Développement d’outils chimiques pour l’élucidation de la biosynthèse des flavonoïdes du raisin : anthocyanes versus proanthocyanidines

De
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Sous la direction de Stéphane Quideau, Denis Deffieux
Thèse soutenue le 21 décembre 2010: Bordeaux 1
Ces dernières années, des progrès remarquables ont été accomplis afin d’élucider la biosynthèse des flavonoïdes. Cependant les dernières étapes menant à la formation des proanthocyanidines ou tannins condensés issus de la vigne, restent à ce jour inconnues. Dans le but de déterminer si une ou plusieurs enzyme(s) spécifique(s) sont impliquées dans cette voie de biosynthèse, nous avons développé une approche de protéomique chimique, impliquant des matrices d’affinité constituées de substrats de type flavanols greffés sur un support solide. La validation de ces outils à l’aide de LDOX, une enzyme issue de Vitis vinifera a pu être menée à bien dans le cadre de ces travaux de thèse.
-Flavonoïdes
-Biosynthèse
-Protéomique chimique
-Chromatographie d'affinité
-Synthèse de flavonoïdes
-Ldox
Remarkable progress toward the complete elucidation of the biosynthesis of flavonoids has been accomplished during the last decade, but the final step leading to proanthocyanidins still remain to be elucidated, in particular, the exact nature of starter and extension units as well as the enzymatic or non enzymatic condensation process. In order to answer whether some specific enzymes are involved in the biosynthesis of grapevine proanthocyanidins, we have developped a chemical proteomics approach, with an affinity chromatography-based tool in which a flavanol type substrate is loaded on an appropriate solid support. The validation of these tools with the LDOX enzyme from Vitis vinifera was developped and performed in this Ph.D work.
-Flavonoids
-Biosynthesis
-Chemical proteomics
-Affinity chromatography
-Flavonoids synthesis
-Ldox
Source: http://www.theses.fr/2010BOR14188/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
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N° d’ordre : 4188






THÈSE

PRÉSENTÉE A

L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES

Par Céline CHALUMEAU

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR

SPÉCIALITÉ : CHIMIE ORGANIQUE

Développement d’outils chimiques pour l’élucidation de la
biosynthèse des flavonoïdes du raisin : Anthocyanes versus
proanthocyanidines

Directeur de recherche : Pr. Stéphane Quideau

Soutenue le : 21 décembre 2010

Après avis de :

Mme GENY, L. Maître de conférence, Université Victor Ségalen Bordeaux 2 Rapporteur
M. DANGLES, O. Professeur, Université d’Avignon et des Pays de Vaucluse Rapporteur

Devant la commission d’examen formée de :

Mme GENY, L. Maître de conférence, Université Victor Ségalen Bordeaux 2 Rapporteur
M. DANGLES, O. Professeur, Université d’Avignon et des Pays de Vaucluse Rapporteur
M. SCHMITTER, J-M. Professeur, Université Bordeaux 1 Examinateur
M. DUBOURDIEU, D. Professeur, Université Victor Ségalen Bordeaux 2 Président du jury
M. DEFFIEUX, D. Maître de conférence, Université Bordeaux 1 Co-directeur de thèse
M. QUIDEAU, S. Professeur, Université Bordeaux 1 Directeur de thèse

Université Bordeaux 1
Les Sciences et les Technologies au service de l’Homme et de l’environnement
Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier les directeurs de l’Institut Européen de Chimie et de Biologie
(IECB), le Docteur Jean-Jacques Toulmé et le Docteur Ivan Huc ainsi que le Docteur
Philippes Garrigues et le Professeur Stéphane Quideau, respectivement directeurs de l’Institut
des Sciences Moléculaires (ISM) et du groupe Synthèse, pour m’avoir accueillie dans leur
laboratoire.

Je tiens à remercier le Professeur Stéphane Quideau pour m’avoir accueillie au sein de son
équipe et m’avoir initiée à la chimie des polyphénols. Je tiens également à lui adresser mes
remerciements pour ses conseils avisés en chimie organique, pour la confiance qu’il m’a
accordée, la rigueur qu’il a su m’enseigner ainsi que pour m’avoir fait participer à plusieurs
congrès, notamment à l’ICP (Conférence Internationale sur les Polyphénols).

Je souhaite également témoigner toute ma reconnaissance au Docteur Denis Deffieux, mon
co-directeur de thèse, qui m’a encadrée pendant ces trois années, pour ses précieux conseils
scientifiques, pour sa disponibilité, son écoute, sa confiance et ses encouragements. Un grand
merci Denis aussi pour ta patience et ton coatching à toute épreuve (« on lache rien ! »), des
manips jusqu’aux présentations orales, qui m’auront vraiment permis d’avancer.

Je remercie sincèrement le Docteur Laurence Gény et le Professeur Olivier Dangles d’avoir
accepté de juger ce travail en qualité de rapporteurs, ainsi qu’au Professeur Jean-Marie
Schmitter pour avoir accepté d’être examinateur de ces travaux. Je tiens également à exprimer
mes remerciements au Professeur Denis Dubourdieu qui me fait l’honneur d’être le président
de ce jury.

J’adresse mes remerciements au Conseil Interprofessionnel du Vin de Bordeaux (CIVB), pour
son soutien financier durant ces trois années de thèse. Je remercie en particulier M. Laurent
Charlier et Mme Muriel Barthe.

Je souhaite également remercier les personnes qui ont vivement contribué à ce projet, en
particulier Sabrina Rousseau pour la partie biologie/biochimie. Merci Sabrina pour ton
énergie, ton efficacité, ta disponibilité et ton implication dans ce projet. Entre autres, je
n’oublierai pas ton soutien et ta gentillesse dans les moments difficiles et soulignerai ton
dévouement (dimanche et heures tardives incluses), et ce, même pliée en deux en arrêt
maladie ! Merci d’avoir contribué à la réussite de ce travail, et d’avoir vécu, mangé et dormi
avec la LDOX en même temps que moi.
Je remercie également le Dr. Claudine Trossat pour avoir initié une chimiste à la biochimie
des protéines et pour m’avoir accueillie dans son laboratoire à l’INRA. Merci pour ta
sympathie et ton enthousiasme Claudine! Je tiens aussi à remercier le Docteur Stéphane
Chaignepain pour la partie spectrométrie de masse (analyse protéomique). Merci pour tout le
temps que tu as su trouver pour prendre part à ce projet (même jusqu’à 2h du matin vers la
fin !), pour tes conseils et ta participation active. Merci aussi pour ton coatching, le temps que
tu m’as accordé et la pédagogie avec laquelle tu as su répondre à (toutes) mes questions. J’en
profite également pour remercier Katell pour son expertise en spectrométrie de masse en ce
qui concerne la caractérisation des composés, mais aussi pour avoir répondu à mes
innombrables sollicitations concernant le LCQ (SOS 18?!!). Merci également à Claire
Mouche et Christiane Vitry, toujours pour la spectrométrie de masse, pour votre accueil, votre
gentillesse et pour m’avoir prété votre LCQ à un moment crucial ! Et Claire, merci pour ton
obstination pour nous avoir obtenu cette haute résolution du dimère !Je tiens également à
remercier Axelle Grélard et le Docteur Cécile Courreges pour leur aide précieuse en ce qui
concerne l’analyse RMN HR-MAS. Alors ça tourne ???!!! Axelle, merci pour ton
professionnalisme, ton dynamisme, ta bonne humeur et ta réactivité. Cécile, merci également
pour tout le temps que tu as passé, ta persévérance et ta disponibilité (toujours avec le
sourire). Finalement, on y est arrivées à ces attributions ! Ce fut un réel plaisir de travailler
avec vous deux.
Je tiens également à remercier le Docteur Sébastien Fribourg pour m’avoir accueillie dans son
laboratoire, pour nos discussions et pour ses conseils en ce qui concerne l’étude et la structure
de la protéine. Un grand merci également à toute son équipe, qui a contribué à ce que je me
sente « chez moi », je pense à Fred M. (merci aussi pour tes conseils et ton œil aguérri Mme
la présidente de la JJC), Maria (merci pour ton aide et ta joie de vivre), Stéphane L. (pour
avoir été là et d’être toujours là heureusement !et pour m’avoir rassurée à des heures plutôt
tardives), Cécile (merci d’avoir toujours été là tôt ! et pour nos discussions si animées et si
variées), et Natacha (merci pour ton franc parlé, ça fait tellement de bien, merci pour ton
soutien et ton peps). Mon côté « hybride » n’aurait pas été le même sans vous...J’en profite
pour remercier les autres biologistes, pour leur sympathie et leur disponibilité, merci à
Carmélo (pour nos discussions enzymo-biochimie), Reiko (pour m’avoir prété sa chambre
froide et pour son attention), Hélène (pour l’incubateur et sa sympathie), Benoît (pour les
photos du Western), mais aussi Thierry (pour la protéine). Je remercie également les anciens
de l’Institut : Fabien, maman Armelle, Adéline, Corinne, Marisa, Michael et Seb (les
UCBiens qui nous ont amené un peu de Belgique et de bonne humeur), mais aussi Oscar,
Srinivas, Benoît, Reddy, Tomas, ou Santosh... et merci à Nico (que de bons moments pour
mon début de thèse et le sacre du Dr. Delsuc !) mais aussi à Claude (ma nounou qui m’a tout
appris !) et à ta ptite femme Gosia. Merci à Céline D., pour tes conseils avisés en synthèse sur
support solide et tes idées, mais aussi pour tes conseils plus personnels et surtout pour ton
côté Mammé. Je remercie également Jean, pour avoir toujours été là, pour avoir toujours cru
en moi, pour ta confiance et ton amitié. Merci également à la petite équipe de l’administration
(Sandra, Stéphanie, Annie) pour leur gentillesse et leur bonne humeur. Merci également à
tous les chimistes du pôle 2, Jone pour nos petites pauses sur le balcon et/ou lamentations sur
la chimie, Simon (give me five buddy !), Marie, bon courage pour ces trois années, tu vas y
arriver, je n’ai aucun doute ! les flammands Stijn et Tiny, Yann, Marc, Guillaume, Yannick,
Claire et Neil pour avoir partagé mon quotidien au laboratoire. Mes stagiaires, Stéphanie et
Wissem, merci d’avoir amené votre petite pierre à l’édifice. Wissem, bravo pour ton
autonomie ; Stéphanie, bravo pour ton implication, ta rigueur, et le travail que tu as réalisé.
Merci aussi à tous les membres de l’équipe Quideau, passés et présents qui ont partagé mon
quotidien : Laurent pour ta disponibilité et tes conseils, Patrick, pour m’avoir tout appris en
LC-MS, Sophie (j’espère que la relève fut assurée !), merci à Stefan pour ta sagesse (modérée
certes, quand on est une star à Salamanca) et ton savoir, un véritable exemple Chacha !
Séverine (Mme Or de Vie) pour ta gentillesse et ton écoute, Michaël pour nos discussions et
tes conseils ; Céline F. pour tes conseils avant le jour J ; Gaëlle avec qui j’ai vibré au fil des
saisons de Jack Bauer ou bien encore les desperate ! Emmanuela, pour ta joie de vivre et ta si
belle culture italienne que tu nous fait vivre à merveille, ragazza ! Mélanie D., tu vas t’en
sortir avec notre LDOX, ne deviens pas Loca, loca, loca, plein de courage pour ta thèse. Merci
pour ton affection, tu vas me manquer chiquita ! les djeun’s : courage aux iodanistes Cyril et
Romain (gardez votre bonne humeur et votre fraîcheur), mais aussi à Emilie (garde tes yeux
pétillants stp) et à Hélène (la relève...courage pour aller à la pêche, sois forte tu vas y
arriver !). Tahiri, merci pour ton absence de stress parfois déconcertante qui m’aura pourtant
fait beaucoup de bien, pour ton humour (ou pas) « le manuscrit ne doit pas être parfait sinon,
les questions seront trop difficiles » ou encore « quoi, ils font payer la montagne alors que
c’est la nature ?!(en parlant des stations de ski) », bravo Tahiri, we did it ! Gigi, merci pour
tes blagues, pour tes ballons cassés, pour ta bonne humeur et pour m’avoir fait « valser » dans
le labo. Mon To, merci pour tout, ton humour (du G arnier’s aldehyde au protoon entre
autres), ta présence, pour avoir toujours poussé au « bon alors on fait un peu de chimie ?»,
pour ton soutien (même la veille du jour J), merci d’avoir toujours veillé sur Célamiss et enfin
pour tes talents de « Le Chanteur » et paye ta...Une belle aventure qui commence par ces trois
années, et surtout un ami sur lequel je peux compter. Mon Raymond ! Merci pour nos
longues discussions, pour m’avoir souvent fait partager ta vision des choses, pour ta franchise,
pour ton amitié...pour la richesse de ce que tu es. Marion, que de bons et grands moments,
heing ? D’excellents souvenirs resteront gravés, du comité JJC, à la cardio (ou pas...cf la
miss), au café, devant l’alambic ou encore pour nos têtes à têtes du mercredi soir (même
devant la paillasse!), donc un grand merci. Ma bellissima ragazza Anna, grazie mille pour tout
ce que l’on a partagé, les échecs mais aussi les succès (à pH 5.3), pour ton réconfort, pour ton
sourire légendaire, et tout ce que tu m’as donné pendant cette thèse (et qui continue encore).
Et n’oublie pas même si « tu ressens la manquance », je suis là pour toi, ti amo bella. Ma ptite
miss, si j’en suis là, c’est aussi grâce à toi, on l’a fait ensemble. Alors merci pour tout, pour

²avoir été le démon nous montrant la voie du swing, pour ton amitié, pour m’avoir si souvent
écoutée et conseillée, merci à ton épaule que j’ai su trouver bien des fois quand les réactions
ne marchaient pas ou autre, merci pour les nombreuses relectures (du spectre publishable ?, au
rapport tri, au manuscrit...)! Merci pour ton relativisme, toute l’énergie que tu m’as donnée et
envoyée même d’Angleterre, les discussions qui font avancer, merci de m’avoir montré
l’exemple... Il fallait bien évidemment qu’on se rencontre et quelle rare chance, alors merci de
m’avoir accordé une si grande place dans ton cœur.... Poulain, ce fut également une rencontre
qu’on oublie pas, alors merci pour ta spontanéité, ton attention, ta sincérité et ton amitié. Hey
salut ? Qu’est-c’tu fait là la révélation de la salle de rédaction ? Stup, un grand merci, comme
quoi l’espace confiné crée des liens très forts. Un condensé de très bons moments qui
marquent et j’en suis très heureuse...et une petite pensée pour le stagiaire qui sert à rien
(Nicostup). Merci aussi à Vanessa, on a fait bien du chemin depuis la licence et on y est ! Nos
doutes, nos discussions, merci d’avoir partagé ça ensemble. Merci aussi ma ptite P, pour
m’avoir si souvent écoutée, soutenue, renforcée. Les « in P I trust » ont aussi contribué à cette
réussite, alors merci d’être toi et d’être toujours là. Merci aussi à l’autre P néerlandais, pour
tes brodjes, ta chimie en costard-chemise, ton amitié et ton écoute. Merci d’avoir cru en moi
Peter, et d’y croire encore. Mon Bobby, un grand merci pour ce rôle d’extra-co-directeur de
thèse, pour tes conseils, nos discussions, ta philosophie de la vie, notre amitié...pour ces
grands moments qui ont enrichi mon expérience. Merci à vous, une partie de ma famille qui
m’avez souvent permis de déconnecter, ma bouffée d’oxygène : Dr. Fage, merci pour ne pas
avoir posé de question le jour J, de t’être préoccupé de mon sort et de m’avoir toujours
encouragée, M. Ben, merci pour m’avoir toujours écoutée, t’être toujours inquiété...Lolo, I did
it ! Merci d’avoir toujours cru en moi, depuis le temps que j’en parlais, merci d’être toujours
là. Ma poupoule, merci pour ton réconfort, pour tes valeurs, pour m’avoir fait relativiser,
rassurée, réconfortée, merci pour m’avoir tant donné. Merci pour cette force et ce lien qui
nous unit. Mon staff, une longue et très belle histoire déjà...et toi aussi tu as toujours eu foi en
moi. Merci pour ton soutien, nos longues conversations, tes si bons conseils, ton bon sens, ta
présence, ton amitié. Ca nous rajeunit pas, mais on est toujours là l’une pour l’autre, c’est ce
qui compte. Le staff aime le staff. Tous, vous « autres », vous êtes dantesque et je vous aime
mas.
Mon Ju...merci pour tout, pour ta patience, ta confiance, ton soutien quotidien, m’avoir
supportée, merci pour ta force. Merci d’être à mes côtés, de faire mon bonheur et d’avoir très
largement contribué à cette réussite. Merci aussi à Ginette, Bernard, Jo et Sylvie pour votre
soutien et vos encouragements. Mamie, tu es mon modèle, merci de croire en moi ! Ma ptite
Marraine, ma deuxième maman...merci pour ton écoute, ta clarté, ton soutien, ton amour. Je
n’en serai sûrement pas là si tu n’avais pas été là. Tom tom je crois en toi, ta nana est fière de
toi. Ma maman, je te dédie ce travail, tu auras été et tu es admirable. Je te remercie pour tout,
pour m’avoir motivée, remonté le moral, soutenue et donné confiance à chaque étape de la
vie.
Sommaire
Sommaire

Remerciements..................................................................................................... 3
Avertissements...................................................................................................13
Avant-Propos .....................................................................................................17
Chapitre I. Vers l’élucidation de la biosynthèse des flavonoïdes..................19
I Introduction générale aux flavonoïdes .............................................................. 21
I.1 Etude structurale........................................................................................................... 22
I.1.1 Les flavanones............................................................................................................. 23
I.1.2 Les dihydroflavonols................................................................................................... 24
I.1.3 Les flavan-3,4-diols ou leucoanthocyanidines ............................................................ 24
I.1.4 Les flavan-3-ols........................................................................................................... 26
I.1.5 Les flavones et isoflavones.......................................................................................... 29
I.1.6 Les flavonols ............................................................................................................... 30
I.1.7 Les anthocyanidines et anthocyanes............................................................................ 31
I.1.8 Les proanthocyanidines ou tannins condensés............................................................ 33
I.1.9 Les chalcones, dihydrochalcones et aurones............................................................... 36
I.2 Propriétés...................................................................................................................... 37
I.2.1 Chimiques.................................................................................................................... 37
I.2.1.1 Anti-oxydantes.......................................................................................................................................... 37
I.2.1.2 Acido-basiques ......................................................................................................................................... 38
I.2.2 Effets protecteurs des flavonoïdes chez les plantes..................................................... 39
I.2.3 Effets protecteurs in vitro des flavonoïdes issus de l’alimentation ............................. 40
I.2.4 Autres propriétés médicinales ..................................................................................... 41
I.2.5 Astringence des tannins condensés ............................................................................. 43
II Voie de biosynthèse des flavonoïdes................................................................... 44
II.1 Vue d’ensemble............................................................................................................ 44
II.2 Accès biosynthétique aux chalcones ............................................................................ 47
II.3 Accès biosynthétique aux flavanones .......................................................................... 48
II.4 Accès biosynthétique aux dihydroflavonols ................................................................ 48
II.5 Accès biosynthétique aux leucoanthocyanidines ......................................................... 49
II.6 Accès biosynthétique aux anthocyanidines et aux anthocyanes .................................. 50
II.6.1 La leucoanthocyanidine dioxygénase (LDOX)........................................................... 50
II.6.2 La 3-glucosyltransférase (3GT)................................................................................... 63
7 Sommaire
II.7 Accès biosynthétique aux flavan-3-ols ........................................................................ 64
II.8 Accès biosynthétique aux proanthocyanidines ou tannins condensés ......................... 65
Chapitre II. Objectifs et stratégies – Développement d’outils chimiques ...69
I Contexte de l’étude .............................................................................................. 71
II L’approche protéomique, un outil de choix pour l’identification des protéines
71
II.1 Analyse par spectrométrie de masse ............................................................................ 72
II.2 Fractionnement préalable des protéines ....................................................................... 73
II.2.1 Analyse par « shotgun ».............................................................................................. 73
II.2.2 Analyse par électrophorèse à deux dimensions........................................................... 74
II.3 Identification des protéines .......................................................................................... 76
II.3.1 L’empreinte de masse peptidique (« mass fingerprint ») ............................................ 76
II.3.2 Information de séquence, approche MS/MS ............................................................... 76
II.3.3 Traitement informatique et recherche dans les bases de données ............................... 77
II.3.4 Les critères d’identification......................................................................................... 77
III Complexité du protéome de Vitis Vinifera ........................................................ 78
IV Concept de « protéomique chimique » .............................................................. 81
IV.1 Pré-requis pour la chromatographie d’affinité ............................................................. 82
IV.2 Matrice d’affinité pour la protéomique ........................................................................ 82
V Développement de matrices chimiques flavonoïdiques pour l’approche
protéomique................................................................................................................. 85
Chapitre III. Etude de l’activité enzymatique de la leucoanthocyanidine
dioxygénase issue de Vitis vinifera ...................................................................89
I Etude d’activité enzymatique préliminaire à l’aide du substrat (+)-catéchine
92
I.1 Etude de la concentration en substrat........................................................................... 93
I.2 Etude de stabilité de la LDOX vis à vis de son activité en fonction du temps et de la
température........................................................................................................................... 94
II Etude de la sélectivité de la réaction enzymatique de la LDOX sur différents
substrats ....................................................................................................................... 95
II.1 Substrat (-)-épicatéchine .............................................................................................. 95
II.2 Substrat dihydroquercétine (taxifoline)........................................................................ 96
8 Sommaire
II.3 Substrat (±)-naringénine............................................................................................... 98
II.4 Substrat leucocyanidine.............................................................................................. 100
Chapitre IV. Synthèse, greffage de flavonoïdes et étude biochimique sur les
substrats fonctionnalisés.................................................................................105
I Stratégie de synthèse ......................................................................................... 107
I.1 Etudes préliminaires................................................................................................... 107
I.2 Développement de nouveaux outils chimiques ou matrices d’affinité ...................... 108
I.2.1 Positionnement et nature de l’espaceur..................................................................... 108
I.2.2 Pourquoi la résine PEGA ?........................................................................................ 109
II Fonctionnalisation sur le cycle B...................................................................... 111
II.1 Aperçu bibliographique sur la protection chimiosélective de catéchols .................... 111
II.2 Accès aux flavan-3-ols greffés................................................................................... 114
II.2.1 Espaceur comportant un ester méthylique terminal .................................................. 114
II.2.2 Espaceur comportant un ester benzylique terminal................................................... 115
II.2.2.1 Hydrogénolyse................................................................................................................................... 117
II.2.2.2 Couplage à la résine PEGA ............................................................................................................... 117
II.3 Accès à un flavan-3,4-diol ......................................................................................... 119
II.3.1 Analyse rétrosynthétique........................................................................................... 119
II.3.2 Oxydation de flavan-3-ols dans la littérature ............................................................ 120
II.3.3 Synthèse et greffage de la cis-leucocyanidine........................................................... 122
II.3.4 Déprotection sur le support ....................................................................................... 125
II.4 Application de la stratégie à une flavanone : l’ériodictyol......................................... 127
II.5 Activité de la LDOX en solution sur des substrats fonctionnalisés via le catéchol du
cycle B................................................................................................................................ 129
II.5.1 Réactions biochimiques............................................................................................. 129
II.5.2 Rationalisation des résultats ...................................................................................... 130
III Fonctionnalisation sur le cycle A...................................................................... 131
III.1 Analyse rétrosynthétique............................................................................................ 131
III.2 Accès aux flavan-3-ols greffés................................................................................... 132
III.2.1 Synthèse de dérivés comportant un espaceur de type A1.......................................... 133
III.2.1.1 Préparation de l’espaceur................................................................................................................... 133
III.2.1.2 Introduction de l’espaceur : réaction d’amination réductrice............................................................. 133
III.2.1.3 Déprotection des groupements benzyliques et couplage à la résine PEGA ....................................... 134
III.2.2 Synthèse de dérivés comportant un espaceur de type A2.......................................... 136
III.2.2.1 Espaceur comportant un ester éthylique terminal.............................................................................. 136
III.2.2.2 Espaceur comportant un ester benzylique terminal ........................................................................... 137
III.3 Accès à un flavan-3,4-diol ......................................................................................... 142
III.3.1 Différentes stratégies de protection envisagées......................................................... 142
III.3.2 Perspectives............................................................................................................... 146
9 Sommaire
III.4 Activité de la LDOX en solution sur des substrats fonctionnalisés en position C8 du
cycle A................................................................................................................................ 148
III.4.1 Réactions biochimiques............................................................................................. 148
III.4.1.1 Espaceur de type A1.......................................................................................................................... 148
III.4.1.2 Espaceur de type A2.......................................................................................................................... 148
III.4.2 Rationalisation des résultats ...................................................................................... 150
IV Conclusion .......................................................................................................... 154
Chapitre V. Validation de l’approche : Etude de l’affinité enzymatique
pour les résines fonctionnalisées ....................................................................157
I Etude de l’affinité de la LDOX partiellement purifiée pour les matrices
flavonoïdiques............................................................................................................ 159
I.1 Chromatographie d’affinité ........................................................................................ 159
I.2 Gel d’électrophorèse 1D............................................................................................. 161
I.3 Rationalisation des résultats ....................................................................................... 163
II Identification de l’enzyme par spectrométrie de masse................................. 164
II.1 Empreinte de masse peptidique de la bande ayant une affinité spécifique pour le
substrat 121a....................................................................................................................... 164
II.2 Conclusion.................................................................................................................. 166
III Identification d’une autre protéine retenue par les matrices d’affinité....... 167
Conclusion générale et perspectives ..............................................................171
Chapitre VI. Partie Expérimentale................................................................177
I Généralités.......................................................................................................... 179
I.1 Conditions expérimentales générales ......................................................................... 179
I.2 Techniques d’analyse ................................................................................................. 179
I.2.1 Point de fusion (p.f.).................................................................................................. 179
I.2.2 Pouvoir rotatoire [ ] ................................................................................................ 179 D
I.2.3 Spectroscopie Infrarouge (IR)................................................................................... 180
I.2.4 Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ................................................................ 180
I.2.5 Spectrométrie de Masse (MS) ................................................................................... 181
I.2.6 Test au TNBS............................................................................................................ 181
II Synthèse de la leucocyanidine........................................................................... 182
10
a

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