Dynamique d'hybridation dans le complexe d'espèces des chênes blancs européens : chênes pédonculés - Quercus robur L., sessiles - Q. petraea (Matt.) Liebl., pubescents - Q. pubescens Willd. et tauzins - Q. pyrenaica Willd, Hybridisation dynamics in the European white oak species complex : pedunculate oak - Quercus robur L., sessile - Q. petraea (Matt.) Liebl., pubescent - Q. pubescens Willd. and pyrenean - Q. pyrenaica Willd

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Publié par

Sous la direction de Antoine Kremer, Sophie Gerber
Thèse soutenue le 26 septembre 2008: Bordeaux 1
L’hybridation est un processus aux conséquences diverses sur l’évolution des espèces qui est difficile à étudier lorsque les espèces se distinguent mal au niveau morphologique. Afin de comprendre le rôle de l'hybridation dans l’évolution du complexe d’espèces des chênes blancs européen, nous avons utilisé des outils de la génétique des populations pour quantifier les flux de gènes interspécifiques contemporains et étudier le système de reproduction de quatre espèces. Un protocole d'analyse génétique rapide a été développé et des méthodes d’assignations génétiques, permettant de déterminer l’espèce de chaque arbre et d’identifier les hybrides, ont été testées par simulations. Cette méthode a été appliquée en populations naturelles révélant un pourcentage d'hybrides variant de 10 à 30% en fonction des populations et impliquant tous les couples d'espèces. Nous avons montré que les effectifs des espèces dans les parcelles influencent la dynamique d'hybridation et la directionalité de l'introgression. Nous avons étudié le système de reproduction de ces espèces en croisements contrôlées et en forêt pour expliquer le maintien des espèces malgré la présence de flux de gènes interspécifiques. L'existence de plusieurs barrières reproductives contribue à un isolement partiel des espèces qui dépend principalement de barrières pré-reproductives et prézygotiques. Une analyse de paternité pratiquée sur des descendances récoltées en forêt montre que l'hybridation de première génération est rare mais que ces hybrides F1 sont fertiles et se reproduisent principalement avec l'une des espèces parentales, produisant de nombreux rétrocroisements qui expliquent le fort pourcentage d'hybrides observé dans les populations naturelles étudiées. L'hybridation et l'introgression sont donc des processus à l'œuvre chez les chênes qui contribuent à l'évolution du complexe d'espèces.
-Hybridation
-Introgression
-Délimitation d'espèces
-Assignation génétique
-Analyse de paternité
-Microsatellites
-Chênes
-Quercus
Hybridisation is a complex process with diverse consequences on species evolution. Hybridisation is difficult to study when species are not clearly morphologically distinguished. Our aim was to study the role of hybridisation in the evolution of the European white oak species complex. We used population genetic tools to quantify contemporary interspecific gene flow and to study the mating system of four oak species. A fast genetic analysis protocol was developed and genetic assignment methods were first tested by simulation and then used to determine the species of each tree and to identify hybrids. These methods revealed that hybrid percentages were between 10 to 30% depending on the natural population studied and that all species pairs were involved. We showed that the census number of species in the stands had an influence on hybridisation dynamics and on introgression direction. We studied the mating system of these species in controlled crosses and in the forest to understand the maintenance of species despite interspecific gene flow. Several reproductive barriers contribute to a partial isolation of species, mostly pre-reproductive and prezygotic. A paternity analysis of maternal progenies sampled in the forest showed that first generation hybridisation was rare but that F1 hybrids were fertile and were mating mostly with one of the two parental species, creating numerous backcrosses that explain the high percentages of hybrids observed in the natural populations studied. Hybridisation and introgression are active processes in oaks and contribute to the evolution of the species complex.
-Hybridisation
-Introgression
-Species delineation
-Genetic assignment
-Paternity analyses
-Microsatellites
-Oaks
-Quercus
Source: http://www.theses.fr/2008BOR13624/document
Publié le : mardi 25 octobre 2011
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N° d’ordre :




THÈSE
présentée à
L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1
ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES ET ENVIRONNEMENTS (ED304)
par Olivier LEPAIS
POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR
SPÉCIALITÉ : ÉCOLOGIE ÉVOLUTIVE, FONCTIONNELLE ET DES COMMUNAUTÉS


Sujet :
Dynamique d'hybridation dans le complexe d'espèces
des chênes blancs européens

Chênes pédonculés - Quercus robur L., sessiles - Q. petraea (Matt.) Liebl.,
pubescents - Q. pubescens Willd. et tauzins - Q. pyrenaica Willd.




Soutenue le 26 septembre 2008


Après avis de :

M. Joël CUGUEN Professeur, Université de Lille 1 Rapporteur
M. Christophe THÉBAUD Professeur, Université Paul Sabatier Toulouse Rapporteur

Devant la commission d’examen formée de :

M. Joël CUGUEN Professeur, Université de Lille 1 Rapporteur
M. Christophe THÉBAUD Professeur, Université Paul Sabatier Toulouse Rapporteur
Mme Marie-Laure DESPREZ-LOUSTAU Directrice de recherche, INRA Bordeaux Examinatrice
M. Jean-Pierre RENAUDIN Professeur, Université Bordeaux 1 Examinateur
Mme Réjane STREIFF Chargée de recherche, INRA Montpellier Examinatrice
Mme Sophie GERBER Chargée de recherche, INRA Bordeaux (Directrice de thèse) Examinatrice



UMR INRA 1202 BIOGECO

Equipe de génétique
69 route d'Arcachon
F-33612 CESTAS Cedex
2
Table des matières



Remerciements ............................................................................................... 7
Prologue ......................................................................................................... 9
Chapitre 1- Introduction................................................................................ 11
1.1. Synthèse bibliographique.......................................................................................................... 13
1.1.1. Espèce et spéciation.......................................................................................................... 13
1.1.2. Hybridation......................................................................................................................... 20
1.1.3. Conclusion ......................................................................................................................... 25
1.2. Modèle d'étude : le complexe d'espèces des chênes blancs européens ................................. 26
1.2.1. Présentation du genre Quercus......................................................................................... 26
1.2.2. Le complexe d’espèces des chênes blancs ...................................................................... 27
1.3. Objectif de la thèse ................................................................................................................... 38
PARTIE A - MÉTHODOLOGIE........................................................................ 41
Chapitre 2- Marqueurs génétiques discriminant les espèces de chênes......... 43
2.1. Introduction................................................................................................................................ 45
2.2. Mise au point d'une méthode de génotypage rapide................................................................ 46
2.2.1. Sélection de microsatellites différenciant les espèces de chênes..................................... 46
2.2.2. Sélection de microsatellites sur critères techniques.......................................................... 48
2.2.3. Mise au point du protocole................................................................................................. 50
2.3. Normalisation des données entre projets ................................................................................. 53
2.4. Calcul du taux d'erreur de génotypage ..................................................................................... 54
2.4.1. De la prise de conscience de l'erreur en génétique des populations ................................ 54
2.4.2. Estimation du taux d'erreur de génotypage....................................................................... 55
2.4.3. Conséquences des erreurs dans les analyses génétiques ............................................... 57
2.5. Conclusion................................................................................................................................. 58
Chapitre 3- Tests d'assignation génétique des espèces et des hybrides........ 61
3.1. Introduction................................................................................................................................ 63
3.2. Revue des principales méthodes d'assignation........................................................................ 64
3.2.1. Introduction ........................................................................................................................ 64
3.2.2. Classification – assignation supervisée............................................................................. 65
3.2.3. Clustering – assignation non supervisée........................................................................... 66
3.2.4. Délimitation spatiale des populations ................................................................................ 66
3.2.5. Détection des hybrides ...................................................................................................... 67
3.2.6. Conclusion ......................................................................................................................... 67
3.3. Comparaison de méthodes d'assignation................................................................................. 69
3.3.1. Introduction ........................................................................................................................ 69
3.3.2. Matériels et méthodes ....................................................................................................... 69
3.3.3. Résultats et discussions .................................................................................................... 71
3.3.4. Conclusion ......................................................................................................................... 73
3.4. Tests de sensibilité pour l'identification de deux espèces ........................................................ 76
3.4.1. Introduction ........................................................................................................................ 76
3.4.2. Matériels et méthodes ....................................................................................................... 76
3.4.3. Résultats et discussions .................................................................................................... 81
3.4.4. Conclusion ......................................................................................................................... 83
3.5. Identification des hybrides au sein d'un complexe d'espèces .................................................. 84
3.5.1. Introduction ........................................................................................................................ 84
3.5.2. Matériels et méthodes ....................................................................................................... 84
3.5.3. Données génétiques.......................................................................................................... 84
3.5.4. Résultats et discussions .................................................................................................... 86
3.5.5. Conclusion ......................................................................................................................... 91
3.6. Conclusion générale ................................................................................................................. 92
3 PARTIE B – DÉLIMITATION DES ESPÈCES, ASSIGNATION GÉNÉTIQUE EN
POPULATIONS .............................................................................................. 95
Chapitre 4- Hybridation en populations naturelles ........................................ 97
4.1. Introduction................................................................................................................................ 99
4.2. Matériels et méthodes............................................................................................................. 102
4.2.1. Echantillonnages.............................................................................................................. 102
4.2.2. Génotypage ..................................................................................................................... 102
4.2.3. Assignation des individus ................................................................................................ 103
4.2.4. Analyse phylogénétique................................................................................................... 103
4.2.5. Caractérisation de l'hybridation dans les parcelles ......................................................... 103
4.3. Résultats ................................................................................................................................. 106
4.3.1. Assignation génétique des individus................................................................................ 106
4.3.2. Relations génétiques entre espèces, hybrides et populations ........................................ 111
4.3.3. Caractéristiques génétiques des hybrides dans les parcelles......................................... 112
4.4. Discussion............................................................................................................................... 120
4.4.1. Taux d'hybridation comparé entre populations................................................................ 120
4.4.2. Caractéristiques des hybrides ......................................................................................... 121
4.4.3. Hybridation hors zone de sympatrie ................................................................................ 121
4.4.4. Hybridation et introgression fréquence-dépendante........................................................ 122
Chapitre 5- Conséquences phénotypiques et génétiques de l'hybridation dans
une parcelle................................................................................................ 125
5.1. Introduction - Caractéristiques générales du bois de Briouant............................................... 127
5.2. Morphologie foliaire................................................................................................................. 137
5.3. Structure génétique................................................................................................................. 142
5.3.1. Méthodes ......................................................................................................................... 142
5.3.2. Résultats et discussions .................................................................................................. 142
5.4. Structure génétique spatiale fine ............................................................................................ 146
5.4.1. Méthodes ......................................................................................................................... 146
5.4.2. Résultats et discussions .................................................................................................. 147
5.5. Conclusion............................................................................................................................... 151
PARTIE C – SYSTÈME DE REPRODUCTION ................................................. 153
Chapitre 6- Flux de gènes interspécifiques en conditions contrôlées .......... 155
6.1. Introduction.............................................................................................................................. 157
6.2. Matériels et méthodes............................................................................................................. 158
6.2.1. Croisements contrôlés chez les chênes .......................................................................... 158
6.2.2. Chênes utilisés dans les croisements ............................................................................. 158
6.2.3. Plan de croisement .......................................................................................................... 160
6.2.4. Analyses génétiques........................................................................................................ 161
6.2.5. Analyses statistiques ....................................................................................................... 162
6.3. Résultats ................................................................................................................................. 164
6.3.1. Identification des pères.................................................................................................... 164
6.3.2. Compatibilité génétique ................................................................................................... 165
6.3.3. Compétition pollinique ..................................................................................................... 166
6.3.4. Taux de germination et de survie .................................................................................... 169
6.3.5. Isolement reproducteur.................................................................................................... 171
6.4. Conclusion............................................................................................................................... 172
Chapitre 7- Flux de gènes interspécifiques en population naturelle ............ 175
7.1. Introduction.............................................................................................................................. 177
7.2. Matériels et méthodes............................................................................................................. 177
7.2.1. Parcelle étudiée ............................................................................................................... 177
7.2.2. Observations de la phénologie du débourrement............................................................ 178
7.2.3. Echantillonnages.............................................................................................................. 179
7.2.4. Suivi de germination des glands...................................................................................... 181
7.2.5. Génotypage des glands et des plantules ........................................................................ 182
7.2.6. Assignation génétique des glands et des plantules......................................................... 183
7.2.7. Analyse de paternité ........................................................................................................ 184
7.2.8. Analyse de parenté.......................................................................................................... 184
7.2.9. Identification directe des événements de reproduction ................................................... 185
7.2.10. Corrélation de paternité intra- et inter-familles .............................................................. 186
7.3. Résultats ................................................................................................................................. 186
4 7.3.1. Phénologie des espèces et des hybrides ........................................................................ 186
7.3.2. Caractéristiques des descendances étudiées ................................................................. 190
7.3.3. Assignation génétique des glands................................................................................... 192
7.3.4. Analyse de paternité ........................................................................................................ 195
7.3.5. Analyse de parenté.......................................................................................................... 202
7.3.6. Synthèse des événements de reproduction détectés ..................................................... 205
7.3.7. Corrélations de paternité intra-famille.............................................................................. 208
7.3.8. Différenciations des nuages polliniques .......................................................................... 209
7.4. Discussion............................................................................................................................... 211
Chapitre 8- Conclusion générale ................................................................. 217
8.1. Synthèse des résultats obtenus.............................................................................................. 219
8.1.1. Délimitation des espèces et assignation ......................................................................... 219
8.1.2. Hybridation – introgression .............................................................................................. 220
8.1.3. Isolement reproducteur.................................................................................................... 221
8.2. Conséquences de l'hybridation sur l'évolution du complexe d'espèces ................................. 223
Références bibliographiques .......................................................................... 225
ANNEXES .................................................................................................... 235
ANNEXE 1 - Résultats complets des croisements contrôlés......................................................... 236
ANNEXE 2 - Identification des deux générations d'hybrides......................................................... 238
ANNEXE A – Lepais et al., Silvae Genetica, 55, 4-5, 2006........................................................... 240
ANNEXE B - Lepais et al., Les Actes du BRG, 6, 543-557, 2006. ................................................ 243
ANNEXE C - Viscosi et al., Plant Biosystems (in press)................................................................ 259
ANNEXE D – Rekik et al., Hortscience (2008) .............................................................................. 275
ANNEXE E – Terrab et al., American Journal of Botany (2008).................................................... 277
Résumé ...................................................................................................... 279

5 Remerciements
Je tiens en premier lieu à remercier Sophiqe uiG ear bderi rigé cette thèse. Ton soutien au etq uotidien
ta disponibilité pendant ces quatre années odnétc iséiftsé à l’aboutissement du travail.

Merci à Antoine Kremer, directeur du laboratoei rem, ’avdoir accueilli au sein de l’unité et dr e m’avoi
permis de concrétiser ce projet de recherche.ec omTmesa ndrations et tes remarques lors de la
définition du sujet et à plusieurs étapes d ué tapireonjet tencourageantes et motivantes.
Un grand merci à Rémy Petit, directeur de gl'énéqétuiiqpuee , pour les nombreuses discussions
scientifiques et son intérêt pour ce travailh edrceh er.e c

Mes remerciements vont aux membres de mon com itéh èsdee Christophe Andalo, Stuart Baird,
Marie Etienne, Vincent Badeau, qui lors de dneiuoxn s rému’ont permis de faire le point et de
continuer avec un œil neuf.
Merci aux rapporteurs Joël Cuguen et Christophe baTudh éainsi qu’aux examinateurs Marie-Laure
Desprez-Loustau, Réjane Streiff et Jean-Pierrued inR enda’avoir accepté d’évaluer ce travail.

J’ai pu préparer ce doctorat grâce à une bomuirnsies tèdreu (bourse MNRT) de l’école doctorale
Sciences et Environnement. Un contrat d’ATERR àd esl ’UFSciences Biologies de l’Université
Bordeaux 1 m'a permis d’approfondir mon trava il anunnéee supplémentaire et de goûter au
stimulant métier d’enseignant.

Les diverses étapes des expériences de cette ontth èséeté financées par divers projets : Projet BRG,
200 4-2006 ("Impact de l'écologie, de l'h isdtoui rem oedte de gestion des populations sur léa diversit
en forêts fragmentées.") ; Projet européen OAK,F L2OW001-2004 ("Intra & interspecific gene flow in
oaks as mechanisms promoting genetic diversitya daapndti ve potential", coordination A. Kremer,) ;
Projet Inter-régional Aquitaine / Midi-Pyrénée0s,4- 22005 ("Evolution de la diversité des for êts sous
l'effet des changements globaux, changements ed 'eut sagchangements climatiques") ; projet ANR
QDiv, 2006-2008 ( "Quantification of the effe ctgsl oboafl change on plant diversity"). Les analyses
génétiques ont été effectuées à la plateforme nodtey paGgeé et de Séquençage de Bordeaux
(financement du Conseil Régional d'Aquitaine n°0230034002FA et 20040305003FA et de l'Union
Européenne FEDER n°2003227).

Cette thèse est le fruit d’un travail collelcutsifie uàr s pétapes du projet.
Je remercie en premier lieu Guy Roussel qusié al ’enréseamlible des croisements contrôlés et pour
toute l’aide en pépinière, au labo graine oute rrsauirn .l eTon ingéniosité pare à tous les perto blèmes
ta vision intime des chênes m’ont ouvert d’earustprecs tivpes. Le dur labeur fut bien agréable.
La connaissance du terrain de l’UMR DYNAFOR (Dynqaumei forestière dans l’espace rurale) a été
décisive dans la réalisation de cette thèse.à MJeérrcôi me Willm pour sa participation aux divers
échantillonnages à Briouant ainsi que son invemesetinsts important dans la cartographie et la collecte
de données des parcelles de la Paguères et .Br ioJuea ntiens également à remercier Maya Gonzalez,
Julie Saurel, Laurent Brunel, Alain Cabanette raertd GBaélent. Merci également aux propriétaires de
nous avoir permis d’accéder à leur parcelle éteutd iaunxts de la formation des ingénieurs for estiers
(FIF ENGREF).
Un grand merci à Jean Marc Louvet pour sa tpioarnt icaipua travail de terrain et son intérêt pour la
comparaison des méthodes de cartographie.
Merci aux personnels de l’unité ExpérimentaleH erdme ital’ge pour leur participation aux croisements
contrôlés, à travers leur soutien technique eint h(iurrmigaation, fertilisation, préparation du ieml,a tér
nacelle…).
Merci à toutes les « petites mains » qui mm’onpta gnaécec olors de certaines étapes longues et
fastidieuses. François Hubert et Delphine Vinoceunrt l’péchantillonnage des jamais trop nombreux
7 glands. Mimi pour l’aide à l’empochage de ce ndtaei nebsranches à 20 mètres du sol. Florian Alberto
pour les 14 mesures sur les 3300 feuilles. HFurbaenrtç oipsour la mise au point de l’extraction sur
glands et les centaines d’extractions d’ADN. Màe rcPia trick Léger, Pierre Yves Dumoulin et Franck
Salin pour leur participation au génotypage.à MVearlcéir ie Léger pour l’aide lors du développement
technique. Merci à Erwan Guichoux, Florian eAt lbeJretsos ica Lavabre pour le partage des données
qui ont permis l’émergence de nouvelles persps.ec tiLve travail présenté dans cette thèse eset enrichi
grâce aux expériences de plusieurs stagiaires qauvi ec j’ai eu le plaisir de travailler : Jessica
Lavabre, Phillipe Matter, Séverine Mary.
Merci également à Alexis Ducousso, Pauline GaGrnéireér,- Henri Caron, Arndt Hampe, Carlos Magni,
Manuela Casasoli, Catherine Bodénès, Sabine DumMarsi,e Pierre Reviron, Jean Pierre Rossi et Alain
Franc pour leur conseils et remarques qui mu'conutp baeiadé. Merci également à l'équipe de choc au
secrétariat : Corinne, Véronique, Annie, Dan ièlFe loeretnce. Merci plus généralement à tous les
collègues de Pierroton pour la bonne ambian ceb oeuti llloennement scientifique.

Je remercie Martin Lascoux pour son invitationon eta ccsueil au laboratoire à Uppsala ainsi que
Susanne Gustafsson pour son soutien au laboc e.su r Meprlcai Martin de m’avoir initié aux coutumes
suédoises et au mode de vie expatrié du chCer chseéujor.ur m’a beaucoup conforté dans ma
motivation pour la recherche.

Merci à Erwan, Mimi, Jérôme pour le partage redues esn omhebures au bureau à Jérémy pour ces
nombreux conseils.

èmeMerci à Emmanuelle Eveno pour m’avoir entrain él ’odrganansisation du 11 European Meeting of
PhD Student of Evolutionary Biolog yà Bordeaux (2005). Ce fût une expérience ti ntiennosueb lieable tant
au niveau organisationnel que scientifique. M erEcir icà Bazin, Emmanuelle Billard, Stéphane De Mita,
Julien Dutheil, Baptiste Faure, Matthieu Faurel pheitn e DMuths pour la longue organisation à
distance et la sympathique semaine passée deaun s dlee lf'action. Un grand merci à Florence pour son
implication dans le casse-tête de la gestioniè refi ndanec ce colloque.

Merci aux collègues de l’université pour leure t aildeeu r accompagnement pour la préparation des
cours et des divers TP et TD : Emmanuelel,e RSeovpahrdiee llJaverzat, Patrick Auguste, Sophie North
et Annabelle Redonnet. Merci au personnel du eDméepnatr tUniversitaire des Sciences d’Agen pour
leur accueil et leur soutien : Carine Ferraannde, DViovmiec, Yves Gillis, Daniel Gastou et Françoise
Marc.

Mes remerciements les plus profonds vont à M.n Maest soM. Laporte-Cru pour m'avoir transmis leur
passion de la biologie et de l'écologie.

Merci à toutes aux personnes avec qui j’ai pdaer tagbéo ns moments aussi bien au labo qu’à
l’extérieur : Manu, Laurent, Antonio, Igor, JePaanb loF,r ançois, Iria, Luis, Marcello, Tristainne,, Delph
Le Jeune, Thibault, MH, Fabiano, Ana Luisa,n uJeul aent MNaoki.
Merci aux colloc’ Muriel et Hakim pour leur per ésaegnrcéable bien que relative.
Merci Marie & Jeff, Brice & Séverine, Jérômen e& pCoéulir m’avoir permis de revenir un peu sur terre
de temps en temps.

Merci à toi ma Cécile.

Enfin, merci à mes parents pour leur ouveprrtuitr ee t d'leusr soutien de toujours.
8

Prologue

Ce manuscrit présente les résultats de ma thèse sur l’hybridation au sein du complexe des chênes
blancs européens. Certaines parties ont fait l’objet de publications scientifiques qui sont présentées en
annexe (Annexes A, B et C), d’autres articles sont également prévus. Par ailleurs, le travail de
recherche conduit souvent à des collaborations dont certaines sont valorisées par une publication. Ma
contribution à l’analyse de données génétiques chez des variétés d’olivier tunisiennes ainsi que chez le
cèdre atlantique a produit deux articles dont les résumés sont joints en annexe (Annexes D et E).
La thèse est organisée en trois grandes parties composées chacune de deux chapitres. Chaque chapitre
est structuré comme un article autonome et peut donc être lu indépendamment. La première partie
(chapitre 1) introduit la notion d’espèce, fait une synthèse sur les processus de spéciation et
d’hybridation avant d’aborder la place des chênes dans ces problématiques et de présenter la démarche
mise en œuvre pour étudier l’hybridation contemporaine entre espèces de chênes. La méthodologie
employée est expliquée et testée (partie A) avant d’être appliquée sur des croisements contrôlés et en
populations naturelles pour quantifier l’hybridation et ses conséquences (partie B) et étudier le
système de reproduction des espèces de chênes (partie C). Le manuscrit se termine par une conclusion
générale (chapitre 8) qui synthétise les résultats obtenus et propose quelques perspectives de
recherches.



9

10

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