Darstellung der strukturspezifischen Schmerzkomponenten der Ratte im Formalinmodell mittels funktioneller Magnetresonanztomographen [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Ghassan Borghol

IAus dem Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-NürnbergProf. Dr. med. Dr. h.c. Kay BruneDarstellung der strukturspezifischen Schmerzkomponenten der Ratte im Formalinmodell mittels funktioneller MagnetresonanztomographenInaugural-Dissertationzur Erlangung der Doktorwürdeder Medizinischen Fakultätder Friedrich-Alexander-UniversitätErlangen-Nürnbergvorgelegt von Ghassan Borgholaus IbbenbürenIIGedruckt mit Erlaubnis derMedizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-UniversitätErlangen-NürnbergDekan: Prof. Dr. J. SchüttlerReferent: PD Dr. A. HessKorreferent: Prof. Dr. Dr. K. BruneTag der mündlichen Prüfung: 06.10.2010IIIMeinen Eltern in Dankbarkeit gewidmet.IVInhaltsverzeichnis1 Zusammenfassung................................................................................................ 11.1 Hintergrund und Ziele.................. 11.2 Versuchstiere, Material und Untersuchungsmethoden 11.3 Ergebnisse und Beobachtungen ................................................................... 11.4 Praktische Schlussfolgerung........ 21 Summary .............................................................................................................. 31.1 Background and objectives.......... 31.2 Laboratory animals, material and research methods................................
Publié le : vendredi 1 janvier 2010
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I
Aus dem Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Prof. Dr. med. Dr. h.c. Kay Brune
Darstellung der strukturspezifischen Schmerzkomponenten der Ratte im
Formalinmodell mittels funktioneller Magnetresonanztomographen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Ghassan Borghol
aus IbbenbürenII
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler
Referent: PD Dr. A. Hess
Korreferent: Prof. Dr. Dr. K. Brune
Tag der mündlichen Prüfung: 06.10.2010III
Meinen Eltern in Dankbarkeit gewidmet.IV
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung................................................................................................ 1
1.1 Hintergrund und Ziele.................. 1
1.2 Versuchstiere, Material und Untersuchungsmethoden 1
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen ................................................................... 1
1.4 Praktische Schlussfolgerung........ 2
1 Summary .............................................................................................................. 3
1.1 Background and objectives.......... 3
1.2 Laboratory animals, material and research methods.................................... 3
1.3 Results.......................................................................... 3
1.4 Practical Conclusion..................................................... 3
2 Einleitung............. 5
2.1 Allgemeine Beschreibung von Magnetresonanztomografie (MRT)............ 5
2.2 Schmerz........................................................................................................ 7
2.2.1 Definition. 7
2.2.2 Schmerzwahrnehmung, -leitung und -verarbeitung. 7
2.2.2.1 Peripherie ......................................................................................... 7
2.2.2.2 Zentrales Nervensystem................................... 8
2.2.3 Schmerzmessung.................... 11
2.2.3.1 Verhalten........................ 11
2.2.3.1.1 „Hot Plate Method“.................................... 12
2.2.3.1.2 „Tail Immersion Test“................................ 12
2.2.3.1.3 „Electrical Stimulation of the Tail“............ 12
2.2.3.1.4 „Grid Shock Test“...... 13
2.2.3.1.5 Formalin ..................................................................................... 13
2.2.3.1.5.1 Formalintest ......................................................................... 14
2.2.3.2 Elektrophysiologie......... 14
2.2.3.3 Bildgebung..................... 15
2.2.3.3.1 Positronen-Emissions-Tomografie (PET).. 15
2.2.3.3.2 Funktionelle Magnetresonanztomografie (fMRT) 16
2.2.3.4 Formalintest mit bisherigen MR-Befunden ................................... 17
2.3 Morphin...................................................................... 17
2.4 Fragestellung.............................. 18
3 Material und Methode........................................................................................ 19
3.1 Versuchstier................................ 19
3.2 Vorgehensweise bei den MR-Untersuchungen.......... 20
3.2.1 Tiervorbereitung für Formalin-Test ....................................................... 20
3.2.2 Tiervorbereitung für Formalin-Morphin-Test........ 21
3.2.3 Vorbereitung der Messung..................................................................... 21
3.2.4 MR-Abstimmung................... 22
3.2.4.1 Positionieren des zu scannenden Objektes..... 22
3.2.4.2 Matching/Tuning............ 22V
3.2.4.3 Shimming....................................................................................... 22
3.2.5 MR-Messprotokolle............... 22
3.2.5.1 TRI_Pilot........................ 23
3.2.5.2 Coronal RARE............... 23
3.2.5.3 Fastmap .......................................................................................... 23
3.2.5.4 EPI PPM 1sl 300x .......................................................................... 23
3.2.5.5 EPI PPM 30sl 1x............ 24
3.2.5.6 EPI PPM 30sl 1078x...... 24
3.2.5.7 Anatomie der funktionellen Schicht............... 24
3.2.6 Darstellung der Formalin- und Formalin-Morphin-Versuche 25
3.2.7 Erstellen von 3D-Aktivitätsmustern....................................................... 25
3.3 Funktionelle Analyse ................................................. 25
3.3.1 Datenvorverarbeitung............. 25
3.3.2 Korrelationsanalyse................................................ 26
3.3.3 Clusteranalyse........................ 28
3.4 Gruppenanalyse.......................................................... 28
3.4.1 Binäre Maskenerstellung vom Gehirn ................................................... 28
3.4.2 Alignierung............................ 28
3.4.3 Güteverfahren......................... 31
3.4.3.1 Overlap........................................................... 31
3.4.3.2 Kreuzkorrelation............................................ 32
3.5 Gehirnstruktur spezifischer Zeitprofile...................... 32
4 Ergebnisse .......................................................................... 34
4.1 Statistische Kopplungsgüte........................................ 34
4.2 Aktivitätsvolumen...................................................... 37
4.2.1 Aktivitätsvolumen des Formalin-Versuches.......... 37
4.2.1.1 Aktivitätsvolumen aller Strukturen................................................ 38
4.2.1.2 Aktivitätsvolumina in Funktionsgruppen....... 39
4.2.2 Bewertung der Volumen des Formalin-Morphin-Versuches................. 41
4.2.2.1 Aktivitätsvolumen aller Strukturen................ 42
4.2.2.2 Aktivitätsvolumina in Funktionsgruppen....................................... 43
4.2.3 Zusammenfassung der Volumenanalyse................ 45
4.3 Aktivitätsamplitude.................................................................................... 45
4.3.1 Bewertung der Aktivitätsamplitude....................... 45
4.3.1.1 Erste Antwort................. 46
4.3.1.2 Zweite Antwort.............. 48
4.3.1.3 Dritte Antwort ................................................................................ 50
4.3.2 Zusammenfassung der Aktivitätsamplitude........... 51
5 Diskussion.......................................... 53
6 Literaturverzeichnis............................................................ 56
7 Abkürzungsverzeichnis...................................................... 58
8 Anhang ............................................................................... 59
9 Danksagung........................................ 62
10 Tabellarischer Lebenslauf.................. 631
1 Zusammenfassung
1.1 Hintergrund und Ziele
Die Schmerzforschung besitzt weltweit einen hohen Stellenwert innerhalb der
medizinischen Grundlagenforschung. Hierbei hat aktuell insbesondere die
Erforschung des menschlichen Gehirns mittels nicht-invasiver funktioneller
Bildgebung (fMRT) wegweisende Erkenntnisse für die äußerst wichtige Bedeutung
des zentralen Nervensystems bei der Schmerzverarbeitung erbracht. Für die
Erforschung neuartiger Analgetika sind jedoch Tierexperimente unerlässlich. Hierbei
ist der sog. Formalin-Test einer der am besten untersuchten und am häufigsten
benutzen Methoden. Diesen Schmerztest mittels neuartiger funktioneller Bildgebung
nun am Versuchstier zu untersuchen und dabei Aufschluss über die an der
Schmerzverarbeitung beteiligten Gehirnstrukturen zu erhalten, war
Untersuchungsgegenstand dieser Arbeit. Das Institut für Experimentelle
Pharmakologie und Toxikologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-
Nürnberg bot hierfür mittels etabliertem Kleintier MR-Tomographen geeignete
Bedingungen, um spezifischer und detaillierter als in bisherigen Studien zu
untersuchen, welche Gehirnstrukturen für die Schmerzverarbeitung nach Formalin-
Injektion zuständig sind. Um aufzuzeigen, dass am Versuchstier mittels fMRT auch
analgetische Effekte darstellbar sind, wurde bei einigen Versuchstieren der
Formalintest nach Morphin-Applikation - als analgetischem Goldstandard -
vergleichend untersucht.
Ziel dieser experimentell angelegten Arbeit war die Darstellung der spezifischen
Schmerzantworten und deren Hemmung von 125 Gehirnarealen im Gehirn von
Ratten.
1.2 Versuchstiere, Material und Untersuchungsmethoden
Für diese Studie wurde nach dem Good Laboratory Practice (GLP) gearbeitet. Alle
Versuche wurden an Isofluran-betäubten Wistar-Ratten vorgenommen. Bei den
Formalin-Versuchen wurde 50 µl Formalin in die rechte Pfote subkutan injiziert. Bei
den Formalin-Morphin-Versuchen wurde kurz vorher zusätzlich Morphin, abhängig
vom Gewicht der Ratte, in die Schwanzvene intravenös appliziert. Die Aktivität im
Gehirn der Ratten wurde nicht invasiv mittels funktioneller
Magentresonanztomographie (BOLD-Signal) aufgezeichnet.
1.3 Ergebnisse und Beobachtungen
Unsere Ergebnisse beziehen sich auf das aktivierte Volumen und die
Aktivitätsamplitude, die in den aktivierten Gehirnarealen der Wistar-Ratten
aufgenommen wurden. In beiden Fällen konnte dargelegt werden, dass Formalin in
der Lage ist, im Vergleich zu einer Ruhebedingung spezifische Aktivierungen und
somit Nozizeption zu evozieren. Jedoch waren die Aktivitäten strukturspezifisch
unterschiedlich stark, sodass nicht allen Arealen eine wichtige Bedeutung
zuzuordnen war.
Morphin konnte durch seine analgetische Wirkung eine verzögerte bzw. gehemmte
Reaktion verursachen. Es ließ sich nachweisen, dass die von Formalin stark
aktivierten Areale (Nozizeption) durch Morphin deutlich reduziert wurden
(Analgesie). 2
1.4 Praktische Schlussfolgerung
Mit unseren Ergebnissen konnten wir zeigen, dass Formalin als Schmerzinitiator
große Areale der Schmerzmatrix aktiviert, und Morphin als Schmerzhemmer
zentralnervös und gehirnstrukturspezifisch fungiert. Dabei wurde ersichtlich, welche
Areale eine entscheidende Rolle für die Nozizeption spielen. Es fiel auf, dass in fast
allen Arealen die kontralaterale Seite stärkere Aktivitäten zeigte als die ipsilaterale
Seite.
In den Formalin-Versuchen zeigen der primäre somatosensorische Kortex und das
Zerebellum das größte Aktivitätsvolumen. Durch die Zugabe von Morphin kommt es
hier zu einer starken Hemmung. Das Zerebellum zeigt dabei noch ein
Aktivitätsvolumen, jedoch stark reduziert.
In der Aktivitätsamplitude ist die erste und dritte Antwort nach Formalininjektion
besonders deutlich, die zweite Antwort schwächer detektierbar. Folgende
Hirnstrukturen haben die höchste Aktivitätsamplitude bei den Formalin-Versuchen:
Ncl. parvicellularis reticularis, Ncl. paragigantocellularis lateralis, die Amygdala
ipsilateral und der sekundäre motorische Kortex kontralateral. In den Formalin-
Morphin-Versuchen war die hemmende Wirkung des Morphins eindeutig
detektierbar: in den meisten Strukturen die Aktivitätsamplitude wurde merkbar
reduziert. Erstaunlicherweise zeigen einige Areale unter Morphin einen höheren
Peak als bei den reinen Formalin-Versuchen. Das war der Fall im medialen
Thalamus, im lateroposterioren Ncl. ipsilateral und in der posterioren Gruppe
thalamischer Kerne, in den Habenular Kernen, im cingulären, prelimbischen,
orbitofrontalen und limbischen Kortex und in Teilen des Hypothalamus und der
Basalganglien, besonders in Caudatum Putamen und Ncl. accumbens. Alle diese
Strukturen zeichnen sich durch hohe µ-Rezeptorendichte aus. Es ist plausibel, dass
direkte Bindung des Morphins an diese Rezeptoren eine gewisse Zunahme des
BOLD-Signals hervorgerufen hat, die größer war, als die durch Schmerzhemmung
verursachte Aktivitätsabnahme.3
1 Summary
1.1 Background and objectives
Pain research plays a significant role within the field of basic medical research all
over the world. In particular, the importance of the central nervous system for pain
processing was proven by human brain researches using non-invasive functional
imaging (fMRI). With this method groundbreaking insights in pain processing have
been gained. Animal experiments, however, are inevitable when developing and
researching novel analgetics. In this regard, the so-called formalin-test is the most
suitable and best-known method. The present work aims at investigating this pain
test by means of functional imaging using laboratory animals. Thereby, the cerebral
structures that are involved in pain processing were to be examined. A small animal
MR tomograph provided by the Institute of experimental pharmacology and
toxicology of Friedrich-Alexander University, Erlangen/Nuremberg meets the
criteria for such a specific research. With the help of this tomograph, cerebral
structures responsible for processing pain after formalin injection have been
examined more detailed than in the previous studies. In order to demonstrate that
analgetic effects can be made visible by means of fMRI, some laboratory animals
were comparatively examined by using the formalin test after morphine application –
as the analgetic gold standard.
The present work aims at demonstration of specific pain responses and their
inhibition from 125 areas in the brain of rats.
1.2 Laboratory animals, material and research methods
This study is committed to Good Laboratory Practice (GLP). Experiments were
conducted using only wistar rats that had been anesthetized with isoflurane. In case
of the formalin tests 50µl of formalin were injected subcutaneously in the right paw.
For the formalin-morphine-experiments morphine had been applied intravenously
into the tail vein of the rat, depending on its weight, prior to the formalin injection.
The brain activity of the rats was measured with non-invasive fMRI (BOLD-signal).
1.3 Results
Our results refer to the activated volume and activity amplitude in different cerebral
structures of the wistar rats. In contrast to a resting condition, the capability of
formalin to evoke specific activation and consequently nociception was
demonstrated. However, due to varying amplitude of structure specific activity,
certain areas could be considered more important than others.
Due to its analgetic effect, morphine caused a delayed and/or inhibited reaction to
formalin. It was proven that the areas strongly activated by formalin (nociception)
were reduced by morphine (analgesia).
1.4 Practical Conclusion
Our results showed extended activation of the brain pain matrix by formalin and
cerebral-structure-specific action of morphine, as pain inhibitor. Besides, the areas
that play a determining role for nociception became obvious. It was noticed that the
activities on the contralateral side were more distinct than on the ipsilateral side in
almost every area. 4
During the formalin tests the primary somatosensory cortex and cerebellum showed
the largest activated volume. Due to the addition of morphine, strong inhibition was
being observed. Although activity volume could be still detected in the cerebellum,
its level was much lower.
After injecting formalin, the first and third responses were clearly detectable in the
BOLD signal amplitude. The second response was weaker. Following structures
showed the highest activity amplitudes: ncl. parvicellularis reticularis, ncl.
paragigantocellularis lateralis, amygdala ipsialteral and the secondary motor cortex
contralateral. Concerning the formalin-morphine-experiments, the inhibitory effect of
morphine could be detected: in the most of the structures activity amplitude was
considerably decreased. However, some areas reached a higher peak under morphine
than under formalin only. This was the case in the medial thalamus, in the
lateroposterior ncl. ipsilateral and posterior thalamic nuclear group, in the habenular
nuclei, in the cingulate, prelimbic, orbitofrontal and limbic cortices and in the parts
of hypothalamus and basal ganglia, especially caudate putamen and ncl. accumbens.
All these structures possess high density of µ-receptors. Probably, direct action of
morphin on these receptors leads to a certain increase of the BOLD signal, which
exceeds the reduction of activity in these brain structures of the pain matrix. 5
2 Einleitung
In den letzten Jahren stieg die Forschung an nicht-invasiver Schmerzdarstellung an
Tieren sehr stark an. Dabei bediente man sich der Hilfe der funktionellen
Magnetresonanztomographen, um die explizite Darstellung der Schmerzmatrix zu
gewährleisten. Dort wurden die schmerzspezifischen Areale z.B. mittels Formalin
dargestellt. Die Stimulationen dieser Areale wurden aufgezeichnet und als deren
Aktivität wiedergegeben. Entscheidend war nicht nur, in welchen Arealen eine
Stimulation registriert, sondern auch zu welchem Zeitpunkt sie noch nachgewiesen
werden kann.
Somit soll diese Studie zum einen zeigen, inwieweit eine Gehirnstruktur unter einer
spezifischen Schmerzstimulation (hier: Formalininjektion plantar) beeinflusst wird
und zum anderen, in welcher Zeitphase eine Aktivität aufgenommen wird.
Zusätzlich soll die analgetische Wirkung des Morphins auf die vom Formalin
induzierten Arealen analysiert werden. Dass das Morphin eine hemmende Wirkung
besitzt, ist bereits erforscht, aber inwieweit das Morphin spezifisch auf bestimmte
stimulierte Areale wirkt, soll auch Teil dieser Studie werden.
2.1 Allgemeine Beschreibung von Magnetresonanztomografie (MRT)
Magnetresonanztomografie oder Kernspintomografie (Tomografie
„Schnitt“, „abgeschnittenes Stück“, und
ein nichtinvasives bildgebendes Verfahren zur Darstellung von Strukturen im
Inneren des Körpers, vor allem nicht-knöcherner Strukturen, wie zum Beispiel
Weichteile, Organe, Gewebe, Gehirn und Gelenkknorpel. Durch Schnittbilder durch
ein Individuum können schon geringfügige Veränderungen im Körper,
beispielsweise kleine Entzündungsherde, auf diese Weise entdeckt werden. Die
Magnetresonanztomografie nutzt im Gegensatz zur Computertomografie zeitliche
Änderungen lokaler Magnetfelder und verwendet keine Röntgenstrahlen bzw.
radiologische Strahlen.
Das Prinzip der MRT beruht auf der Tatsache, dass Atomkerne mit ungerader
Kernladungszahl ein magnetisches Moment besitzen. Diese magnetischen Momente
werden durch ein starkes externes Magnetfeld parallel oder anti-parallel zu diesem
ausgerichtet. Durch Anregung mittels Radiowellen kann raumspezifisch das
magnetische Moment beeinflusst werden. Nach Ausschalten der Radiowellen
schwingen die angeregten Momente in den vom äußeren Magnetfeld vorgegebenen
Raum zurück. Dieses Zurückklappen kann mit Spulen aufgenommen werden und
erlaubt das Erzeugen von Bildinformationen.
In der medizinischen Kernspintomografie werden primär die Protonen des
Wasserstoffs genommen, weil es das häufigste Element im menschlichen Körper und
demzufolge für die Magnetresonanz das empfindlichste Element ist. Das
magnetische Moment der Wasserstoffatome ist normalerweise ungeordnet. Im
Kernspintomographen befindet sich ein sehr starkes Magnetfeld, das alle
Wasserstoff-Protonen längs zum Magnetfeld ausrichtet (Längsmagnetisierung). Die
Atome befinden sich in einem ausgerichteten Zustand. Mit Hilfe von Radiowellen
können sie aus ihrer aufgezwungenen Position ausgelenkt werden und sind
gleichzeitig in ihrer Kreiselbewegung synchronisiert, im Extremfall ist die
Kreiselbewegung nun quer zum Magnetfeld, die Folge ist eine so genannte
Quermagnetisierung. Schaltet man die Radiowellen wieder aus, so springen die
Atome wieder in die Richtung zurück, die ihnen von dem starken Magnetfeld
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