Endogenous and exogenous inhibitors of inflammatory lymphangiogenesis in the cornea [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Felix Bock

De
Endogenous and Exogenous Inhibitors of Inflammatory Lymphangiogenesis in the Cornea Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Felix Bock aus Karlsruhe Als Dissertation genehmigt von den Naturwissen- schaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 17.07.2008 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Johann H. Brandstätter Zweitberichterstatter: PD Dr. Claus Cursiefen 2 Erklärung Diese Dissertation wurde im Sinne von § 6 Abs. 3 der Promotionsordnung von Herrn PD Dr. Claus Cursiefen betreut. Ehrenwörtliche Versicherung Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet. Erlangen, am 01.04.
Publié le : mardi 1 janvier 2008
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Endogenous and Exogenous Inhibitors of
Inflammatory Lymphangiogenesis in the
Cornea








Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades




vorgelegt von
Felix Bock
aus Karlsruhe








Als Dissertation genehmigt von den Naturwissen-
schaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg





Tag der mündlichen Prüfung: 17.07.2008

Vorsitzender
der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Johann H. Brandstätter

Zweitberichterstatter: PD Dr. Claus Cursiefen
2

Erklärung
Diese Dissertation wurde im Sinne von § 6 Abs. 3 der Promotionsordnung von Herrn
PD Dr. Claus Cursiefen betreut.




Ehrenwörtliche Versicherung
Diese Dissertation wurde selbständig, ohne unerlaubte Hilfe erarbeitet.
Erlangen, am 01.04.2008
Felix Bock
3
















Meinen Eltern

4Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis/Index
Inhaltsverzeichnis/Index 5
Zusammenfassung (deutsch) 10
Abstract 11
Abbreviations 12
1. Introduction 17
1.1. The cornea 17
1.1.1. Corneal epithelium 17
1.1.2. Bowman´s layer 18
1.1.3. Corneal stroma 18
1.1.4. Descement´s membrane 19
1.1.5. Corneal endothelium 20
1.1.6. Corneal innervations 21
1.1.7. Corneal limbus 22
1.1.8. Trabecular meshwork 23
1.2. Angiogenic privilege of the cornea 24
1.3. Endogenous inhibitors of angiogenesis in the cornea and aqueous
humor 27
1.3.1. Angiostatin 27
1.3.2. Endostatin 28
1.3.3. Pigment Epithelium–Derived Factor 29
1.3.4. Thrombospondin 29
1.4. Immune privilege of the eye 30
1.5. The role of angiogenic and immune privilege of the cornea in corneal
transplant immunology 33
1.6. Angiogenesis and lymphangiogenesis in the cornea 35
1.7. Clinical consequences of loss of corneal angiogenic privilege 41
1.8. Exogenous inhibitors of angiogenesis 43
1.8.1. Bevacizumab 44
5Inhaltsverzeichnis

1.8.2. VEGFR3 antibody mF4-31C1 45
1.8.3. VEGF Trap 45 R1R2
1.9. Morphometrical methods to quantify corneal hem- and
lymphangiogenesis 46
2. Material and Methods 49
2.1. Material 49
2.1.1. Chemicals and expendables 49
2.1.2. Surgical instruments 50
2.1.3. Primary antibodies 51
2.1.4. Secondary antibodys 51
2.1.5. Eukaryotic cells 52
2.1.6. Animals 52
2.1.7. Software 52
2.3. Methods 53
2.3.1. Cell culture 53
2.3.2. Lymphatic endothelial cell (LEC)/ blood endothelial cell (BEC)
proliferation ELISA 54
2.3.3. Bevacizumab binding analysis with murine and human VEGF-A 55
2.3.3.1. Western blot 55
2.3.3.2. Solid phase binding assay (ELISA) 57
®2.3.3.3. Surface plasmon resonance (BIACORE) 57
2.3.4. Animal models 58
2.3.4.1. Aqueous humor collection 58
2.3.4.2. Wound healing assay 58
2.3.4.3. Alkali burn assay 59
2.3.4.4. Suture-induced, inflammatory corneal neovascularization assay 60
2.3.4.5. Murine corneal transplantation 60
2.3.5. Immunohistochemical methods 61
2.3.5.1. Corneal wholemounts 61
2.3.5.2. Cryosection staining 62
2.3.5.3. Light microscopy 62
2.3.6. Functional analysis 64
2.3.6.1. Image acquisition 64
6Inhaltsverzeichnis

2.3.6.2. Manual method of corneal image analysis using ImageJ 64
2.3.6.3. Semiautomatic method of corneal image analysis using Cell^F 64
2.3.6.4. Statistical analysis 68
3. Results 69
3.1. Development of a new semiautomatic, quantitative method for
morphological analysis of hem- and lymphangiogenesis in corneal
flatmounts 69
3.1.1. Validity of manual outlining versus semiautomatic threshold
method analyzing model structures 69
3.1.2. Comparison of the validity of the manual versus the semiautomatic
method analyzing blood and lymphatic vessels in corneal
flatmounts 71
3.1.3. Comparison of the reproducibility and objectivity of the two
methods 75
3.2. Effects of the first FDA-approved antiangiogenic drug Bevacizumab
on corneal hem- and lymphangiogenesis 77
3.2.1. Bevacizumab binds to murine and human VEGF-A 78
3.2.2. Systemic application of Bevacizumab inhibits hem- and
lymphangiogenesis 82
3.2.3. Topical application of Bevacizumab inhibits hem- and 84
3.2.4. Long term application of Bevacizumab 85
3.2.5. IgG-isotype control backup 85
3.2.6. Bevacizumab inhibits lymphatic endothelial cell (LEC) proliferation
in vitro 86
3.2.7. Safety profile of topical VEGF-neutralization at the cornea using
Bevacizumab eye drops 88
3.2.7.5. Effects of Bevacizumab eye drops on normal murine corneas in
vivo 88
3.2.7.6. Effects of Bevacizumab eye drops on corneal epithelial wound
healing 91
3.3. Blockade of VEGFR3-signalling specifically inhibits
lymphangiogenesis in inflammatory corneal neovascularization 95
7Inhaltsverzeichnis

3.3.1. Systemic application of mF4-31C1 inhibits lymph- but not
hemangiogenesis in inflammatory neovascularization 95
3.3.2. The role of lymphatic vessels for cell debris clearing during wound
healing in the cornea 99
3.3.3. Improvement of graft survival after high risk keratoplasty by
blocking blood and lymphatic vessels or only lymphatic vessels 100
3.3.3.1. Pretreatment with the VEGF Trap 101 R1R2
3.3.3.2. Pretreatment with the VEGFR3 antibody mF4-31C1 102
3.4. Immune modulatory factors in the aqueos humor have
antilymphangiogenic effects 103
3.4.1. Antihem- and antilymphangiogenic effects of the aqueous humor 104
3.4.2. The endogenous, antiangiogenic factor thrombospondin 1 has
antilymphangiogenic effects in vitro 104
3.4.3. The endogenous immune modulating factors α-melanocyte
stimulating hormone ( α -MSH) and vasoactive intestinal protein
(VIP) exhibit various effects on hem- and lymphangiogenesis in
vitro 105
3.4.3.3. α-MSH 105
3.4.3.4. VIP 106
4. Discussion 111
4.1. Improved novel semiautomatic method for morphometry of
angiogenesis and lymphangiogenesis in corneal flatmounts 113
4.2. Bevacizumab is the first FDA-approved antiangiogenic drug, which
also inhibits lymphangiogenesis in addition to hemangiogenesis 114
4.3. Bevacizumab eye drops do not seem to affect normal corneal
structure or epithelial wound healing 117
4.4. The role of lymphatic vessels in inflammatory corneal
neovascularization and corneal transplant immunology 120
4.5. Aqueous humor is a potent model to identify novel endogenous
antilymphangiogenic factors 126
5. References 132
8Inhaltsverzeichnis

6. Lebenslauf und Publikationsliste 141
Lebenslauf 141
Preise 144
Publikationsliste 145
Danksagung 147
9Zusammenfassung deutsch

Zusammenfassung (deutsch)
Die normale, gesunde Hornhaut ist frei von Blut- und Lymphgefäßen. Allerdings kann
es durch Entzündungsreize wie Verätzungen oder Herpes-Infektionen zum
Zusammenbruch dieses so genannten “angiogenen Privileges” kommen. In Folge
solcher Entzündungen wachsen Blut- und Lymphgefäße parallel in die Hornhaut ein
und mindern dabei die Sehschärfe, erhöhen aber vor allem auch das Risiko einer
Transplantatabstoßung nach einer anschließenden Hornhauttransplantation.
Lymphangiogenese, also die Bildung von neuen Lymphgefäßen aus bereits
bestehenden, spielt eine wichtige Rolle bei verschiedenen pathologischen Prozessen
wie Wundheilung, Induktion von Immunreaktionen oder Tumormetastasierung.
Ziel dieser Arbeit war es, endogene und exogene Inhibitoren der Lymphangiogenese
in der Hornhaut zu identifizieren bzw. zu testen, die entweder ausschließlich die
Lymphangiogenese hemmen oder dies im Zusammenhang mit der Inhibierung der
Hemangiogenese vermögen. Mit der Hilfe solcher Inhibitoren wurde die Rolle
pathologischer kornealer Lymphgefäße während der Immunantwort nach
Hornhauttransplantation und während der Wundheilung untersucht. Um diese
Fragestellungen so präzise wie möglich zu analysieren wurde eine
halbautomatische, auf Grauwertanalysen basierende neue Methode entwickelt und
evaluiert, um die kornealen Bereiche, die von Blut- oder Lymphgefäßen bedeckt sind,
exakt morphometrisch zu quantifizieren.

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