Development and experimental validation of a protein design software [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Martin Tillmann Stiebritz

DevelopmentandexperimentalvalidationofaproteindesignsoftwareDerNaturwissenschaftlichenFakultätderFriedrich-Alexander-UniversitätErlangen-NürnbergzurErlangungdesDoktorgradesvorgelegtvonMartinTillmannStiebritzausNürnbergAlsDissertationgenehmigtvonderNaturwissenschaftlichenFakultätderUniversitätErlangen-NürnbergTagdermündlichenPrüfung: 30.Juli2008VorsitzenderderPromotionskommission: Prof.Dr.EberhardBänschErstberichterstatter: Prof.Dr.YvesMullerZweitber: Prof.Dr.HeinrichStichtMeinenliebenElterngewidmet“Now we’ve taken this theory one stage fur-ther.Ifweincreasethesizeofthepenguinun-til it is the same height as the man and thencompare the relative brain sizes, we now findthat the penguin’s brain is still smaller. But,andthisisthepoint,itislargerthanitwas.”PROF. KEN ROSEWALLIVIchdankeProf. Yves Muller für die Vergabe dieses interessanten Themas und die gute und effektive Zusam-menarbeitbeiderProgrammierungvonMUMBO.BesondersmöchteichmichauchfürseineGeduldunddasmirentgegengebrachteVertrauenbedanken.Prof. Heinrich Sticht vom Institut für Biochemie der Universität Erlangen für viele wertvolleAnregungen bei der Implementierung des Kraftfeldes und für die freundliche Übernahme desZweitgutachtens.Prof.FranzX.SchmidvomLaboratoriumfürBiochemiederUniversitätBayreuthfürdieGelegen-heitCD-SpektrenundthermischeAuffaltungenderTetR-VarianteninseinerArbeitsgruppemessenzu können.
Publié le : mardi 1 janvier 2008
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Source : WWW.OPUS.UB.UNI-ERLANGEN.DE/OPUS/VOLLTEXTE/2008/1060/PDF/STIEBRITZ_DISS.PDF
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Developmentandexperimentalvalidation
ofaproteindesignsoftware
DerNaturwissenschaftlichenFakultät
derFriedrich-Alexander-UniversitätErlangen-Nürnberg
zur
ErlangungdesDoktorgrades
vorgelegtvon
MartinTillmannStiebritz
ausNürnbergAlsDissertationgenehmigtvonderNaturwissenschaftlichenFakultät
der
UniversitätErlangen-Nürnberg
TagdermündlichenPrüfung: 30.Juli2008
VorsitzenderderPromotionskommission: Prof.Dr.EberhardBänsch
Erstberichterstatter: Prof.Dr.YvesMuller
Zweitber: Prof.Dr.HeinrichStichtMeinenliebenElterngewidmet
“Now we’ve taken this theory one stage fur-
ther.Ifweincreasethesizeofthepenguinun-
til it is the same height as the man and then
compare the relative brain sizes, we now find
that the penguin’s brain is still smaller. But,
andthisisthepoint,itislargerthanitwas.”
PROF. KEN ROSEWALLIVIchdanke
Prof. Yves Muller für die Vergabe dieses interessanten Themas und die gute und effektive Zusam-
menarbeitbeiderProgrammierungvonMUMBO.BesondersmöchteichmichauchfürseineGeduld
unddasmirentgegengebrachteVertrauenbedanken.
Prof. Heinrich Sticht vom Institut für Biochemie der Universität Erlangen für viele wertvolle
Anregungen bei der Implementierung des Kraftfeldes und für die freundliche Übernahme des
Zweitgutachtens.
Prof.FranzX.SchmidvomLaboratoriumfürBiochemiederUniversitätBayreuthfürdieGelegen-
heitCD-SpektrenundthermischeAuffaltungenderTetR-VarianteninseinerArbeitsgruppemessen
zu können. Besonderer Dank dabei an Barbara Eckert und Roman Jakob für die freundliche und
geduldigeAnleitungundtatkräftigeUnterstützung.
Prof. Kay Diederichs von der Arbeitsgruppe Molekulare Bioinformatik der Universität Konstanz
fürdieParallelisierungdesBRUT-ProgrammteilsmitOpenMP.
BesondererDankgiltallen,dieandenhiervorgestelltenProjektenbeteiligtwaren:
StefanieWengrzikfürdieArbeitamRedesignvonTetRunddasinMUMBOinvestierteVertrauen.
Anna Srebrzynski für die gute Zusammenarbeit bei der Aufreinigung, Kristallisation und Daten-
sammlungderTetR-Varianten.
KathrinMeinhardtfürdieMitwirkunganderTetR-Mutagenese.
JanPaulRichterfürdieMitarbeitbeiderVerfeinerungderTetR-Kristallstrukturen.
SigridWeilerfürdieHilfebeiderKlonierungdiverserTetR-KonstrukteundbesondersfürdieFort-
führungdesTetR-Projektes.
Madhumati Sevvana für die Unterstützung bei der Datensammlung der TetR-Varianten, die Hilfe
beiderVerfeinerungunddiegeduldigeBeantwortungallermeinerFragenzurKristallographie.
CorneliusWimmervomLehrstuhlfürMikrobiologiederUniversitätErlangenfürdieDurchführung
derinvivoAktivitätstests.
AndreaThornfürdieHilfebeiderValidierungdesProgrammsfürdenModellbau.
ChristofJägerfürdieValidierungdesProgrammsimBereichdesDockings.
Jetzt bleibt mir noch, mich bei allen Kolleginnen und Kollegen des Lehrstuhls für Biotechnik für
dieeinzigartigeAtmosphärezubedanken.EswareineschöneZeitmitEuch!VIZusammenfassung
Rechnergestütztes Protein-Design hat das Ziel, Aminosäuresequenzen vorherzusagen, die eine
vorgegebene dreidimensionale Struktur annehmen und eine definierte Funktion erfüllen – mit der
Perspektive maßgeschneiderte Proteine mit neuen Eigenschaften zu entwerfen. Die Realisierung
dieser anspruchsvollen Aufgabe bietet außerdem Gelegenheit, Modellvorstellungen über Architek-
tur,FaltungundDynamikvonProteinenzuprüfen.
Die vorliegende Arbeit handelt von der Entwicklung eines Computer-Programms für die Anwen-
dungimrechnergestütztenDesignvonProteinen,MUMBO,unddessenexperimentellerValidierung.
GegenwärtigermöglichtdieSoftwaredieDurchführungvonProtein-Design-RechnungenunterAn-
nahme eines fixierten Proteingerüstes. Seitenkettenkonformationen werden angenähert unter Ver-
wendung von Rotamer-Bibliotheken. Um die Berechnung von Wechselwirkungsenergien zu ge-
statten, wurde ein Kraftfeld implementiert, das nicht-kovalente Wwirkungen mit gängigen
molekularmechanischen Ansätzen beschreibt. Je nach der Größe des betrachteten Problems, wird
die optimale Kombination von Aminosäuren und deren Seitenkettenkonformationen mit exakten
Algorithmen bestimmt, die auf dem dead-end elimination-Theorem beruhen oder es wird eine
Näherunglösung mit Hilfe eines Metropolis-Monte-Carlo/Simulated-Annealing-Ansatzes ermittelt.
Die Effizienz der implementierten Algorithmen und die Güte des Kraftfeldeswurde durch Berech-
nungderSeitenkettenorientierungeninveröffentlichtenKristallstrukturenüberprüft.
AufbauendaufdieserVorarbeitwirdeinneuesAnwendungsgebietfürProtein-Design-Algorithmen
in der Kristallographie vorgestellt. Durch eine Erweiterung des Kraftfeldes um eine Röntgen-
Pseudo-Energie, die aus experimentellen Elektronendichtedaten berechnet wird, wird MUMBO be-
fähigt, Seitenketten während der Verfeinerung von Kristallstrukturen korrekt zu platzieren, was an
einigenBeispielenverdeutlichtwird.FürdieseAufgabeerzieltedasProgrammspeziellbeiniedriger
kristallographischerAuflösungbessereResultatealsetablierteSoftware-Pakete.
Weiterhin wird die Eignung des Programms für das Redesign der Spezifität von Protein-
Protein-Wechselwirkungen diskutiert. Ausgehend von der Struktur des homodimeren Tetrazyklin-
Repressors (TetR) sollten durch Mutagenese von Positionen in der Dimerisierungsfläche zwei un-
terschiedlicheProteinkettenerzeugtwerden,diespezifischHeterodimereausbildenabernichtmehr
zur Homodimerisierung neigen. Ersteres sollte durch stabilisierende (positives Design) und letz-
teres entsprechend durch destabilisierende Wechselwirkungen (negatives Design) erreicht werden.
Das erfolgreiche Design stabiler, biologisch aktiver heterodimerer Repressoren mit definierter Ter-
tiärstruktur konnte durch eine Reihe unterschiedlicher Experimente belegt werden. Eine Diskrimi-
nierungderBildunghomodimererKomplexewurdejedochnichtvollständigerreicht.Entsprechend
der Zielsetzung konnte für eines der Homodimere nur eine marginale biologische Aktivität
nachgewiesen werden. Die andere Variante erwies sich dagegen als aktiver Repressor, wobei
allerdings eine reduzierte thermische Stabilität festgestellt wurde. Auch für zwei weitere Vari-
anten wurde der gewünschte Effekt nicht beobachtet. Mittels Röntgenstrukturanalyse konnten
geringfügige Anpassungen der Hauptkette zur Vermeidung der vorgesehenen destabilisierenden
Wechselwirkungen als Ursache für die ungewünschte Homodimerisierung ermittelt werden. Dies
zeigt,dassdieBerücksichtigungeinesflexiblenProteinrückgratesinsbesonderefürdieBerechnung
instabilerKonfigurationenvonBedeutungseinkann.Abstract
Computational protein design – understood as the prediction of an amino acid sequence that will
adopt a given 3-dimensional structure associated with a desired function – offers the promising
perspective of tailoring proteins according to special needs. From a more fundamental point of
view,itimprovesourunderstandingofproteinarchitecture,foldinganddynamics.
Here, the development and experimental validation of a protein design software – MUMBO – is
described. The current implementation allows for fixed-backbone protein design and approximates
thesidechainconformationalspacebymakinguseofrotamerlibraries.Interactionenergiesarecal-
culated based on a force field that covers non-bonded interactions usually considered in molecular
mechanics. Depending on the problem size the global minimum energy conformation (GMEC) is
determined by algorithms that are based on the dead-end elimination (DEE) theorem or approxi-
mated by a Metropolis Monte Carlo simulated annealing approach. The efficiency of the optimi-
sation algorithms and the accuracy of the force field were shown by recalculating the side chain
packingobservedinpublishedcrystalstructures.
As a new area of application, it is demonstrated that protein design algorithms can effectively be
used for crystallographic model-building and refinement. This is achieved by introducing a X-ray
pseudo-energy to the force field derived from electron density data. As verified for a number of
test-cases the program is able to identify the correct side chain orientations during the refinement
process. For this task it could be shown that MUMBO performs better than established software,
especiallyatlowresolution.
Furthermore, the application of the program for redesigning the specificity of protein-protein in-
teractions is presented. By mutating interface positions of homodimeric tetracycline repressor
(TetR) two nonidentical types of protein chains were obtained that should have formed specifi-
cally heterodimers as facilitated by positive design. At the same time, negative design should have
impeded homodimerisation. A series of experiments is presented showing the success of the posi-
tivedesignstrategy.Theheterodimersformedstable,biologicalactiveandstructurallywelldefined
repressors. Discrimination against homodimerisation however, was incomplete. As intended, one
homodimer proved to be highly impeded, whereas the other homodimer showed full biological ac-
tivity,thoughdiminishedthermicstabilitycomparedtotheheterodimer.Noimprovementcouldbe
observed for two additional chain variants. Structural studies by means of X-ray crystallography
suggestthatthisobservationcanbeexplainedbysmallbutdiscreteevasionmovementsofthemain
chain from predicted unfavourable steric clashes. This demonstrates the necessity to account for
backboneflexibilityespeciallyforthedesignofnon-nativegeometries.Contents
1 Introduction 3
1.1 Anoutlineoftheproteindesignproblem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 Applicationsforcomputationalproteindesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2 MaterialsandMethods 7
2.1 Softwaredevelopment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2 Reproducingthepackingofsidechainsinrefinedcrystalstructures . . . . . . . . . 7
2.3 Crystallographicrebuildingandrefinement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.4 Sitedirectedmutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.5 Overexpressionandcelllysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.6 Chromatographicmethods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.6.1 Affinitychromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.6.2 Cationexchangechromatography . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.6.3 Anioney . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.6.4 Sizeexclusiony . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.6.5 Desalting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.7 Circulardichroismspectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.8 Thermaldenaturationstudies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.9 Crystallisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.10 Datacollection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.11 Structuredeterminationandrefinement. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.12 Modelanalysisandcomparisons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3 Theoreticalbackgroundandsoftwarelayout 13
3.1 Basicstepsincomputationalproteindesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
3.2 Modellingsidechaindiversity:Rotamerlibraries . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.3 ForceField . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3.3.1 ElectrostaticInteractions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.3.2 VanderWaals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3.3.3 Solvationfreeenergy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
3.3.4 Hydrogenbonding . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.3.5 Pseudo-energyderivedfromrotamerprobability . . . . . . . . . . . . . . 24
3.3.6 Xraypseudo-energy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.3.7 ForceFieldparameters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.4 Exactoptimisationtechniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.4.1 Thedead-endeliminationtheorem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.4.2 Goldstein’sgeneralisationofthedead-endeliminationtheorem . . . . . . . 25
3.4.3 Dead-endeliminationforpairsofrotamers . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1Contents
3.4.4 Dead-endeliminationbasedonconformationalsplitting . . . . . . . . . . 27
3.4.5 Explicitsolutionofthecombinatorialproblem . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.5 Approximateoptimisationtechniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.5.1 MetropolisMonteCarlooptimisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.5.2Carlosimulatedannealingoptimisation . . . . . . . . . 30
3.5.3 Eliminationofhigh-energyrotamers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.6 TheMUMBOprogram . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
4 Basicvalidationoftheprogram 35
4.1 Elimination efficiency of the side chain optimisation algorithms implemented in
MUMBO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
4.2 Precisionofsidechainpositioning . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5 Crystallographicmodel-buildingandrefinementwithMUMBO 45
5.1 MakingMUMBOseetheelectrondensity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
5.2 Validationofthemodel-buildingapproach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.3 Importanceoftheforcefieldformodel-buildingaccuracy . . . . . . . . . . . . . . 47
5.4 Identifyingthecorrectsequenceregistrationduringmodelbuilding . . . . . . . . . 50
5.5 ComparisonofMUMBOwithothercrystallographicsoftwarepackages . . . . . . . 50
5.6 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
6 Redesigningspecificityofprotein-proteininteractions 55
6.1 Thetetracyclinerepressor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
6.2 RedesigningthedimerisationinterfaceofTetR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
6.3 Experimentalverificationofthecomputationaldesign . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.3.1 MutagenesisofwildtypeTetR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.3.2 Functionalstudiesbyaninvivoactivityassay . . . . . . . . . . . . . . . . 62
6.3.3 IsolationandpurificationofheterodimericTetRvariants . . . . . . . . . . 64
6.3.4andofhomodimericTetRv . . . . . . . . . . 67
6.3.5 Thermicstabilitystudies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
6.3.6 Structuralstudies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
6.4 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
A MUMBOkeywords 103
B Listofabbreviations 109
2

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