Distribution of immune cells in head and neck cancer [Elektronische Ressource] : CD8_1hn+ T-cells and CD20_1hn+ B-cells in metastatic lymph nodes are associated with favourable outcome in patients with oro- and hypopharyngeal carcinoma / vorgelegt von Dominik Pretscher

Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau ___________________________________________________________ Distribution of immune cells in head and neck cancer: + +CD8 T-cells and CD20 B-cells in metastatic lymph nodes are associated with favourable outcome in patients with oro- and hypopharyngeal carcinoma Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Dominik Pretscher aus Bad Kissingen Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler Referent: Prof. Dr. G. Grabenbauer Korreferent: Dr. L. Distel Tag der mündlichen Prüfung: 27.01.2010 Gewidmet meinen Eltern. + +Distribution of immune cells in head and neck cancer: CD8 T-cells and CD20 B-cells in metastatic lymph nodes are associated with favourable outcome in patients with oro- and hypopharyngeal carcinoma Inhaltsverzeichnis Seite 1. Zusammenfassung 1 1.1 Deutsche Zusammenfassung 1 1.1.1 Hintergrund und Ziele 1 1.1.2 Methoden 1 1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen 1 1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen 2 1.
Publié le : vendredi 1 janvier 2010
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Aus der Strahlenklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau   ___________________________________________________________    Distribution of immune cells in head and neck cancer: CD8+T-cells and CD20+B-cells in metastatic lymph nodes are associated with favourable outcome in patients with oro- and hypopharyngeal carcinoma   Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg      vorgelegt von Dominik Pretscher aus Bad Kissingen
 
  
  Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg                                
Dekan: Prof. Dr. J. Schüttler  Referent: Prof. Dr. G. Grabenbauer  Korreferent: Dr. L. Distel  Tag der mündlichen Prüfung: 27.01.2010
    
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Gewidmet meinen Eltern.
 
Distribution of immune cells in head and neck cancer: CD8+T-cells and CD20+B-cells  in metastatic lymph nodes are associated with favourable outcome in patients with oro- and hypopharyngeal carcinoma  Inhaltsverzeichnis         1. Zusammenfassung 1.1 Deutsche Zusammenfassung 1.1.1 Hintergrund und Ziele   1.1.2 Methoden 1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen 1.1.4 Praktische Schlussfolgerungen 1.2 Englische Zusammenfassung 2. Deutsche Einleitung 3. Vorveröffentlichung 3.1 Introduction 3.2 Methods 3.3 Results 3.4 Discussion 4. Literaturverzeichnis 4.1 nummeriertes Literaturverzeichnis 4.2 alphabetisches Literaturverzeichnis 5. Abkürzungsverzeichnis 6. Anhang 7. Danksagung 8. Lebenslauf   
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1. Zusammenfassung  1.1 Deutsche Zusammenfassung: Hintergrund und Ziele: Im allgemeinen werden tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) für die aktiven Zellen des Immunsystems hinsichtlich der antitumoralen Immunantwort gehalten. Außerdem werden TIL zunehmend als prognostische Parameter für den Verlauf einer malignen Erkrankung angesehen. Derzeitige Forschungsergebnisse zeigen jedoch divergierende Ergebnisse für verschiedene Tumorentitäten. Zudem wurde die Hypothese aufgestellt, dass solide Tumore primär vom Immunsystem ignoriert werden und eine bedeutende Immunantwort erst im Falle einer lymphogenen Metastasierung zustande kommt. Methoden: In der vorliegenden Arbeit wurde die lokale Verteilung von Immunzellen in zum Tumor gehörigen Kompartimenten bei Plattenepithelkarzinomen von Kopf und Hals evaluiert. Danach analysierten wir die prognostische Bedeutung dieser Zellen hinsichtlich des krankheitsfreien Überlebens. Insgesamt wurden 198 Gewebestanzen von 33 Patienten mittels tissue microarray und Immunhistochemie untersucht. Die Identifizierung der TIL erfolgte durch Antikörper gegen CD3, CD8, Granzym B, FoxP3, CD20 und CD68 und anschließend wurde deren Quantifizierung mit einem Bildanalyseprogramm durchgeführt. Ergebnisse und Beobachtungen: Es konnte eine relative Expansion von FoxP3+ regulatorischen T-Zellen und von regulatorischen T-Zellen unter allen tumorinfiltrierenden Zellen gezeigt werden. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass intratumorale CD20+ B-Zellen signifikant häufiger in lymphogenen Metastasen vorhanden sind als im Primärtumor selbst. Außerdem beobachteten wir eine reduzierte Anzahl an peritumoralen CD8+ in metastatischen T-Zellen Lymphknoten im Vergleich zu tumorfreien Lymphknoten, was eine lokale Suppression der zellulären Immunantwort im metastatischen Lymphknoten
2 nahelegt. Alle anderen Immunzellen zeigten keine signifikanten Änderungen hinsichtlich ihrer Verteilung. Zudem konnte kein Zusammenhang zwischen TIL im Primärtumor und dem Überleben nachgewiesen werden. Jedoch zeigte sich, dass eine hohe Anzahl von intraepithelialen CD8+ in TIL Lymphknotenmetastasen und eine erhöhte Anzahl von peritumoralen B-Zellen in der Umgebung von Lymphknotenmetastasen mit einem verbesserten Überleben assoziiert waren. Unerwarteterweise ergab sich kein Zusammenhang zwischen regulatorischen T-Zellen in den verschiedenen Kompartimenten und dem krankheitsfreien Überleben. Praktische Schlussfolgerungen: Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Veränderungen der Lymphozytenverteilung in regionalen Lymphknoten wichtiger für die Prognose der Patienten ist, als die Veränderungen im Primärtumor selbst. Außerdem zeigen wir, dass neben der zellulären auch die humorale Immunantwort klinisch relevant für das krankheitsfreie Überleben ist.  1.2 Englische Zusammenfassung: Background: Tumour infiltrating lymphocytes (TIL) are generally considered to represent a host immune response directed against tumour antigens. TIL are also increasingly recognised as possible prognostic parameters. However, the effects observed are variable indicating that results cannot be extrapolated from type of tumour to another. Moreover, it has been suggested that primary solid tumours may be ignored by the immune system and that a meaningful immune response is only mounted in regional lymph nodes. Methods: We have examined the local distribution of immune cells in tumour-related compartments in head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). In a second step, the prognostic impact of these cells on disease-free survival (DFS) was analysed. A total of 198 tissue cores from 33 patients were evaluated using tissue mircroarray technique and immunohistochemistry. Tumour-infiltrating
 
3 immune cells were identified using antibodies specific for CD3, CD8, GranzymeB,
FoxP3, CD20 and CD68 and quantified using an image analysis system. Results: We demonstrate a relative expansion of FoxP3+regulatory T-cells (Treg)
and of cytotoxic T-cells among tumour infitrating T-cells. We also show that intratumoural CD20+B-cells are significantly more frequent in metastatic deposits than in primary tumours. Furthermore, we observed a reduced number of peritumoural CD8+ T-cells in metastatic lymph nodes as compared to univolved regional nodes suggesting a local down-modulation of cellular immunity. All other
immune cells did not show significant alterations in distribution. We did not
observe an association of tumour infiltrating immune cells at the primary site with outcome. However, increased numbers of intraepithelial CD8+ TIL in metastatic tumours as well as large numbers of peritumoural B-cells in lymph node
metastases were associated with favourable outcome. Unexpectedly, no effect
on patient outcome was observed for Treg in any compartment. Conclusion: Our results suggest that alterations in lymphocyte distribution in
regional lymph nodes rather than at the primary tumour site may be relevant for patient prognosis. Moreover, we demonstrate that in addition to cellular immunity
humoral immune responses may be clinically relevant in anti-tumour immunity.
 
 
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2. Deutsche Einleitung:  Es wird angenommen, dass tumorinfiltrierende Lymphozyten eine Immunantwort gegen Antigene auf Tumorzellen vermitteln [1,2]. Insbesondere sollen CD8+ zytotoxische T-Zellen die hauptsächlichen Effektorzellen gegen die Tumorzellantigene sein. Diese Behauptung wird von der Beobachtung gestützt, dass zytotoxische Lymphozyten einen Indikator für eine gute Prognose in bestimmten Karzinomen darstellen. Andererseits sind tumorinfiltrierende regulatorische T-Lymphozyten mit einer schlechten Prognose bei Ovarialkarzinomen assoziiert [3-6]. Regulatorische T-Zellen wurden definiert als spezialisierte CD4+CD25+FoxP3+ T-Zell Subgruppe mit der Fähigkeit Effektor T-Zellen zu hemmen. Obwohl es zunehmend klar wird, dass regulatorische T-Zellen eine heterogene T-Zell Population darstellen, die auch FoxP3- Zellen enthält, wird die FoxP3 Expression immer noch als bester Einzelmarker für die Markierung von regulatorischen T-Zellen angesehen und die meisten Veröffentlichungen über die prognostische Relevanz von FoxP3 beruhen auf der Analyse von FoxP3+Zellen (insbesondere Gobert et. al.) [7]. Die meisten Arbeiten über tumorinfiltrierende Lymphozyten sind auf deren Analyse in Primärtumoren fixiert. Es wurde jedoch auch schon vermutet, dass Primärtumore außerhalb von lymphoretikulärem Gewebe größtenteils vom Immunsystem ignoriert werden und dass für eine tumorspezifische Immunantwort der Eintritt von malignen Zellen in sekundäre Lymphgewebe nötig ist [8]. Neuere Studien legen nahe, dass es Veränderungen in der Zusammensetzung von Lymphozyten in regionalen tumordrainierenden Lymphknoten gibt, die eine wichtige Rolle für die Prognose von Krebspatienten spielen können. Zum Beispiel ist bei Prostatakarzinomen das Immunprofil von lokalen tumordrainierenden Lymphozyten verändert, wenn man es mit nicht befallenen Lymphknoten und Kontrolllymphknoten von anderen Stellen vergleicht. Bemerkenswerterweise
 
5 enthielten befallene und unbefallene regionale Lymphknoten weniger CD20+ B-Zellen und mehr CD8+ T-Zellen als Kontrolllymphknoten [9]. Bei Magenkarzinomen konnte man eine erhöhte Anzahl von regulatorischen T-Zellen in tumordrainierenden Lymphknoten im Vergleich zu unbeteiligten mesenterialen Lymphknoten nachweisen [10]. In frühen Brustkrebsstadien zeigten Sentinel- und axilläre Lymphknoten einerseits eine verminderte Anzahl von CD4+und CD8+T-Zellen im Vergleich zu Kontrolllymphknoten, zum anderen wurden CD1a+ dentritische Zellen am häufigsten in unbefallenen axillären Lymphknoten gefunden. Einige dieser Beobachtungen konnten auch in Abwesenheit von metastatischen Absiedelungen nachgewiesen werden, insbesondere eine verminderte Anzahl von CD4+ Das deutet darauf hin, dass T-Zellen. Veränderungen im Immunprofil auch unabhängig von einer Tumorinvasion auftreten können. In dieser Arbeit korrelierten eine hohe Anzahl von CD4+Zellen und CD1a+dentritische Zellen besser mit dem krankheitsfreien Überleben als die axilläre Metastasierung selbst, was eine hohe prognostische Bedeutung des nodulären Immunprofiles nahelegt [11]. Die Plattenepithelkarzinome von Kopf und Hals stellen eine Gruppe von Tumoren da, die an verschiedenen Stellen wie Mundschleimhaut, Gaumen und Tonsillen auftreten können. Zudem sind insbesondere Tonsillenkarzinome mit einer Infektion durch humane Papillomviren assoziiert [12]. Eine dichte Infiltration mit Lymphozyten konnte als positiver prognostischer Marker bei Plattenepithelkarzinomen von Kopf und Hals identifiziert werden [13]. Insbesondere eine hohe Anzahl von CD3+ T-Zellen ging in einigen Veröffentlichungen mit einem verbessertem Überleben einher [14,15]. Die Rolle von CD8+ zytotoxischen T-Zellen ist noch unklar [16,17], aber es konnte bereits eine Reduktion von CD8+Lymphozyten in drainierenden Lymphknoten bei Plattenepithelkarzinomen von Kopf und Hals gezeigt werden [18]. In einer Arbeit
 
6 waren wider Erwarten FoxP3+ T-Zellen mit einem verbessertem regulatorische Überleben assoziiert. Gerade weil die Ergebnisse für verschiedene Tumorentitäten divergierend sind, hat sich bis jetzt noch kein klares Bild über die Rolle von tumorinfiltrierenden Lymphozyten ergeben. Es scheint, dass man die prognostische Bedeutung von TIL nicht nur in den soliden Primärtumoren selbst untersuchen sollte, sonder man sollte auch andere Faktoren wie die Zusammensetzung der TIL Subgruppen sowie deren Verteilung über unterschiedliche anatomische Regionen untersuchen. Diese Arbeit beschäftigt sich in Anbetracht des geringen Wissensstandes über die genannten Faktoren bei Kopf-/Halskarzinomen mit der morphologischen Verteilung und der prognostischen Bedeutung von FoxP3+ regulatorischen T-Zellen, verschiedenen T-Zell Subgruppen (CD3+,CD8+, GranzymB+) und Makrophagen (CD68+) in vier tumorbezogenen Kompartimenten: dem Primärtumor, Lymphknotenmetastasen, dem peritumoralen lymphatischen Gewebe von befallenen Lymphknoten und unbefallenen drainierenden Lymphknoten. Da einige Arbeiten einen positiven prognostischen Effekt von B-Zellen andeuten, schlossen wir auch B-Zellen (CD20+) in unsere Untersuchungen ein [19-21].            
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