Diversité génétique des souches de chlamydophila pecorum : recherche et identification des marqueurs épidémiologiques., Genetic diversity of chlamydophila pecorum strains : research and identification of epidemiological markers

De
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Sous la direction de Annie Rodolakis
Thèse soutenue le 12 octobre 2009: Tours
Chlamydophila pecorum est une espèce bactérienne intracellulaire obligatoire de la famille Chlamydiaceae. Le criblage d’une banque génomique de C. pecorum en utilisant un sérum ovin spécifique a permis d’identifier la protéine de la membrane d’inclusion (IncA) comme un candidat potentiel pour le sérodiagnostic de C. pecorum et de mettre en évidence une séquence répétée codante (CTR) riche en alanine et proline dans le gène incA de C. pecorum. Cette CTR présente des motifs d’acides aminés différents suivant la pathogénicité des souches de C. pecorum. La variabilité génétique de 19 souches de C. pecorum isolées de ruminant a été étudiée par MVLST (multi-virulence sequence typing). Les gènes ompA qui code pour la protéine majeure de la membrane externe, incA et l’ORF663 (cadre ouvert de lecture) permettent de différencier les souches pathogènes de C. pecorum des souches non-pathogènes. Cette hypothèse a été confirmée sur 32 autres souches comprenant 11 souches isolées de porcs. Les souches de C. pecorum isolées de lésions sont génétiquement différentes des souches isolées d’animaux asymptomatiques. Les 3 gènes ompA, incA et l’ORF663 sont des marqueurs moléculaire épidémiologiques potentiels qui pourraient être liés à la virulence de C. pecorum.
-Sequence repetee codante
Chlamydophila pecorum, an obligate intracellular bacterium belonged to Chlamydiaceae family. Screening of a genomic DNA library of C. pecorum by using a specific ovine serum, allowed to identify inclusion membrane protein (IncA) as a potential candidate for C. pecorum serodiagnosis and to highlight a coding tandem repeat (CTR) rich in alanine and proline in the C. pecorum incA gene. The CTR presents several amino acids motifs according to the pathogenesis of C. pecorum strains. The genetic variability of 19 C. pecorum strains isolated from ruminants was studied using MVLST (multi-virulence sequence typing) system. The genes ompA that code for the major outer membrane protein, incA and ORF663 (open reading frame) allowed to distinguish the pathogenic C. pecorum strains from non-pathogenic strains. This hypothesis was confirmed on additional 32 strains including 11 strains isolated from swine. The C. pecorum strains isolated from clinical cases are genetically different from strains isolated from healthy animals. ompA, incA and ORF663 genes are epidemiological molecular markers which could be related to the virulence of C. pecorum.
Source: http://www.theses.fr/2009TOUR4012/document
Publié le : dimanche 30 octobre 2011
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UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS


ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences, Technologies
ÉQUIPE : Cellule de recherche appliquée – Vaccin Diagnostic
INRA – IASP, Nouzilly

THÈSE présentée par :
Khalil YOUSEF MOHAMAD

soutenue le : 12 octobre 2009


pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François - Rabelais
Discipline/ Spécialité : Sciences de la vie et de la santé

Diversité génétique des souches de
Chlamydophila pecorum:
Recherche et identification des marqueurs
épidémiologiques

THÈSE dirigée par :
Mme. RODOLAKIS Annie Directeur de Recherche, INRA, Nouzilly

RAPPORTEURS :
M. DENAMUR Erick Professeur, Université Paris 7, Paris
M. POSPISCHIL Andreas Professeur, Université Zurich, Zurich, Suisse


JURY :
M. DENAMUR Erick Professeur, Université Paris 7, Paris
M. GARIN-BASTUJI Bruno Directeur de Recherche, AFSSA, Maison Alfort
M. POSPISCHIL Andreas Professeur, Université Zurich, Zurich, Suisse
M. RASSCHAERT Denis Professeur, Université François-Rabelais, Tours
Mme. RODOLAKIS Annie Directeur de Recherche, INRA, Nouzilly

1 Remerciements
Ce travail a été réalisé sous la direction de Dr. Annie Rodolakis, directrice de recherche, et
responsable de l’équipe Cellule de recherche appliquée- vaccin, diagnostic dans l’unité de recherche
Infectiologie animale et santé publique du centre INRA, Nouzilly, France et soutenu par une bourse
financée par l’université d’Al-Furat, Syrie.

Je remercie tout d’abord Annie Rodolakis, pour m’avoir accueilli au sein de son laboratoire pendant
ces 4 années de thèse. Elle a toujours été disponible pour moi, malgré un emploi du temps assez
chargé. Merci Annie pour ton soutien, ta patience et surtout la rigueur scientifique que tu m’as
enseigné.

Je voudrais ensuite remercier les rapporteurs M. Denamur et M. Pospichil et les examinateurs M.
Bruno et M. Rasschaert constituant mon jury de thèse pour m’avoir faire l’honneur d’accepter
d’évaluer ce travail et également aux membres de mon comité de thèse M. Cloeckaert, M. De Ryke, M.
Berri, M. Guatteo et Mme. Laroucau pour avoir suivi ce travail.

Je remercie Abdessalem Rekiki, pour son engagement dans une bonne partie de ce travail. Merci
Abdessalem pour toutes les discussions scientifiques et non scientifiques pendant les deux premières
années de la thèse.

Je tiens à remercie Denis Cochonneau, c’était un plaisir de partager le même bureau avec toi et de
discuter de nos sujets respectifs. Merci pour ta bonne humeur et aussi pour les corrections en
français.

Je tiens aussi à remercier Mustafa Berri pour sa disponibilité et sa sympathie et pour toutes
discussions scientifiques très intéressantes.

Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance aux membres de l’unité IASP-311 pour leurs conseils.

A l’issu de cette thèse, j’aimerais remercier tous ceux qui, d’une façon ou d’une autre, ont participé à
sa réalisation.

Merci AbdulRahman, pour les bons moments passés durant les 6 années en France.

Enfin, je tiens à remercier toute ma famille en Syrie et en France en particulier ma femme Jawhara
pour m’avoir encouragé pendant ces années très longues.
2 Résumé
Chlamydophila pecorum est une espèce bactérienne intracellulaire obligatoire de la famille
Chlamydiaceae. Le criblage d’une banque génomique de C. pecorum en utilisant un sérum
ovin spécifique a permis d’identifier la protéine de la membrane d’inclusion (IncA) comme un
candidat potentiel pour le sérodiagnostic de C. pecorum et de mettre en évidence une
séquence répétée codante (CTR) riche en alanine et proline dans le gène incA de C. pecorum.
Cette CTR présente des motifs d’acides aminés différents suivant la pathogénicité des souches
de C. pecorum.
La variabilité génétique de 19 souches de C. pecorum isolées de ruminant a été étudiée par
MVLST (multi-virulence locus sequence typing). Les gènes ompA qui code pour la protéine
majeure de la membrane externe, incA et l’ORF663 (cadre ouvert de lecture) permettent de
différencier les souches pathogènes de C. pecorum des souches non-pathogènes. Cette
hypothèse a été confirmée sur 32 autres souches comprenant 11 souches isolées de porcs.
Les souches de C. pecorum isolées de lésions sont génétiquement différentes des souches
isolées d’animaux asymptomatiques. Les 3 gènes ompA, incA et l’ORF663 sont des
marqueurs moléculaire épidémiologiques potentiels qui pourraient être liés à la virulence de
C. pecorum.

Mot-clés : Chlamydophila pecorum, diagnostic, marqueur moléculaire, pathogénicité,
MVLST, incA, ompA, ORF663, séquence répétée codante













3 Abstract
Chlamydophila pecorum, an obligate intracellular bacterium belonged to Chlamydiaceae
family. Screening of a genomic DNA library of C. pecorum by using a specific ovine serum,
allowed to identify inclusion membrane protein (IncA) as a potential candidate for C.
pecorum serodiagnosis and to highlight a coding tandem repeat (CTR) rich in alanine and
proline in the C. pecorum incA gene. The CTR presents several amino acids motifs according
to the pathogenesis of C. pecorum strains.
The genetic variability of 19 C. pecorum strains isolated from ruminants was studied using
MVLST (multi-virulence locus sequence typing) system. The genes ompA that code for the
major outer membrane protein, incA and ORF663 (open reading frame) allowed to distinguish
the pathogenic C. pecorum strains from non-pathogenic strains. This hypothesis was
confirmed on additional 32 strains including 11 strains isolated from swine.
The C. pecorum strains isolated from clinical cases are genetically different from strains
isolated from healthy animals. ompA, incA and ORF663 genes are epidemiological molecular
markers which could be related to the virulence of C. pecorum.

Keywords: Chlamydophila pecorum, diagnosis, molecular marker, pathogenesis, MVLST,
incA, ompA, ORF663, coding tandem repeats



















4 Table des matières
Remerciements ......................................................................................................................... 2
Résumé ...................................................................................................................................... 3
Abstract ..................................................................................................................................... 4
Table des matières.................................................................................................................... 5
Liste des figures ........................................................................................................................ 8
Liste des tableaux ..................................................................................................................... 9
Introduction ............................................................................................................................ 13
Revue bibliographique........................................................................................................... 14
Chapitre 1 : Historique et taxonomie de Chlamydiae ......................................................... 15
1. L’historique de Chlamydiae............................................................................................... 15
2. La taxonomie de Chlamydiae............................................................................................. 16
3. Identification des marqueurs épidémiologiques.............................................................. 21
3.1. Sérotypage..................................................................................................................... 22
3.2. Génotypage.................................................................................................................... 22
3.2.1. Hybridation ADN/ADN ......................................................................................... 22
3.2.2. RAPD (Ramdom Amplification of Polymorphic DNA)........................................ 23
3.2.3. PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis)................................................................ 23
3.2.4. AFLP (amplified fragment length polymorphism) ................................................ 24
3.2.5. Profil de restriction de l’ADN génomique total (RFLP)........................................ 24
3.2.6. PCR- RFLP ............................................................................................................ 25
3.2.7. MLST (Multi- Locus Sequences Typing) .............................................................. 25
3.2.8. VNTR (Variable number tandem repeats) ............................................................. 26
3.2.9. Les puces à ADN (Microarray).............................................................................. 28
Chapitre 2 : Biologie des Chlamydiae ................................................................................... 30
1. Les différentes formes de Chlamydiae............................................................................. 30
1.1. Les corps élémentaires (CE) ..................................................................................... 30
1.2. Les corps réticulés (CR)............................................................................................ 30
2. Le cycle de développement des Chlamydiae ................................................................... 31
2.1. L’attachement de la bactérie à la cellule hôte ........................................................... 33
2.2. L’ingestion des CE dans la cellule hôte .................................................................... 34
2.3. La transformation des CE en CR............................................................................... 35
2.4. La multiplication des CR et les activités métaboliques............................................. 35
5 2.5. La différenciation des CR en CE............................................................................... 38
2.6. La libération des CE dans le milieu extracellulaire................................................... 38
2.7. Inhibition de l’apoptose de la cellule hôte ................................................................ 39
2.8. La persistance............................................................................................................ 39
Chapitre 3 : Les antigènes des Chlamydiae.......................................................................... 43
1. Les antigènes non protéiques ........................................................................................... 43
1.2. Le lipopolysaccharide (LPS)..................................................................................... 43
1.3. Le glycolipide............................................................................................................ 44
1.4. Le peptidoglycane (PG) ............................................................................................ 44
2. Les antigènes protéiques .................................................................................................. 45
2.1. La protéine majeure de la membrane externe (MOMP)............................................ 45
2.2. Les protéines riches en cystéines (Omp3 et Omp2).................................................. 46
2.3. Les protéines polymorphiques de la membrane externe POMP (polymorphic
membrane proteins Pmp) ................................................................................................. 48
2.5. La Porine (PorB) ....................................................................................................... 49
2.6. La Mip (macrophage infectivity potentiator) ............................................................ 49
2.4. Les protéines de choc thermique............................................................................... 50
2.5. Les protéines de la membrane d’inclusion................................................................ 52
3. Le système de sécrétion de type III (T3S) et les projections de surface .......................... 55
Chapitre 4 : Les infections à Chlamydiae............................................................................. 58
1. Les manifestations cliniques ............................................................................................ 58
1.1. Chlamydia trachomatis ............................................................................................. 58
1.2. Chlamydia muridarum .............................................................................................. 58
1.3. Chlamydia suis .......................................................................................................... 59
1.4. Chlamydophila psittaci ............................................................................................. 59
1.5. Chlamydophila abortus............................................................................................. 60
1.6. Chlamydophila pneumoniae...................................................................................... 60
1.7. Chlamydophila caviae............................................................................................... 61
1.8. Chlamydophila felis................................................................................................... 61
1.9. Chlamydophila pecorum ........................................................................................... 62
2. Le diagnostic de Chlamydiae ........................................................................................... 65
2.1. Le diagnostic direct ................................................................................................... 65
2.2. Le diagnostic indirect ................................................................................................ 69
Résultats .................................................................................................................................. 72
6 Article 1. La protéine de la membrane d'inclusion IncA peut être considérée comme un
antigène candidat pour le sérodiagnostic de Chlamydophila pecorum ............................ 73
Article 2. Identification et caractérisation d’une séquence répétée codante variable du
gène incA de Chlamydophila pecorum............................................................................. 87
Article 3. Identification phylogénétique préliminaire des souches virulentes de
Chlamydophila pecorum .................................................................................................. 98
Article 4. Les gènes ompA, incA et ORF663 sont des marqueurs moléculaires
épidémiologiques potentiels de Chlamydophila pecorum ............................................. 107
Discussion générale .............................................................................................................. 128
Conclusion et perspectives................................................................................................... 133
Références bibliographiques ............................................................................................... 134
Annexes ................................................................................................................................. 171
Communications scientifiques............................................................................................. 207













7 Liste des figures
Figure 1 : Nouvelle (1a) et ancienne (1b) taxonomie des Chlamydiaceae (Bush and Everett,
2001)......................................................................................................................................... 20
Figure 2 : Cycle de développement de Chlamydia (Mpiga and Ravaoarinoro, 2006)............ 32
Figure 3 : Les activités métaboliques des CR ......................................................................... 37
Figure 4 : Persistance in vivo des Chlamydiae ........................................................................ 42
Figure 5 : Modèle schématique de l’enveloppe des CE de C. psittaci 6BC (Everett and Hatch,
1995)......................................................................................................................................... 47
Figure 6 : La protéine IncA de Chlamydiae ............................................................................ 54
Figure 7 : La domaine hydrophobe de la protéine IncA.......................................................... 54
Figure 8 : Structure putative de la « machinerie » de T3S de Chlamydiae dérivée de T3S de
Yersinia et de Salmonella (Peters et al., 2007)......................................................................... 57
Figure 9 : Les inclusions des Chlamydiae colorées par l’acridine orange .............................. 67
Figure 10 : Les inclusions des Chlamydiae colorées par l’immunofluorescence ................... 67













8 Liste des tableaux
Tableau 1 : Principales étapes de la taxonomie de Chlamydiae et méthodes utilisées pour ces
classifications. .......................................................................................................................... 19
Tableau 2 : Caractéristiques des corps élémentaires et des corps réticulés. ........................... 31
Tableau 3 : Modes de persistance in vitro des différentes espèces de Chlamydiae (Hogan et
al., 2004)................................................................................................................................... 41
Tableau 4 : Signes cliniques induits par C. pecorum chez ddifférentes espèces animales ..... 62






































9 Liste des abréviations

ADN: Acide Désoxyribonucléique
ADP: Adénosine Di- Phosphate
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphilsm
AGA: Alanine- Glycine- Alanine
APA: Alanine- Proline- Alanine
APAPE: Alanine- Proline- Alanine- Proline- Glutamate
APE: Alanine- Proline- Glutamate
APEVPA: Alanine- Proline- Glutamate- Valine- Proline- Alanine
ARN: Acide Ribonucléique
ARNm: Acide ribonucléique messager
AroC: Chorismate synthase
ATP: Adénosine Tri- Phosphate
CCA: Chlamydial Cytadhesin
CE: Corps élémentaire
CFT: Complement fixation test
CopN: Chlamydial outer protein
CPAF: Chlamydial Proteasome-like Activity Factor
CR: Corps réticulé
CTR: Coding tandem repeats
DP: Aspartate-Proline
DV: Domaines variables
Efp: Translation elongation factor P
ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay
EP: Glutamate-Proline
FAT: Fluorescente Antibody Test
Fts: Filmentation Thermo- Sensible
FXXN: Phenylalanine-X-X-Asparagine
GAG: Glycosaminoglycane
Gap: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GBS: Group B streptococcus
GGAI Glycine-Glycine-Alanine-Isoleucine
GLXA: Glycolipid exoantigen
HemD: Uroporphyrinogen-III synthase
Hsp (10, 60, 70): Heat shock protein
HtrA: Heat shock- induced serine protease
IAPs: Inhibitors of Apoptosis Proteins
IF: Immuno-fleuroscence
Inc (A, B, C …): Inclusion membrane protein
LGV: Lymphogranulomatose vénérienne
LPS: Lipopolysaccharide
KDO: Acide 3-deoxy-D-manno-octulosonic
KELPS: Lysine-Glutamate-Leucine-Proline-Serine
KESSP: Lysine-Glutamate-Serine-Serine-Proline
KEPLP: Lysine-Glutamate-Proline-Leucine-Proline
KESSS: Lysine-Glutamate-Serine-Serine-Serine
KEPSS: Lysine-Glutamate-Proline-Serine-Serine
KKPSP: Lysine-Lysine-Proline-Serine-Proline
MIF: Micro-immuno-fleuroscence
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