Dissecting the Tio-NF-kappaB Signalosome in Human T Cells [Elektronische Ressource] / Sarah Jill de Jong. Betreuer: Lars Nitschke

Dissecting the Tio-NF-B Signalosomein Human TCellsAufklärung des Tio-NF-B Signalosomsin humanen T-ZellenDer Naturwissenschaftlichen Fakultätder Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-NürnbergzurErlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.vorgelegt vonSarah Jill de Jongaus Seeheim-JugenheimAls Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultätder Universität Erlangen-Nürnberg.Tag der mündlichen Prüfung: 11. August 2011Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Rainer FinkErstberichterstatter: Prof. Dr. Lars NitschkeZweitberichterstatter: Prof. Dr. Bernhard FleckensteinMan muss sich Beeilen, Wenn man noch etwas Sehen will ...Alles Verschwindet!Paul Cézanne (1839-1906)ContentsSummary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . viZusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii1 Introduction 11.1 Nuclear Factor of KappaB (NF-B) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11.1.1 Activation of NF-B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.1.2 Targets and Cross-Talk of NF-B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.1.3 Corruption of NF-B Signaling in Lymphoid Malignancies . . . . . . . . . . 71.2 Simian Rhadinoviruses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.2.1 Herpesvirus saimiri and its Oncoproteins StpC and Tip . . . . . . . . . . . 81.2.
Publié le : samedi 1 janvier 2011
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Signalosome lls
Dissecting the in H
Tio-NF-κB uman T Ce
Aufklärung des Tio-NF-κB Signalosoms in humanen T-Zellen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von Sarah Jill de Jong aus Seeheim-Jugenheim
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg.
Tag der mündlichen Prüfung:
Vorsitzender der Prüfungskommission:
Erstberichterstatter:
Zweitberichterstatter:
11.
August 2011
Prof.
Prof.
Prof.
Dr.
Dr.
Dr.
Rainer Fink
Lars Nitschke
Bernhard Fleckenstein
Man muss sich Beeilen, Wenn man noch etwas Sehen will . . . Alles Verschwindet!
Paul Cézanne (1839-1906)
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Rationale
Contents
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Introduction
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1.1.1 Activation of NF-κB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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1.1 Nuclear Factor of KappaB (NF-κ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . B) .
1.1.2 Targets and Cross-Talk of NFκ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .B . -
1.2
1.1.3 Corruption of NF-κ . . . . . . . .B Signaling in Lymphoid Malignancies .
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1.2.1Herpesvirus saimiri . . . . . . . . . .and its Oncoproteins StpC and Tip .
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Simian Rhadinoviruses . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Abbreviations
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Bibliography
Results
1.2.2Herpesvirus atelesand its Oncoprotein Tio
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3.1.2 Tio-induced Canonical NF-κB Activity Depends on NEMO . . . . . . . . .
Tio Induces Canonical NF-κ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .B Activity .
3.1.4 Tio-induced Canonical NF-κB Activity Targets p100 and RelB Expression .
3.1.3 Tio-induced Canonical NF-κB Activity Depends on IKKβActivity . . . . .
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3.1.1
3.1 Tio-induced Canonical NF-κ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .B Signaling .
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3.2.6
Tio Induces Decay of TRAF3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.5
Tio-induced Non-canonical NF-κB Activity Maps to Amino Acids 210-217 .
3.2.4
Tio-induced Non-canonical NF-κ . . . .B Activity Maps to its N-terminus .
3.2.3
Tio Is Complexed with TRAF3 and TRAF2 . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2
Tio Induces Stabilization of NIK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1
Tio Induces Activation and Nuclear Translocation of p52 and RelB . . . . .
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Tio-induced Non-canonical NF-κB Activity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.5 Tio-induced NF-κB Activity Maintains Survival of Virus-transformed Human
T Cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Methods .
5.1 Materials
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5 Materials and Methods
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4.3 Cross-Talk of NF-κB Signaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2 Tio-Induced Non-canonical NF-κB Signaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1 Tio-Induced Canonical NF-κB Signaling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Discussion
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List
of
Figures
1.1 NF-κ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  .B Signaling Pathways 1.2 Model of NEMO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3 Regulation of NIK Stability in Non-Canonical NF-κ . . . . . . . . . . . . .B Activation 1.4 Model of the Tio Oncoprotein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1 NF-κ .B Activity Induced by Tio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 NF-κB Activity Induced by Tio in the Presence of NEMO . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 cIAP2 Expression Induced by Tio in the Presence of NEMO . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 NF-κby Tio in the Presence of NEMO Deletion MutantsB Activity Induced  . . . . . . 3.5 NF-κB Activity Induced by Tio in the Presence of Mutant NEMO L329P . . . . . . . . 3.6 Effects of IKKβInhibition on Tio-induced NF-κ .B Activity . . . . . . . . . . . . . . . 3.7 Processing of p100 and Expression of RelB in the Presence of Tio . . . . . . . . . . . . 3.8 Survival of Virus-transformed Human T Cells in the Presence of IKKβInhibitor . . . . 3.9 Expression of p100/p52, RelB, and cIAP2 in Virus-transformed Human T Cells . . . . 3.10 DNA Binding of Tio-induced Nuclear p52 and RelB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.11 Stabilization of NIK in Jurkat T Cells and Virus-transformed Human T Cells . . . . . 3.12 Tio Complexes with TRAF3 and TRAF2 in Virus-transformed Human T Cells . . . . 3.13 Processing of p100 in the Presence of Tio Deletion Mutants . . . . . . . . . . . . . . . 3.14 Processing of p100 in the Presence of Tio Point Mutants . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.15 Processing of p100 and Expression of RelB in the Presence of mMotif1 Mutants . . . . 3.16 TRAF3 Decay in the Presence of Tio and mMotif1 Point Mutants . . . . . . . . . . .
4.1 Model of the Tio-NFκB Signalosome . . . . . .
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Summary
NF-κ Deregula-B transcription factors are pleiotropic regulators of lymphoid proliferation. tion of NF-κis associated with malignant lymphoproliferative diseases. WhereasB signaling ample evidence has accumulated for oncogenic NF-κB signaling in tumors of the B cell lin-eage, only little is known about its role in T-lymphoid malignancies.Herpesvirus atelesis a T-lymphotropicγthat induces fulminant T-cell leukemias and lymphomas in-herpesvirus New World primates. Its oncogenic phenotype is mediated by the oncoprotein Tio, which is membrane-anchored and mimics a constitutively active, ligand-independent receptor interfering with host-cellular signaling. Infection of human T cells with Tio-expressing herpesviruses inducesin vitrogrowth transformation and leads to the outgrowth of stable cell lines. These T-cell lines can serve as a model system to better understand T-cellular signaling pathways involved in oncogenesis.
This work discloses Tio as a potent activator of canonical and non-canonical NF-κB signal-ing. Induction of the canonical NF-κB route premises recruitment of the ubiquitin ligase TRAF6 to the N-terminus of Tio. Signal transmission via the IKK complex proceeds through ubiquitin-mediated activation of NEMO and IKKβ cano-activity. Tio-induced nical NF-κB activity targets the cellular proto-oncogenes cIAP2, IL-8, p100 and RelB. Notably, the inhibition of constitutive canonical signaling in virus-transformed human T-cell lines leads to downregulation of cIAP2, p100 and RelB expression and results in cell death. Thus, Tio-induced canonical NF-κB activity is required for the maintenance of a transformed phenotype,i.e. of the Activationsustained survival and proliferation. non-canonical NF-κinduced independently of TRAF6, NEMO and IKKB route is β. Tio triggers processing of the p100 precursor to p52 and leads to subsequent nuclear transloca-tion and DNA binding activity of p52 together with its dimeric partner RelB. These effects are accompanied by stabilization of the central non-canonical regulator NIK. Moreover, the essential modulators of NIK destabilization, TRAF3 and TRAF2, are complexed with Tio and thereby likely sequestered from NIK to foster its stabilization. In addition, Tio causes a decrease of TRAF3 protein levels. This depletion of cellular TRAF3 pools may further augment stabilization of NIK. The induction of non-canonical NF-κB activity by Tio was mapped to a C-terminal proline-anchored seven-amino-acid motif. The integrity of this motif is dispensable for canonical NF-κB activity, but is required for induction of p100 processing as well as TRAF3 decay.
Taken together, Tio triggers each NF-κB pathway by a distinct, spatially separable mech-anism without any apparent signs of cross-talk. Therewith, Tio provides a tool to dissect oncogenic NF-κ Identification of pathway-specificB signaling pathways in human T cells. target genes might allow to define novel therapeutic approaches to malignant T-lymphoid diseases associated with aberrant NF-κB activation.
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Zusammenfassung
NF-κ IhreB Transkriptionsfaktoren sind pleiotrope Regulatoren lymphoider Proliferation. Deregulation ist mit malignen, lymphoproliferativen Erkrankungen assoziiert. Zahlreiche Hinweise sprechen für eine onkogene Aktivität von NF-κB in Tumoren der B-Zell-Reihe, wogegen im Hinblick auf T-lymphoide Tumore nur wenig bekannt ist.Herpesvirus ateles ist ein T-lymphotropesγ-Herpesvirus, das T-Zell-Leukämien und Lymphome in Neuwelt-Primaten induziert. Sein onkogener Phänotyp wird dem Onkoprotein Tio zugeschrieben, welches membrangebunden vorliegt und einen konstitutiv-aktiven, liganden-unabhängigen Rezeptor imitiert. Die Infektion mit Tio-exprimierenden Herpesviren transformiert hu-mane T-Zellen zu permanentem Wachstumin vitro. Die resultierenden T-Zell-Linien die-nen als Modellsysteme zur Aufklärung onkogener, T-zellulärer Signalwege.
Diese Arbeit beschreibt Tio als Aktivator des kanonischen und nicht-kanonischen NF-κB-Signalwegs. Die Induktion des kanonischen NF-κB Signalwegs basiert auf der Rekrutier-ung der Ubiquitin-Ligase TRAF6 an den N-Terminus von Tio. Die Signaltransmission über den IKK-Komplex erfordert eine Ubiquitin-vermittelte Aktivierung von NEMO und die Kinase-Aktivität von IKKβ diesem Weg induziert Tio die zellulären Proto-. Auf Onkogene cIAP2, IL-8, p100 und RelB. Die Inhibition des konstitutiven, kanonischen Signals in Virus-transformierten humanen T-Zellen führt entsprechend zu einer Herunter-regulation der cIAP2-, p100- und RelB-Expression und bemerkenswerterweise auch zum Zelltod. Folglich ist die Tio-vermittelte, kanonische NF-κB Aktivität für die Aufrechter-haltung des transformierten Phänotyps notwendig, also für das Überleben und die Pro-liferation der Zellen. Die Aktivierung des nicht-kanonischen NF-κB Signalwegs durch Tio ist unabhängig von TRAF6, NEMO und IKKβ. Typischerweise induziert Tio die Prozessierung des p100 Vorläuferproteins zu p52, sowie die nukleäre Translokation und DNA-Bindungsaktivität von p52 und RelB. Diese Effekte gehen mit einer Stabilisierung des zentralen, nicht-kanonischen Regulators NIK einher. Des Weiteren komplexiert Tio die essentiellen Modulatoren der NIK-Stabilität, TRAF3 und TRAF2. Dadurch wird NIK wahrscheinlich von diesen Modulatoren getrennt und stabilisiert. Zusätzlich führt Tio zu einer Reduktion des TRAF3-Proteingehalts, was die NIK-Stabilisierung weiter verstärken könnte. Die Induktion der nicht-kanonischen NF-κB-Aktivität durch Tio konnte auf ein C-terminales, Prolin-verankertes, sieben Aminosäuren langes Motiv eingegrenzt werden. Die Integrität dieses Motives ist verzichtbar für die kanonische NF-κB-Aktivität, aber un-abdingbar für die p100-Prozessierung und den TRAF3-Abbau.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Tio die beiden NF-κB-Signalwege unabhängig voneinander durch unterschiedliche, räumlich separierbare Mechanismen auslöst. Damit stellt sich Tio als Instrument zur Aufklärung onkogener NF-κB-Signalwege in humanen T-Zellen dar. Die Identifikation Signalweg-spezifischer Zielgene kann neue therapeutische Ansätze für maligne T-lymphoide Erkrankungen eröffnen, die mit abnormer NF-κB-Akti-vierung einhergehen.
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Introduction
1.1 Nuclear Factor of KappaB (NF-κB)
NF-κfactor binding to the intronic enhancer of the im-B was initially identified as a munoglobulin kappa light chain in activated B cells (Sen and Baltimore, 1986) and has emerged as one of the most pleiotropic mammalian transcriptional regulators over the last 25 years. NF-κB-controlled events range from proliferation, apoptosis, cell adhesion and tissue remodeling to inflammation. Exacerbated activation of NF-κB is associated with a broad panel of diseases including lymphoid malignancies and solid tumors (Ghosh, 2007). Most intensively, NF-κB has been studied  Tin lymphoid B cells and T cells. lymphocytes constitute a major part of the adaptive immune system and take a central role in regu-lating and coordinating humoral and cellular immune responses. NF-κB plays a versatile role throughout the T-cellular life cycle. It guides T-cell development, proliferation and survival and thereby controls the T-cellular immune response. Excessive NF-κB activity can, however, lead to malignant T-cell transformation (Vallabhapurapu and Karin, 2009; Staudt, 2010).
The Mammalian NF-κB FamilyNF-κis not a single transcription factor, but ratherB a family comprising five members: p65 (RelA), RelB, c-Rel, p50 (with its precursor p105, NF-κB1) and p52 (with its precursor p100, NF-κB2). These structurally related proteins are characterized by sequence homologies within their N-terminal Rel homology domain (RHD) that enables dimerization, translocation into the nucleus and binding to specific decameric DNA consensus sequences, calledκB-sites. A C-terminal transcriptional acti-vation domain (TAD), which enables direct transactivation of gene transcription, is only present in p65, RelB and c-Rel. p50 and p52 can only act as positive transcriptional reg-ulators upon dimerization with the TAD-containing subunits. While p65 preferentially interacts with c-Rel and p50, RelB tends to form heterodimers with NF-κB2, either with the precursor p100 or its processed form p52 (Hayden and Ghosh, 2008).
Inhibitors of NF-κB (IκB)In unstimulated cells, NF-κB dimers are retained in the cyto-plasm bound to inhibitors of the IκB family. IκBs function by masking a conserved nuclear localization signal (NLS) within the RHD. There are three typical IκBs (IκBα, IκBβand IκBfeature multiple ankyrin repeats as a structural hallmark (Kanarek et al.,) that all 2010). The p105 and p100 precursor molecules also harbor ankyrin repeats and can thus
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