Development of innovative bioassay principles for pharmaceutical quality control [Elektronische Ressource] = Entwicklung innovativer Bioassayprinzipien für die pharmazeutische Qualitätskontrolle / vorgelegt von Cornelia Andrea Zumpe

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DEVELOPMENT OF INNOVATIVE BIOASSAY PRINCIPLES FOR PHARMACEUTICAL QUALITY CONTROL - ENTWICKLUNG INNOVATIVER BIOASSAYPRINZIPIEN FÜR DIE PHARMAZEUTISCHE QUALITÄTSKONTROLLE Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Cornelia Andrea Zumpe aus Nürnberg Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 26. November 2010 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink Erstberichterstatter: Prof. Dr. Monika Pischetsrieder Zweitberichterstatter: PD Dr. Dr. Veit J. Erpenbeck Danksagung Die vorliegende Arbeit entstand unter der Anleitung von Prof. Dr. Monika Pischetsrieder am Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg. Die Arbeit wurde überwiegend bei der Firma Merck Serono in Darmstadt durchgeführt. Zuerst möchte ich mich bei Prof. Dr. Monika Pischetsrieder für die Bereitschaft, meine Betreuung seitens der Universität zu übernehmen, bedanken. Ich danke ihr für ihre Unterstützung und hilfreichen Vorschläge. Mein besonderer Dank geht an Dr. Christiane Bachmann und Dr. Nicole Wiedemann für die fachlich kompetente Betreuung dieser Arbeit mit zahlreichen Anregungen und interessanten Diskussionen.
Publié le : vendredi 1 janvier 2010
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DEVELOPMENT OF INNOVATIVE BIOASSAY PRINCIPLES FOR
PHARMACEUTICAL QUALITY CONTROL
-
ENTWICKLUNG INNOVATIVER BIOASSAYPRINZIPIEN FÜR DIE
PHARMAZEUTISCHE QUALITÄTSKONTROLLE




Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.





vorgelegt von
Cornelia Andrea Zumpe
aus Nürnberg



Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg



























Tag der mündlichen Prüfung: 26. November 2010
Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatter: Prof. Dr. Monika Pischetsrieder
Zweitberichterstatter: PD Dr. Dr. Veit J. Erpenbeck


Danksagung
Die vorliegende Arbeit entstand unter der Anleitung von Prof. Dr. Monika Pischetsrieder am Institut
für Pharmazie und Lebensmittelchemie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen Nürnberg.
Die Arbeit wurde überwiegend bei der Firma Merck Serono in Darmstadt durchgeführt.

Zuerst möchte ich mich bei Prof. Dr. Monika Pischetsrieder für die Bereitschaft, meine Betreuung
seitens der Universität zu übernehmen, bedanken. Ich danke ihr für ihre Unterstützung und
hilfreichen Vorschläge.

Mein besonderer Dank geht an Dr. Christiane Bachmann und Dr. Nicole Wiedemann für die
fachlich kompetente Betreuung dieser Arbeit mit zahlreichen Anregungen und interessanten
Diskussionen. Vielen Dank für die Bereitstellung des spannenden Themas sowie ihr stetiges
Engagement, das erheblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.

PD Dr. Dr. Veit J. Erpenbeck möchte ich für die Übernahme des Zweitguachtens, sowie seine
interessanten Anregungen danken.

Prof. Dr. Kreis und Prof. Dr. Fromm danke ich für die Bereitschaft, mich in meiner
Promotionsprüfung zu prüfen.

Vielen Dank auch an Dr. Katrin Engel für ihre hilfreichen Ratschläge und stetige
Diskussionsbereitschaft.

Allen aktuellen und ehemaligen Doktoranden von Merck Serono, insbesondere Thomas Lange,
Annette Eppler, Kathrin Ziegler und Maria Leonor Alvarenga danke ich für die gute
Arbeitsatmosphäre und den Spaß bei der Arbeit.

Bei den Mitarbeitern von ADB5, Claudia Fischer, Anke Breuer, Jasmin Oestreicher und Simone
Hartl möchte ich mich für die Einarbeitung in die Zellkultur sowie die Pflege meiner Zellen während
meiner Abwesenheit bedanken.

Herzlichen Dank auch an die Laboratorien von Dr. Ralph Lindemann und Dr. Heike Dahmen für die
Möglichkeit, ihr Odyssey Infrared Imaging System und ihr FACScan Flow Cytometer benutzen zu
dürfen. Bei Melanie Daniel und Doreen Zickler möchte ich mich für die Einweisung in die Geräte
bedanken.

Desweiteren danke ich Enrico Tucci (National Institute of Statistics, Rome, Italy) für die statistische
Auswertung meiner Daten, sowie Francesco Antonetti und Beatrice Brunkhorst (beide Merck
Serono) für das Korrekturlesen meiner Artikel.



Danken möchte ich auch der Firma Merck Serono für die Finanzierung meiner Arbeit sowie der
Bereitstellung eines Arbeitsplatzes und der erforderlichen Arbeitsmittel.

Zum Schluss möchte ich mich ganz besonders herzlich bei meinen Eltern für die finanzielle und
moralische Unterstützung meines bisherigen Lebensweges bedanken. Danke für ihre Geduld, ihr
Vertrauen und ihren Rückhalt in allen Lebenssituationen.


TABLE OF CONTENTS

LIST OF ABBREVIATIONS ..................................................................................................................10
LIST OF PUBLICATIONS .....................14
I. INTRODUCTION .......................................................................................................... 15
1. OVERVIEW OF THE IMMUNE SYSTEM ..............................................................................................15
1.1. Innate immunity .................................................15
1.2. Adaptive immunity ............................................................................16
1.2.1. Lymphocytes ............... 16
1.2.1.1. B Lymphocytes ..................................... 16
1.2.1.2. T Lymphocytes ...................................................................... 17
1.2.2. APCs ........................................................................................... 18
1.4. Cytokines ................................18
1.4.1. General information ..................................... 18
1.4.2. Classification and features of cytokines ...................................... 19
2. INTERLEUKIN-7, ITS SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAYS AND APPLICATION IN IMMUNOTHERAPY .......21
2.1. IL-7 ......................................................................................................21
2.2. IL-7R ...................................22
2.3. IL-7 Signal transduction pathways ..................................................................................23
2.3.1. JAK/STAT pathway ..................................... 25
2.3.2. PI3K/AKT pathway ...................................................................... 26
2.3.3. Ras/Raf/ERK pathway . 27
2.3.4. SFK pathway ............................................... 27
2.4. IL-7 and cell cycle .............................................................................28
2.5. Lymphotrophic effects of IL-7 .........................28
2.5.1. Induction of anti-apoptotic factors ............... 28
2.5.2. Suppression of pro-apoptotic proteins......................................................................... 29
2.5.3. Regulation of metabolism: glucose ............. 29
2.5.4. Regulation of metabolism: pH ..................................................................................... 30
2.6. IL-7 in immunotherapy ......................................................................................................30
3. QUALITY CONTROL OF BIOPHARMACEUTICALS ...............32
3.1. General remarks about quality control ...........32
3.2. Criterions for quality control of biopharmaceuticals ....................................................32
3.2.1. Physicochemical properties ......................................................... 32
3.2.2. Biological activity ......................................................................................................... 33
3.2.3. Immunochemical properties ........................................................ 33
3.2.4. Purity, impurities and contaminants ............ 33
3.2.5. Quantity ....................................................................................... 34
3.3. Biological assays ..............................................34


3.3.1. Assay formats and requirements for use in QC .......................................................... 34
3.3.1.1. Overview of assay formats ................................................... 34
3.3.1.2. Requirements for use in QC ................. 35
3.3.2. Analysis models for potency assays ........................................... 36
3.3.2.1. The parallel line model .......................................................................................... 36
3.3.2.2. Logistic models (4-and 5-parameter fit) ................................ 37
3.3.3. Read-out system for proliferation assays .................................... 38
3.3.3.1. Colorimetric detection ........................................................... 38
3.3.3.2. Fluorescence ........................................ 39
3.3.3.3. Luminescence ....................................................................... 40
3.4. Investigated biopharmaceuticals ....................................................40
3.4.1. Cetuximab (Erbitux®) .................................. 40
3.4.2. Tucotuzumab celmoleukin (KS-IL2) ............................................ 41
3.4.3. Fc-IL7 .......................................................................................... 41
II. AIM OF THIS STUDY ................................................................................................... 42
III. MATERIALS AND METHODS .................................................................................... 43
1. MATERIALS ..................................................................................................................................43
1.1. Cell lines ............................43
1.2. Investigated biopharmaceuticals ....................................................................................44
1.2.1. Cetuximab (Erbitux®) .................................................................................................. 44
1.2.2. Tucotuzumab celmoleukin (KS-IL2) ............ 44
1.2.3. Fc-IL7 .......................................................... 44
1.3. Antibodies ................................................................44
1.3.1. Primary antibodies ....................................... 44
1.3.1. Secondary antibodies .. 45
1.4. Controls .............................................................................................................................45
1.4.1. Cell control extracts ..................................... 45
1.4.2. Isotype controls ........................................................................... 46
1.5. Culture medium, reagents and chemicals ......46
1.6. Composition of buffer & reagent solutions ....................................47
1.7. Equipment ..........................................................................................................................48
1.8. Plastic ware and other materials .....................49
1.9. Software .............................49
2. METHODS ....................................................................................................................................50
2.1. Cell culture .........................................................................................................................50
2.1.1. CTLL-2 cells ................ 50
2.1.2. DiFi cells ...................... 50
2.1.3. Kit 225 cells ................................................................................................................. 50
2.1.4. PB-1 cells .................... 50


2.1.5. 2E8 cells ...................................................................................................................... 50
2.2. Determination of the cell density ....................50
2.3. Thawing of cells ................51
2.4. Potency assays (colorimetric proliferation assays) ......................................................51
2.4.1. Principles ..................................................................................... 51
2.4.1.1. CTLL-2 potency assay .......................... 51
2.4.1.2. DiFi potency assay................................................................................................ 51
2.4.2.1. Kit 225 potency assay ........................... 51
2.4.2. Protocols ...................................................................................................................... 52
2.4.2.1. CTLL-2 potency assay .......................... 52
2.4.2.2. DiFi potency assay................................ 52
2.4.2.3. Kit 225 potency assay ........................................................................................... 53
2.4.3. Data evaluation: comparison of different analysis models .......................................... 53
2.4.4. Adaption of assay parameters to luminescence and fluorescence techniques .......... 54
2.5. STAT5 phosphorylation assay ........................................................................................55
2.5.1. Principle ....................................................... 55
2.5.2. Protocol 55
2.6. Western blotting analysis.................................................................................................56
2.5.1. Principle ....................................................... 56
2.5.2. Protocol 56
2.7. Inhibition with WP1066 .....................................................................................................57
2.7.1. Principle ....................................................... 57
2.7.2. Protocol ................................................................ 57
2.8. Flow cytometric analysis .................................57
2.8.1. Principle ....................................................... 57
2.8.2. Protocol ................................................................ 57
IV. RESULTS AND DISCUSSION.................................................................................... 58
1. COMPARISON OF DIFFERENT ANALYSIS MODELS (PARALLEL LINE, 4-AND 5-PARAMETER FIT) FOR
POTENCY ASSAYS ............................................................................................................................58
1.1. CTLL-2 potency assay ......................................58
1.1.1. Concentration ranges .. 58
1.1.2. Test on the necessity of “weighting” ............................................ 60
1.1.3. Results ......................................................................................... 63
1.2. DiFi potency assay ............69
1.2.1. Concentration ranges .................................................................. 69
1.2.2. Test on the necessity of “weighting” ............................................ 70
1.2.3. Results ......................................................................................... 73
1.3. Combined discussion of CTLL-2 and DiFi potency assays results .............................78
1.4. Summary and Conclusions ..............................................................82


2. COMPARISON OF DIFFERENT PROLIFERATION ASSAYS (COLORIMETRIC, LUMINESCENCE AND
FLUORESCENCE READ-OUTS) ............................................................................................................84
2.1. Method development ........84
2.2. Results ...............................................................................................................................85
2.2.2. CTLL-2 potency assay................................. 85
2.2.3. DiFi potency assay ...... 91
2.2.4. Kit 225 potency assay ................................................................. 94
2.3. Combined discussion of CTLL-2, DiFi and Kit 225 assay results ................................99
2.4. Conclusions .....................................................................................................................101
3. CHARACTERIZATION OF THE IL-7 SIGNAL TRANSDUCTION PATHWAYS AND SELECTION OF AN
APPROPRIATE TARGET FOR DEVELOPMENT OF AN INTRACELLULAR PHOSPHORYLATION ASSAY ..........102
3.1. Results and Discussion of flow cytometric analyses .................................................103
3.2. Results and Discussion of western blotting analyses ................106
3.2.1. Representative targets of the JAK/STAT pathway: STAT1, STAT3, STAT5, pim-1 and
bcl-2 ..................................................................................................................................... 106
3.2.1.1. STAT1 and STAT3.............................. 106
3.2.1.2. STAT5 ................................................................................................................. 108
3.2.1.3. Inhibition of STAT5 by WP1066 .......... 109
3.2.1.4. Pim-1 ................... 111
3.2.1.5. Bcl-2 .................................................................................................................... 112
3.2.2. Representative target of the PI3K/AKT pathway: AKT .............. 114
3.2.3. Representative targets of the ERK pathway: ERK and Bim...................................... 115
3.2.3.1. ERK ..................................................................................................................... 115
3.2.3.2. Bim ...................... 117
3.2.4. Representative target of the SFK pathway: Lck ........................ 118
3.2.5. Representative target of the p38 MAPK stress pathway: p38 MAPK ....................... 120
3.3. Summary and Conclusions ............................................................................................121
4. DEVELOPMENT OF A STAT5 PHOSPHORYLATION ASSAY AS AN ALTERNATIVE TO THE CLASSICAL
PROLIFERATION ASSAYS .................................................................................................................124
4.1. Assay development and optimization ...........124
4.2. Assay qualification .........133
4.3. Comparison of the STAT5 phosphorylation assay to the proliferation assay .........134
4.4. Conclusions .....................................................................................................................134
V. OVERALL CONCLUSIONS AND OUTLOOK............................................................ 136
LIST OF FIGURES ...........................................................................................................................138
LIST OF TABLES .............................141
REFERENCES .................................142
APPENDIX: .....................................................................................................156
STATISTICAL ANALYSIS OF BIOASSAY RESULTS: A COMPARISON BETWEEN DIFFERENT CALCULATION
MODELS .........................................156


1. Objective .............................................................................................................................157
2. Definitions ...........................157
3. Statistical Method ..............................................................................................................157
4. Statistical evaluation .........158
4.1. Results of the analyses by Model ................. 158
4.1.1. CTLL-2 potency assay ........................................................................................... 158
4.1.2. DiFi potency assay................................. 161
4.1.3. Conclusions ........................................................................... 163
4.2. Results of the analyses by Concentration .... 166
4.2.1. CTLL-2 potency assay ........................................................................................... 166
4.2.2. DiFi potency assay................................. 168
4.2.3. Conclusions ........................................................................... 171
4.3. Results of the analyses by Range ................................................ 171
4.3.1. CTLL-2 potency assay ........................................................... 171
4.3.2. DiFi potency assay................................................................. 174
4.3.3 Conclusions ............................................ 176
5. Analysis on failure rates....177
5.1 CTLL-2 potency assay................................................................... 178
5.2 DiFi potency assay ........................................ 179
5.3 Conclusions ................................................................................... 180
ABSTRACT .....................................................................................................181
ZUSAMMENFASSUNG ......................................................182
CURRICULUM VITAE .......................................................................................184



LIST OF ABBREVIATIONS

4PL Four-parameter fit
5PL Five-parameter fit
ADCC Antibody-dependent cellular cytotoxicity
ADP Adenosine di-phosphate
AIT adoptive immunotherapy
AML Acute myeloid leukemia
ANOVA ANalysis Of VAriance
AP Activator protein
APC Antigen-presenting cell
API Active pharmaceutical ingredient
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosine triphosphate
BCP-ALL B cell precursor acute lymphoblastic leukemia
BCR B cell receptor
BSA Bovine serum albumin
CD Cluster of Differentiation
CDK Cyclin dependent kinase
CHK Checkpoint kinase
CKI Cyclin dependent cell cycle inhibitor
CLP Common lymphoid progenitor
CRC Colorectal cancer
C test Cochran‟s test
CTL Cytotoxic T lymphocytes
CV Coefficient of variation
DC Dendritic cells
DMSO dimethyl sulfoxide
DNA Desoxy-ribonucleic acid
DPBS Dulbecco‟s Phosphate-Buffered Saline
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
DSMZ
(German collection of microorganisms and cell cultures)
DTT dithiothreitol
EC Ethylene carbonate
EBF Early B cell factor
EGFR Epidermal Growth Factor Receptor
ELISA Enzyme-linked immuno sorbent assay
EMD Emanuel Merck, Darmstadt
EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay
EpCAM Epithelial cell adhesion molecule

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