Étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la mort neuronale induite par le peptide de ß-amyloïde soluble : recherche et validation fonctionnelle de cibles cellulaires, Molecular mechanisms involved in soluble ß amyloid peptide-induced cell death : characterization and functional validation of therapeutic targets

De
Publié par

Sous la direction de Brigitte Leininger-Muller
Thèse soutenue le 31 octobre 2006: INPL
Le vieillissement des populations est corrélé à l’augmentation des pathologies neurodégénératives liées à l’âge, plus particulièrement la maladie d’Alzheimer. La recherche de marqueurs précoces de la maladie ainsi que l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques constituent un enjeu de taille. Parmi les mécanismes moléculaires de la formation des plaques amyloïdes actuellement explorés, les formes oligomériques tronquées de peptide amyloïde (Aß), notamment le peptide Aß3(?pE)??42? retrouvé à des stades précoces de la maladie, joueraient un rôle déterminant. Ces travaux de thèse ont permis de montrer, dans un premier temps, que l’injection intracérébrale de ce peptide chez la souris entraîne des altérations de la mémoire de travail et des capacités d’apprentissage, associées à une accumulation d’espèces réactives dérivées de l’oxygène dans des régions cérébrales spécifiques (hippocampe et bulbes olfactifs) de ces animaux. Des essais menés in vitro sur des cultures primaires de neurones de souris montrent leur implication dans les voies apoptotiques impliquant l’activation des caspases et la cascade métabolique de l’acide arachidonique. La seconde étape de ces travaux a constitué en l’étude des effets protecteurs d’un peptide antiapoptotique d’origine endogène, l’humanine (HN) et son variant S14G (HNG). In vitro, un effet protecteur de ces peptides a été mesuré après traitement de neurones en culture par le peptide A[bêta]3?(pE)42.??? Les résultats les plus marquants résident dans les observations faites in vivo : en effet, ces peptides inhibent l’effet délétère de l’injection intracérébroventriculaire du peptide Aß3?(pE??)42?? en restaurant les performances mnésiques des animaux dans les tests comportementaux. A la lumière de ces résultats, les peptides HN pourraient constituer de nouveaux outils thérapeutiques dans le traitement ou la prévention des dommages cellulaires précoces liés à la présence des oligomères solubles du peptide Aß
-Maladie d’Alzheimer
-Stratégies thérapeutique
-Humanine
-Apprentissage
-Mémoire
-Comportement
-Neurotoxicité
-Transduction du signal
-Apoptose
-Neurodégénérescence
-Oligomères solubles
-Peptide ß-amyloïde
Aging of population is correlated to the increase of neurodegenerative disease, more particularly Alzheimer disease. Defining early diagnostic markers and new therapeutic strategies are highly relevant. Among the molecular pathways which are currently developed, N-terminal-truncated forms of amyloid-ß (Aß) peptide have been recently suggested to play a pivotal role in the disease. Among them, Aß3(?pE)42 ?peptide is the dominant Aß species in amyloid plaques. We first investigated the effects of soluble oligomeric Aß3(pE) 42 after intracerebroventricular injection on mice learning capacities and the molecular mechanisms of in vitro neurotoxicity. Mice injected with soluble Aß3(pE) 42 displayed impaired spatial working memory and delayed memory acquisition. These cognitive alterations were associated with free radical overproduction in hippocampus and olfactory bulbs. In vitro, Aß3(pE) 42 oligomers induced a redox-sensitive neuronal apoptosis involving caspase activation and an arachidonic acid-dependent pathway. The second goal of this work was to investigate the protective effects of the apoptosis rescue endogenous peptide humanin (HN) and its S14G mutant (HNG). In vitro, we measured their inhibitory effect on neuronal death and apoptotic events resulting from soluble Ab oligomer treatment. What’s of particular interest is the in vivo restoration of soluble Aß3(pE) 42 oligomer-induced mnesic impairment. Thus, HN peptides might serve as new drug candidates for treatment or prevention of early cellular damages linked to soluble A[bêta] oligomers
-Neurodegenerative disease
-Alzheimer disease
-Amyloid plaques
-Neuronal death
-Delayed memory acquisition
Source: http://www.theses.fr/2006INPL068N/document
Publié le : lundi 24 octobre 2011
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THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL
POLYTECHNIQUE DE LORRAINE

Discipline : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires


Présentée et soutenue publiquement par

Mr. Ihsen YOUSSEF

Le 31 Octobre 2006


Titre
Etude des mécanismes moléculaires impliqués dans la mort neuronale
induite par le peptide β-amyloïde soluble :
Recherche et validation fonctionnelle de cibles cellulaires.



Directeur de thèse : Dr. Brigitte Leininger-Muller


JURY
Pr. François Laurent (président)
Dr Bernadette Allinquant, DR2 Inserm (rapporteur)
Dr. Jean-Paul Fuchs, CR1 CNRS (rapporteur)
Dr. Brigitte Leininger-Muller, MCU
Dr. Thierry Pillot, DR2 Inserm















On vous a dit aussi que la vie est obscurité, et dans votre lassitude vous répétez
ce que disent les las.
Et je vous dis que la vie est en effet obscure sauf là où il y a élan,
Et tout élan est aveugle sauf là où il y a la connaissance.
Et toute connaissance est vaine sauf là où il y a le travail,
Et tout travail est futile sauf là où il y a l'amour ;

Gibran Khalil Gibran.



















A ma mère et mon père

Recevez par l’aboutissement de ce travail la récompense de votre soutien, de
votre patience et de vos prières tout le long de ces années et le témoignage de
mon amour.

A mes sœurs Saoussan et Imen et mon frère Anis, qu’ils trouvent ici le
témoignage de mon affection.

Au souvenir de mes grand parents, Amna et H’mida.

A ma chère patrie, la Tunisie.




Remerciements



A Monsieur le Dr. Thierry Pillot, qui assure la lourde tâche de guider et veiller
sur l'équipe Neuro. Ses décisions judicieuses quant à l'orientation du projet ont
été indispensables à l'aboutissement de ce travail. Merci pour sa patience et son
soutien indéfectible.


A Madame Le Dr. Brigitte Leineinger-Muller pour avoir assuré mon encadrement
tout au long de ma thèse.


A Madame le Dr. Frances Yen-Potin et Monsieur le Dr. Bernard Bihain de
m'avoir accueilli dans leur laboratoire et de m'avoir donné les moyens de réaliser
cette thèse dans de bonnes conditions.

A l'association Alzheimer 57 nord pour son soutien.

A Monsieur le Pr. François Laurent, Madame le Dr. Bernadette Allinquant et
Monsieur le Dr. Jean-Paul Fuchs d’avoir accepté de juger ce travail.


A Monsieur El Mostapha Zeggari et Madame Hayet Khsiba pour avoir cultivé ma
passion pour la Biologie.


A Monsieur Med Nejib Youssef pour m’avoir apporté son aide et son soutien
tout le long de mon cursus.


A Badreddine Kriem pour m’avoir initié aux techniques des analyses
comportementales. Merci pour ses conseils et son soutien.


A Thierry Oster pour ses conseils et critiques judicieux durant ces trois années
de thèse.

A Violette Koziel pour sa gentillesse, sa disponibilité, son aide précieuse et ses
conseils. Merci pour son soutien aussi bien personnel que professionnel.


A Jean-Luc Olivier pour ses conseils et ses précieuses analyses
bibliographiques.


A Sabrina, Catherine et Lionel pour leurs conseils et leur aide.


A Véronique et Erwan pour m'avoir accueilli dans leur l'animalerie. Merci pour
leur précieuse aide dans la partie in vivo de mon travail.


A tous mes collègues du laboratoire de Médecine et Thérapeutiques Moléculaire.






Ce travail




A été réalisé



Au Laboratoire de Médecine et Thérapeutique Moléculaire



Jeune équipe Lipidomix, JE2482


Institut National Polytechnique de Lorraine


(Pr. F. YEN-POTIN)




15 rue du Bois de la Champelle, 54500 VANDOEUVRE

SOMMAIRE

SOMMAIRE.............................................................................................................................. 3
LISTE DES PUBLICATIONS................................................................................................. 6 S ABREVIATIONS ................................................................................................ 7
LISTE DES FIGURES.............................................................................................................. 8
LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... 10
AVANT-PROPOS ................................................................................................................... 11
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE...................................................................................... 15
1. La maladie d’Alzheimer : Historique................................................................................ 15
2. Généralités ........................................................................................................................... 16
2.1. La maladie d’Alzheimer, un problème de santé publique.................................................. 16
2.2. Prévalence de la maladie d’Alzheimer............................................................................... 17
2.2.1. Répartition en fonction de l’âge 17
2.2.2. Répartition en fonction du sexe....................................................................................... 18
2.2.3. Niveau d’éducation et réseau social 18
2.2.4. Facteurs nutritionnels ...................................................................................................... 20
3. Aspects cliniques de la maladie d’Alzheimer.................................................................... 21
3.1. Circonstances diagnostiques .............................................................................................. 21
3.1.1. Les signes cliniques cognitifs.......................................................................................... 23
3.1.2. Mesure de la sévérité de la démence et critères de diagnostic........................................ 25
3.1.3. L’apport des techniques d’imagerie fonctionnelle.......................................................... 27
3.2. Les traitements actuels de la maladie d'Alzheimer ............................................................ 29
3.2.1. Les inhibiteurs de l’acétylcholinestérase......................................................................... 29
3.2.2. Les agonistes des récepteurs NMDA .............................................................................. 30
3.2.3. Autres médicaments utlisés dans le traitement de la maladie d’Alzheimer.................... 30
4. Caractéristiques histopathologiques de la maladie d’Alzheimer.................................... 31
4.1. Les altérations macroscopiques 31
4.2. Lésions histologiques ......................................................................................................... 32
4.2.1. Les plaques amyloïdes .................................................................................................... 32
4.2.2. Les dégénérescences neurofibrillaires............................................................................. 35
4.2.3. Activation de la microglie et augmentation de la réactivité astrocytaire ........................ 38
4.2.4. L’angiopathie amyloïde cérébrale................................................................................... 40
5. Mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie d’Alzheimer................................ 42
5.1. Introduction ........................................................................................................................ 42
5.2. La perte neuronale, contribution relative des processus apoptotique et nécrotique dans la
maladie d’Alzheimer................................................................................................................. 44
5.3. Un élément clé dans la maladie d’Alzheimer : la protéine APP ........................................ 46
5.3.1. Expression et structure génique de l’APP....................................................................... 46
5.3.2. Structure protéique de l’APP........................................................................................... 47
5.3.3. Fonctions biologiques de l’APP...................................................................................... 49
5.3.4. Clivage protéolytique de l’APP....................................................................................... 50
5.4. Le peptide β-amyloïde agrégé, acteur de la cascade amyloïde .......................................... 55
5.4.1. Structure des fibrilles de peptide A β et formation des plaques....................................... 56
5.4.2. Propriétés neurotrophiques du peptide A β agrégé .......................................................... 58
5.4.3. Cytotoxicité des fibrilles de peptide A β.......................................................................... 59
5.4.4. Mécanismes cytotoxiques liés à l’accumulation de fibrilles de peptide A β ................... 63
5.4.4.1. Le stress oxydant.......................................................................................................... 63
5.4.4.2. Le processus inflammatoire ......................................................................................... 64
5.5 Une alternative à la cascade amyloïde : l’hypothèse A β soluble......................................... 66
35.5.1. Introduction ..................................................................................................................... 66
5.5.2. Forme monomérique et oligomérique du peptide A β ..................................................... 67
5.5.3. Implication dans la perte synaptique et le déclin cognitif............................................... 67
5.5.4. L’interaction avec les membranes cellulaires, première étape de la cascade
neurodégénérative ..................................................................................................................... 69
5.5.4.1. Insertion dans les membranes plasmiques ................................................................... 69
5.5.4.2. Accumulation intraneuronale de peptide A β................................................................ 70
5.5.4.3. Interaction avec un partenaire membranaire neuronal ou glial.................................... 71
5.5.5. Réalité clinique et impact des oligomères solubles de peptide A β dans la MA.............. 72
6. Les modèles in vivo d’étude de la maladie d'Alzheimer .................................................. 75
6.1. Introduction.......... 75
6.2. Les modèles transgéniques de la maladie d’Alzheimer ..................................................... 76
6.2.1. Les souris mono-transgéniques ....................................................................................... 76
6.2.1.1. Les souris transgéniques pour la protéine APP............................................................ 76
6.2.1.2. Les souris transgéniques pour la protéine Tau............................................................. 78
6.2.1.3. Les souris transgéniques pour les présénilines 1 et 2................................................... 79
6.2.1.4. Les souris transgéniques pour l’apolipoprotéine E ...................................................... 79
6.2.1.5. Les souris transgéniques pour la β-secrétase................................................................ 80
6.2.2. Les souris double et triple transgéniques ........................................................................ 81
6.2.2.1. Les modèles transgéniques pour la protéine APP et les PS ........................................ 81
6.2.2.2. Les modèles transgéniques pour la protéine APP et l’apoE......................................... 82
6.2.2.3. Les modèles transgéniques pour la protéine APP et la BACE-1 ................................. 82
6.2.2.4. Les modèles transgéniques pour la protéine APP et Tau............................................. 82
6.2.2.5. Les modèles triple-transgéniques................................................................................. 83
6.3. Les modèles d’injection intracérébrale du peptide A β....................................................... 83
6.3.1. Introduction ..................................................................................................................... 83
6.3.2. Description des études in vivo d’injection de peptide A β ............................................... 88
6.3.2.1. Expériences d’injection de peptides A β agrégés.......................................................... 89
6.3.2.2. Modèles d’injections chroniques de peptides A β......................................................... 94
6.3.2.3. Expériences d’injection de formes non agrégées de peptide A β.................................. 94
6.3.2.4. Les modèles combinant la transgénèse et l'injection.................................................... 97
6.3.3. Approches pharmacologiques de prévention de la toxicité du peptide A β dans les modèles
d’injection intracérébrale........................................................................................................... 97
6.3.3.1. Récepteurs NMDA et récepteurs sigma pour cibles thérapeutiques............................ 98
6.3.3.2. Molécules anti-inflammatoires et antioxydantes.......................................................... 99
6.3.3.3. Molécules antioxydantes............................................................................................ 100
6.3.3.4. Le peptide A β pour cible thérapeutique ..................................................................... 101
6.4. Lésions cérébrales liées au vieillissement chez les primates ........................................... 101
HYPOTHESES DE TRAVAIL ET OBJECTIFS .............................................................. 106
OBJECTIFS........................................................................................................................... 108
PROCEDURES EXPERIMENTALES............................................................................... 110
1. Les animaux....................................................................................................................... 110
2. Préparation des peptides .................................................................................................. 110
3. Modèles cellulaires : cultures primaires de neurones corticaux................................... 111
3.1. Mise en culture des neurones ........................................................................................... 111
3.2. Traitements par le peptide A β soluble.............................................................................. 113
3.3. Traitements par les agents antioxydants........................................................................... 113
3.4. Traitements par les inhibiteurs ......................................................................................... 114
4. Etude de la viabilité cellulaire et des marqueurs d’apoptose........................................ 114
4.1. Test de cytotoxicité .......................................................................................................... 114
44.2. Mesure de la viabilité neuronale par la calcéine .............................................................. 115
4.3. Marquage nucléaire au DAPI : détection des corps apoptotiques.................................... 115
4.4. Mesure de l'activité des caspases ..................................................................................... 116
5. Electrophorèse et immunoblot ......................................................................................... 117
5.1. Electrophorèse.................................................................................................................. 117
5.2. Immunoblot ...................................................................................................................... 118
6. Etude in vivo de la toxicité des peptides A β .................................................................... 120
6.1. Techniques stéréotaxiques d’injection ............................................................................. 120
6.1.1. Anesthésie ..................................................................................................................... 120
6.1.2. Injection intracérébrale.................................................................................................. 120
6.2. Analyses comportementales............................................................................................. 122
6.2.1. Labyrinthe en Y............................................................................................................. 122
6.2.2. Piscine de Morris........................................................................................................... 123
6.2.3. Analyses statistiques des données................................................................................. 127
6.3. Etude du stress oxydant in vivo........................................................................................ 127
6.3.1. Formation des espèces réactives dérivées de l'oxygène (EROs)................................... 127
6.3.2. Mesure de la peroxydation lipidique............................................................................. 128
6.3.3. Mesure de la concentration en protéines....................................................................... 130
7. Techniques d'histochimie et immunohistochimie........................................................... 131
7.1. Fixation du cerveau par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde ......................... 131
7.2. Coupes des cerveaux au cryostat...................................................................................... 132
7.3. Marquages immunohistologiques .................................................................................... 133
7.4. Coloration histologique à l’acétate de thionine................................................................ 135
RESULTATS - PREMIERE PARTIE .............................................................................. 137
1. Etude des propriétés neurotoxiques des peptides A β tronqués dans leur domaine amino-
terminal. ................................................................................................................................. 138
1.1. Introduction ...................................................................................................................... 138
1.2. Objectifs ........................................................................................................................... 139
1.3. Résultats - MANUSCRIT # 1 ........................................................................................ 140
1.4. Discussion ........................................................................................................................ 174
RESULTATS - DEUXIEME PARTIE 179
2. L’humanine, un peptide neuroprotecteur : étude de ses effets in vivo et in vitro........ 180
2.1. Introduction........ 180
2.2. Objectifs.......... 186
2.3. Résultats - MANUSCRIT # 2 ....................................................................................... 188
2.4. Discussion........ 229
CONCLUSION GENERALE .............................................................................................. 236
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................ 240
ANNEXES.............................................................................................................................. 267
PUBLICATION # 1............................................................................................................... 268 CATION # 2 281







5

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