du chemin ! Merci pour tes conseils avisés, ta franchise et toutes nos
soirées à papoter et potiner ; Olivier, grande année pour toi ! Je n’oublierai pas les soirées au
bar à vin et nos discussions sur le couple avec un fond de match de foot ! Tahiri garde
iii toujours ta bonne humeur et ton calme qui te caractérise! Maria, la première de nous tous à
avoir franchi le cap ; Vanessa, Adeline, Armelle, et bientôt Jeannot. Encore une fois,
félicitations à tous et bon courage pour la suite ! Ceci n’était que le commencement…

Pour finir, un immense merci à toute ma famille : papa, maman, bien évidemment, tout ça,
c’est d’abord grâce à vous ; papa merci pour ton bon sens et tes encouragements année après
année; maman, merci pour tes précieux conseils au quotidien et les dizaines de boîtes
préparées pendant ces trois années. Cécile, ma deuxième maman, merci pour ton soutien et
nos après-midis shopping qui m’ont permis d’oublier les tracas du labo. Merci aussi à mon
club de supporters venu me soutenir le jour J : Jérôme, Elise, Nico, Monique, Francis, Marc,
Dédée, Yves, et tous ceux qui n’ont pas pu être présents : Mamie, Tonton et Tatie, Jean-
jacques, Patricia, Simon, Monique, Mathieu, Mélanie, Marlène, Bernard, Mathieu 2, Marie-
hélène, André, Manu, Vincent, Céline, Anaïs et Théo. Enfin, Cédric, merci pour ton écoute et
ta patience au quotidien…merci pour tout ce que tu m’apportes.
iv Sommaire


Introduction générale 3

Chapitre 1 : L’immunité à médiation cellulaire : 7
Action des lymphocytes T cytolytiques et modulation
de leur stimulation par des antigènes peptidiques modifiés.
I. Généralités sur l’immunité à médiation cellulaire 9
II. Présentation de peptides antigéniques par le CMH-I 10
2.1 Formation des complexes binaires peptides antigéniques/CMH-I 10
2.2 Analyse structurale du complexe pCMH 13
+
III. Stimulation des lymphocytes T cytolytiques CD8 16
3.1 Reconnaissance du complexe pCMH par les récepteurs des lymphocytes T 16
3.2 Analyse structurale du complexe ternaire TCR/pCMH 18
IV. Le peptide antigénique et son utilisation en immunothérapie 20
4.1 Le principe de l’immunothérapie 20
4.2 Origine des peptides antigéniques tumoraux 21
4.3 L’utilisation de peptides antigéniques en immunothérapie 22
4.3.1 Les avantages 22
4.3.2 Les limitations 22
4.4 Vers la synthèse de peptidomimes antigéniques 23
4.4.1 Modification de la chaîne peptidique pour accroître 23
la stabilité du peptide en milieu biologique
4.4.2 Modification des résidus d’ancrage pour accroître 29
l’interaction du peptide avec le CMH-I
4.4.3 Modification de la partie centrale interagissant avec 30
les récepteurs des lymphocytes T
Conclusion 35
Références bibliographiques 36
Collaboration 43

Chapitre 2 : Etat de l’art sur la modification du peptide antigénique 45
Melan-A/MART-1 A27L 26-35
Préambule 47
I. Le peptide antigénique Melan-A/MART A27L 47 26-35
1.1 Identification des peptides antigéniques naturels et de leurs analogues 47
v 1.2 Etude structurale des peptides présentés 48
1.3 Limitation de l’utilisation du peptide ELA en milieu biologique 50
II. Modification du peptide ELA 51
2.1 Modification des extrémités N- et C-terminales du peptide ELA 51
2.2 Modification de la partie centrale du peptide ELA 53
2.2.1 Insertion d’une molécule naturelle en partie centrale du peptide ELA 53
2.2.2 Modification du tétrapeptide GIGI en partie centrale du peptide 56
ELA : Présentation de 23 nouveaux analogues
III. Résultats récents : Etude structurale de différents 62
complexes binaires peptide/HLA-A2
3.1 Synthèse des quatre peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1 sur support solide 63
3.1.1 La synthèse peptidique sur support solide 63
3.1.2 Synthèse des quatre peptidomimes ciblés 64
3.2 Etude structurale des quatre complexes binaires peptide/HLA-A2 69
3.2.1 Génération des cristaux de complexes binaires 69
et acquisition des données cristallographiques
3.2.2 Discussion autour des quatre structures obtenues : 70
comparaison avec celle du complexe ELA/HLA-A2
3.2.3 Corrélation des tests biologiques 73
et des structures cristallines des peptides 6 et 21
Conclusion 75
V. Partie expérimentale 76
4.1 Généralités 76
4.1.1 Conditions expérimentales générales de synthèse en solution 76
4.1.2 Techniques d’analyse des molécules synthétisées en solution 76
4.1.3 Conditions expérimentales générales de 77
synthèse peptidique sur support solide
4.1.4 Techniques d’analyse et de purification des peptides et peptidomimes 78
4.2 Préparation des peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1 80
4.2.1 Préparation des différents synthons en solution 80
4.2.2 Procédure générale de synthèse des peptides sur support solide 85
4.2.3 Synthèse des peptidomimes 6, 6.1, 21 et 21.1 sur support solide 86
Références bibliographiques 90



vi b

Chapitre 3 : Application de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre 95
pour la synthèse de nouveaux peptidomimes du peptide ELA
Préambule 97
I. Les réactions de « click-chemistry » : La réaction de Huisgen catalysée au cuivre 97
1.1 Les réactions de « click-chemistry» 97
1.2 La réaction de cycloaddition 2+3 alcyne/azoture : 98
La réaction de Huisgen catalysée au cuivre
1.2.1 Mécanisme de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre 99
1.2.2 Effet des conditions réactionnelles 102
1.3 Propriétés structurales des cycles 1,2,3-triazoles : Utilisation au sein de peptides 105

II. Utilisation de la réaction de Huisgen pour la synthèse de nouveaux peptidomimes 107
2.1 Présentation du projet 107
2.2 Application de la réaction de Huisgen catalysée au cuivre (I) 109
à la synthèse de peptidomimes de ELA
2.2.1 Synthèse du squelette peptidique sur support solide 110
2.2.2 Préparation des dérivés azotures à introduire en partie centrale 111
2.2.3 Synthèses des peptidomimes : application 116
de la réaction Huisgen catalysée au cuivre (I) sur support solide
2.3 Tests biologiques des peptidomimes issus de la « click-chemistry » 117
2.3.1 Evaluation de l’affinité de liaison des peptidomimes 117
56-66 au HLA-A2
2.3.2 Evaluation de la capacité des peptidomimes 56-66 119
à stimuler des lymphocytes T
III. Modifications des extrémités N- et C-terminales du peptidomimes 58 : 121
synthèse de sept nouveaux analogues
3.1 Présentation des différentes modifications 121
3.2 Synthèse de sept nouveaux analogues du peptidomime 58 122
3.2.1 Réduction de la liaison peptidique en position P8-P9 122
3.2.2 Couplage de la ( -cyclohexyl) alanine sur support solide 123
3.2.3 Synthèse du motif phthalimide en position N-terminale 124
3.2.4 Combinaison des différentes modifications : 126
Génération des quatre analogues supplémentaires
3.3 Tests biologiques des sept nouveaux analogues du peptide 58 127
3.3.1 Evaluation de l’affinité de liaison des peptidomimes 69-75 127
au HLA-A2
vii b
b
b
b
b
3.3.2 Evaluation de la capacité des peptidomimes 69-75 129
à stimuler des lymphocytes T
Conclusion 130
IV. Partie expérimentale
4.1 Synthèse des azotures en solution 131
4.2 Préparation des peptidomimes 56-66 146
4.2.1 Préparation de la résine A 146
4.2.2 Réaction de Huisgen catalysée au cuivre sur support solide 147
4.2.3 Clivage des peptides du support 147
4.2.4 Synthèse et caractérisation des peptidomimes 56-66 147
4.3 Préparation des peptidomimes 69-75 151
4.3.1 Procédure générale de la synthèse de la liaison réductrice 151
en position P8-P9
4.3.2 Procédure générale de la synthèse du motif phthalimide 151
4.3.3 Caractérisation des peptidomimes 69-75 152
Références bibliographiques 156

Chapitre 4 : Insertion de motifs -lactame en partie centrale du peptide ELA 163
Préambule 165
I. Les turns dans les peptides : Comment les mimer ? 165
1.1 Présentation et classification des turns dans les peptides 165
1.2 Introduction sur les mimes de turn : Classification 167
1.3 Présentation des mimes internes 167
1.3.1 Les cycles de taille moyenne 167
1.3.2 Les bicycles 169
1.3.3 Les macrocycles 171
1.4 Présentation des mimes externes 173
1.4.1 Les bicycles 173
1.4.2 Les lactames 174
II. Application au peptide antigénique ELA : Synthèse de nouveaux 177
peptidomimes
2.1 Design des peptidomimes 177
2.2 Description de la synthèse des motifs -lactame 179
2.3 Première stratégie : synthèse des peptidomimes sur la résine Wang 181
2.3.1 Synthèse des peptidomimes 181
viii

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