Etude des effets de l'induction de l'heme oxygenase-1 sur la prévention de la thrombose artérielle et la progression de l'insuffisance rénale chronique chez le rat

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Publié par

Sous la direction de Jean-Michel Halimi
Thèse soutenue le 07 octobre 2008: Tours
Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz diffusible dont la production à l'état physiologique est majoritairement issue de la dégradation de l’hème par l’hème oxygénase (HO). Le CO endogène a des propriétés vasorelaxantes comparables à celles du monoxyde d’azote. L’effet du CO a été étudié dans des modèles d’ischémie coronarienne, d’insuffisance rénale aigue et d’hypertension artérielle : des propriétés anti-agrégantes, anti-prolifératives, anti-inflammatoires et anti-apoptotiques ont été mises en évidence. Ces propriétés suggèrent que le CO pourrait aussi jouer un rôle dans la prévention de la thrombose vasculaire, et la prévention de la progression de l’insuffisance rénale chronique. Dès lors, les objectifs de cette thèse ont été : 1) d’évaluer les effets in vivo d’un inducteur de l’HO-1, l’hémine, administré en chronique respectivement dans un modèle de thrombose carotidienne et dans un modèle d’insuffisance rénale chronique chez le rat et ; 2) de fournir des éléments susceptibles d’expliquer la mécanistique qui sous-tend les effets liés à l’induction de l’HO-1. Dans le modèle de thrombose artérielle validé chez le rat par notre laboratoire, l’administration chronique d’hémine à la dose de 50 mg/kg a réduit significativement le taux d’occlusion vasculaire par rapport aux animaux non traités (7,2% versus 71%; p<0,01). A l’inverse, les animaux traités par l’hémine recevant parallèlement un inhibiteur de l’HO-1 ont présenté des taux d’occlusion vasculaire comparables à ceux des animaux contrôles. Ces résultats suggèrent que la réduction du taux d’occlusion artérielle observée, qui ne s’est pas accompagnée de modifications significatives de la pression artérielle, des paramètres sanguins ou de l’hémostase, est directement liée à l'expression vasculaire de l’HO-1. Dans le modèle d’insuffisance rénale chronique par néphrectomie des 5/6 chez le rat, l’administration chronique 2 fois par semaine d’hémine à la dose de 50 mg/kg a diminué significativement, par rapport aux animaux contrôles, la protéinurie (1,0 versus 7,3 g/mmol de créatinine), les index de glomérulosclérose (0,84 versus 2,53) et d’atrophie tubulaire rénale (0,9 versus 2,33), l’expression des protéines impliquées dans la progression de l’insuffisance rénale [(TGF-???0,62 versus 1,0) caspase-3 (0,35 versus 0,71); BMP-4 (0,11 versus 0,32)] et a augmenté significativement l’expression de la protéine BMP-7 néphroprotectrice (1,31 versus 0,38). Par rapport aux animaux recevant un antagoniste des récepteurs AT1 de l'angiotensine II (losartan à la dose de 20 mg/kg), traitement de référence utilisé au cours de l'étude, les effets de l'hémine ont été comparables pour l’expression de TGF-?? (0,62 versus 0,65) voire supérieurs pour son effet sur protéinurie (1 g/mmol de créatinine versus 2,2 g/mmol de créatinine), l’index de glomérulosclérose (0,84 versus 1,68) et d’atrophie tubulaire (0,9 versus 1,66), malgré une réduction de la pression artérielle plus faible (152,4 mmHg versus 134,7 mmHg). D’autres travaux doivent à présent être entrepris afin d’évaluer si l’induction de l’HO-1 peut constituer une approche thérapeutique d’avenir dans la prévention de la thrombose carotidienne et dans la progression de l’IRC.
-Hème-oxygénase-1
-Insuffisance rénale chronique
-Monoxyde de carbone
-Modèle animal
-Thrombose artérielle
No summary available.
Source: http://www.theses.fr/2009TOUR3102/document
Publié le : lundi 19 mars 2012
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Nombre de pages : 135
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1
UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS
ÉCOLE DOCTORALE SANTE SCIENCES ET TECHNOLOGIES
LABORATOIRE DE LA PHYSIOPATHOLOGIE DE LA PAROI ARTERIELLE
EA3852
THÈSE
présentée par :
Nicolas Desbuards
soutenue le :
7 octobre 2008
pour obtenir le grade de :
Docteur de l’Université François – Rabelais de Tours
Discipline/ Spécialité
: Sciences de la Vie et Santé
ETUDE DES EFFETS DE L’INDUCTION DE L’HEME OXYGENASE-1 SUR
LA PREVENTION DE LA THROMBOSE ARTERIELLE ET LA
PROGRESSION DE L’INSUFFISANCE RENALE CHRONIQUE CHEZ LE RAT
THÈSE dirigée par :
M. Halimi Jean-Michel
Professeur, Université François - Rabelais, Tours
RAPPORTEURS :
M. Choukroun Gabriel
Professeur, Université d’Amiens
Mme Marchand-Leroux Catherine
Professeur, Université Paris V
JURY :
M. Antier Daniel
Maître de conférence, Université François - Rabelais, Tours
M. Delorme Bruno
Docteur, responsable R&D MacoPharma, Tourcoing
M. Domenech Jorge
Professeur, Université François - Rabelais, Tours
M. Choukroun Gabriel
Professeur, Université d’Amiens
M. Halimi Jean-Michel
Professeur, Université François - Rabelais, Tours
Mme Marchand-Leroux Catherine
Professeur, Université Paris V
2
Remerciements
3
Résumé
Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz diffusible dont la production à l'état
physiologique est majoritairement issue de la dégradation de l’hème par l’hème oxygénase
(HO). Le CO endogène a des propriétés vasorelaxantes comparables à celles du monoxyde
d’azote. L’effet du CO a été étudié dans des modèles d’ischémie coronarienne, d’insuffisance
rénale aigue et d’hypertension artérielle : des propriétés anti-agrégantes, anti-prolifératives,
anti-inflammatoires et anti-apoptotiques ont été mises en évidence. Ces propriétés suggèrent
que le CO pourrait aussi jouer un rôle dans la prévention de la thrombose vasculaire, et la
prévention de la progression de l’insuffisance rénale chronique. Dès lors, les objectifs de cette
thèse ont été : 1) d’évaluer les effets
in vivo
d’un inducteur de l’HO-1, l’hémine, administré
en chronique respectivement dans un modèle de thrombose carotidienne et dans un modèle
d’insuffisance rénale chronique chez le rat et ; 2) de fournir des éléments susceptibles
d’expliquer la mécanistique qui sous-tend les effets liés à l’induction de l’HO-1.
Dans le modèle de thrombose artérielle validé chez le rat par notre laboratoire,
l’administration chronique d’hémine à la dose de 50 mg/kg a réduit significativement le taux
d’occlusion vasculaire par rapport aux animaux non traités (7,2% versus 71%; p<0,01). A
l’inverse, les animaux traités par l’hémine recevant parallèlement un inhibiteur de l’HO-1 ont
présenté des taux d’occlusion vasculaire comparables à ceux des animaux "contrôles". Ces
résultats suggèrent que la réduction du taux d’occlusion artérielle observée, qui ne s’est pas
accompagnée de modifications significatives de la pression artérielle, des paramètres sanguins
ou de l’hémostase, est directement liée à l'expression vasculaire de l’HO-1.
Dans le modèle d’insuffisance rénale chronique par néphrectomie des 5/6 chez le rat,
l’administration chronique 2 fois par semaine d’hémine à la dose de 50 mg/kg a diminué
significativement, par rapport aux animaux contrôles, la protéinurie (1,0 versus 7,3 g/mmol de
4
créatinine), les index de glomérulosclérose (0,84 versus 2,53) et d’atrophie tubulaire rénale
(0,9 versus 2,33), l’expression des protéines impliquées dans la progression de l’insuffisance
rénale [(TGF
-
 
0,62 versus 1,0) caspase-3 (0,35 versus 0,71); BMP-4 (0,11 versus 0,32)] et a
augmenté significativement l’expression de la protéine BMP-7 néphroprotectrice (1,31 versus
0,38). Par rapport aux animaux recevant un antagoniste des récepteurs AT1 de l'angiotensine
II (losartan à la dose de 20 mg/kg), traitement de référence utilisé au cours de l'étude, les
effets de l'hémine ont été comparables pour l’expression de TGF-
(0,62 versus 0,65) voire
supérieurs pour son effet sur protéinurie (1 g/mmol de créatinine versus 2,2 g/mmol de
créatinine), l’index de glomérulosclérose
(0,84 versus 1,68) et d’atrophie tubulaire
(0,9
versus 1,66), malgré une réduction de la pression artérielle plus faible (152,4 mmHg versus
134,7 mmHg).
D’autres travaux doivent à présent être entrepris afin d’évaluer si l’induction de l’HO-1
peut constituer une approche thérapeutique d’avenir dans la prévention de la thrombose
carotidienne et dans la progression de l’IRC.
5
Table des matières
Remerciements ......................................................................................................................... 2
Résumé ...................................................................................................................................... 3
Table des matières.................................................................................................................... 5
Liste des tableaux ..................................................................................................................... 7
Liste des figures
........................................................................................................................ 8
Introduction générale
............................................................................................................. 11
1
re
partie : étude bibliographique
......................................................................................... 14
1.
Hème oxygénase et monoxyde de carbone
........................................................... 15
1.1 Hème oxygénase : isoenzymes, distribution tissulaire et induction......................... 15
1.2
Métabolisme de l’HO-1 et produits de dégradation .............................................. 19
1.3
Propriétés du CO .................................................................................................... 22
2.
Rôle protecteur du couple HO/CO dans différents modèles
.............................. 28
3.
La thrombose
.......................................................................................................... 32
3.1
Rappels physiopathologiques................................................................................. 32
3.2
Implications du couple HO/CO dans les mécanismes de la thrombose................. 32
3.3
Modèles de thrombose artérielle ............................................................................ 40
4.
L’insuffisance rénale chronique
............................................................................ 41
4.1
Rappel physiopathologique.................................................................................... 41
4.2
La fibrose rénale dans la progression de l’IRC ...................................................... 42
4.3
Le TGF-
et l’Ang II dans l’IRC ........................................................................... 45
4.4
Effets du couple HO/CO sur les mécanismes de la progression de l’IRC ............. 47
4.5
Modèles d’IRC ....................................................................................................... 52
2
ème
partie : Etudes expérimentales
...................................................................................... 54
Objectifs généraux
.............................................................................................................. 55
Etude des effets antithrombotiques potentiels de l’hémine, un inducteur de l’HO-1,
dans un modèle de thrombose carotidienne chez le rat
.................................................. 56
Matériel et méthodes
.......................................................................................................... 57
1.
Animaux................................................................................................................... 58
2.
Modèle de thrombose artérielle................................................................................ 58
3.
Protocole expérimental............................................................................................. 58
3.1
Composition et traitement des groupes .................................................................. 60
3.2
Mesure des vitesses du flux sanguin dans les artères carotidiennes....................... 61
3.3
Mesure de la pression artérielle.............................................................................. 61
3.4
Prélèvements sanguins et tissulaires ...................................................................... 62
3.5
Analyse anatomopathologique ............................................................................... 62
3.6
Mesure de la concentration sérique en hème ......................................................... 63
3.7
Analyse nucléique .................................................................................................. 64
3.8
Analyse protéique................................................................................................... 65
3.9
Mesure des paramètres de l’hémostase .................................................................. 66
3.10 Analyse statistique.................................................................................................. 66
Résultats
.............................................................................................................................. 67
1.
Effet du traitement par l’hémine sur l’expression de l’HO-1................................... 68
2.
Effets du traitement par l’hémine sur la thrombose carotidienne ............................ 70
2.1
Effets sur la vitesse du flux sanguin....................................................................... 70
2.2
Effets sur la formation du thrombus carotidien...................................................... 72
6
3.
Effets du traitement par l’hémine sur la pression artérielle, les paramètres sanguins
et de l’hémostase ...................................................................................................................... 74
Tableau II :
Effets des traitements chroniques par l’hémine et hémine + SnPP sur la pression
artérielle et les paramètres biologiques
.
................................................................................... 75
Discussion
............................................................................................................................ 76
Etude des effets de l'hémine sur la progression de l'insuffisance rénale chronique
chez le rat
............................................................................................................................ 81
Matériel et Méthodes
......................................................................................................... 82
1.
Détermination du schéma d’administration optimale de l’hémine .......................... 83
1.1
Méthode.................................................................................................................. 83
1.2
Résultats ................................................................................................................. 85
2.
Animaux................................................................................................................... 85
3.
Validation du modèle d’IRC .................................................................................... 85
4.
Protocole expérimental
Les différentes étapes du protocole expérimental de cette étude sont illustrées par la
Figure
13
.
88
4.1
Composition des groupes et traitement des animaux............................................. 88
4.2
Evaluation des effets du traitement à l’hémine versus losartan dans l’IRC........... 90
4.3
Analyse statistique.................................................................................................. 94
Résultats
.............................................................................................................................. 95
1.
Induction de l’HO-1 par l’hémine............................................................................ 96
2.
Masse corporelle des rats ......................................................................................... 98
3.
Paramètres hémodynamiques................................................................................... 98
4.
Protéinurie et créatininémie ................................................................................... 100
5.
Résultats anatomopathologiques : glomérulosclérose et atrophie tubulaire .......... 102
6.
Effet du traitement par l’hémine sur l’apoptose..................................................... 102
7.
Effet du traitement par l’hémine sur les facteurs de croissance impliqués dans l’IRC
106
7.1
Effet sur le TGF-
................................................................................................ 106
7.2
Effet sur les protéines BMP-4 et BMP-7 ............................................................. 106
Discussion
.......................................................................................................................... 109
Conclusion générale
............................................................................................................. 117
Liste des publications
........................................................................................................... 118
Références bibliographiques
............................................................................................... 120
7
Liste des tableaux
Tableau I :
Principaux facteurs connus de l’induction de l’HO-1
Tableau II :
Effets des traitements chroniques par l’hémine et hémine + SnPP sur la pression
artérielle et les paramètres biologiques
.
Tableau III:
Pression artérielle à 12 semaines : comparaison entre les groupes
Tableau IV :
Effet de 12 semaines de traitements par l’hémine et le losartan sur la fonction
rénale et la protéinurie
8
Liste des figures
Figure 1 :
schéma de la dégradation de l’hème
Figure 2 :
Effets physiologiques du CO
Figure 3:
Activation et recrutement des plaquettes lors de dommages de la paroi vasculaire
Figure 4 :
Propriétés de l’endothélium sain
Figure 5 :
Lien entre facteurs de croissance et insuffisance rénale
Figure 6 :
Effets du TGF-
sur la progression de l’IRC
Figure 7 :
Etapes du protocole de l’étude sur la thrombose
Figure 8 :
Expression et localisation de l’HO-1
Figure 9 :
Détection du flux sanguin de l’artère carotidienne gauche par écho Doppler
Figure 10 :
Effet du traitement par l’hémine sur la thrombose vasculaire induite par
stimulation électrique
Figure 11 :
Evaluation du taux de carboxyhémoglobine en fonction du temps chez les rats
traités par une injection unique d’hémine (50 mg/kg)
Figure 12 :
Procédure chirurgical de la néphrectomie subtotale 5/6
Figure 13 :
Protocole expérimental de l’étude
Figure 14 :
Expression de l’HO-1 dans le rein restant
Figure 15 :
Effet du traitement de 12 semaines par l’hémine sur la glomérulosclérose et
l’atrophie tubulaire
Figure 16 :
Index de glomérulosclérose et d’atrophie tubulaire
Figure 17 :
Effet du traitement de 12 semaines par l’hémine sur l’expression de la caspase-3
Figure 18 :
Effet des traitements par l’hémine sur l’expression rénal du TGF-
1
Figure 19 :
Effet du traitement par l’hémine sur l’expression protéique des BMP-4 et BMP-7
Figure 20 :
Voie de signalisation intracellulaire des Smad
9
10
Abréviations
Ang II: Angiotensine II
ATP: adénosine triphosphate
BMP: Bone Morphogenic Protein
BR: bilirubine
BV: biliverdine
CO: monoxyde de carbone
CORM: CO releasing molecule
GCs : guanylate cyclase soluble
GMPc : guanosine monophosphate cyclique
HbCO : carboxyhémoglobine
HO : hème oxygénase
IRA : insuffisance rénale aigue
IRC : insuffisance rénale chronique
NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate
MAPK: protéines kinases mitogènes activées
NO: monoxyde d’azote
Smad: Mothers against decapentaplegic
SnPP: étain protoporphyrine
TCA : temps de céphaline activée
TGF-
: Transforming Growth Factor-
TP: temps de prothrombine
11
Introduction générale
Le monoxyde de carbone (CO) est un gaz hautement diffusible, incolore et inodore,
potentiellement mortel sous certaines conditions et à certaines concentrations chez l’homme.
Responsable d’empoisonnement, le CO a longtemps été considéré comme étant seulement un
gaz toxique. Mais depuis une dizaine d’années, des études publiées ont rapporté les rôles
fonctionnels du CO endogène (Otterbein, 2002). Celui-ci est généré dans tous les types
cellulaires et est principalement issu de la dégradation de l’hème par l’hème oxygénase (HO).
Cette enzyme microsomale existe sous forme constitutive (HO-2 et HO-3) et sous forme
inductible (HO-1). Dans les conditions physiologiques, l’HO-1 est faiblement exprimée mais
peut être induite par de nombreux facteurs tels que l’inflammation, le stress oxydatif, les
métaux lourds, l’hypoxie ou encore le stress hémodynamique (Maines, 1997). Le CO libéré
lors de l’induction de l’HO-1 possède des effets cytoprotecteurs incluant des propriétés
vasomotrices proches de celles du monoxyde d’azote mais aussi des propriétés anti-
inflammatoires, anti-apoptotiques, anti-prolifératives et anti-agrégantes. Tous ces effets
connus du CO endogène supportent l’hypothèse de son rôle dans le maintien de l’intégrité de
la paroi vasculaire et ont été confirmés dans de nombreux modèles.
La pathologie thrombotique demeure associée à une augmentation des risques de
mortalité et de morbidité dans les pays développés. La formation du thrombus implique de
nombreux types cellulaires incluant les cellules endothéliales, les cellules immunitaires et les
plaquettes. En cas de lésions vasculaires, la couche de cellules endothéliales est endommagée
et des éléments procoagulants de la matrice extracellulaire sont exposés, entraînant l’adhésion
plaquettaire. Suite à cette adhésion, il y a activation et agrégation plaquettaire entraînant la
formation du thrombus. Les plaquettes activées interagissent avec les leucocytes facilitant
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