Etude du système immunitaire d'un amphibien et analyse des effets de l'environnement sur sa réponse humorale, Analysis of the immune system of an amphibian and of the effects of the environment on its humoral response

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Sous la direction de Christian Dournon, Jean-Pol Frippiat
Thèse soutenue le 17 décembre 2009: Nancy 1
During my PhD, I have participated to the characterization of Pleurodeles waltl (urodele amphibian) antibody heavy chains and to the discovery of a new isotype that we named IgP. I have also demonstrated that each antibody heavy chain has its human counterpart. P. waltl IgM are the counterpart of human IgM. IgY are expressed in mucosa and are therefore the physiological counterpart of human IgA. Finally, IgP are predominantly expressed in larvae and are less diverse than IgM. These two characteristics are shared with antibodies produced by mammalian B1 cells. These studies allowed me to approach the effects of a long term spaceflight on the humoral immune response, i.e. the antibody mediated response, which up to now has been poorly studied. The Development and Immunogenetics team, JE 2537, has immunized adult P. waltl during their five month stay onboard the Mir space station and showed that heavy chain variable domains of specific IgM are encoded by genes belonging to the VHII and VHVI families. However, these families are used in different proportions in animals immunized onboard Mir by comparison to animals immunized on Earth. To better understand this difference, I have determined how these animals use their individual VHII and VHVI genes. My work revealed that only one VHII gene and four VHVI genes (A, B, C and D) are used by immunized animals. I observed an increase in the expression of IgM heavy chain mRNAs encoded by the VHII, VHVI.C and VHVI.D genes and a strong decrease in the expression of IgM heavy chain mRNAs encoded by the VHVI.A and VHVI.B genes in spaceflight animals, demonstrating that this environment affects the humoral response. These observations may be due to a change in B-cell selection under spaceflight conditions. Furthermore, I described for the first time the effects of spaceflight on somatic hypermutations. I isolated and characterized the P. waltl mRNA coding for the main effector of these mutations: the activation-induced cytidine deaminase (AID). I demonstrated that this protein is present and conserved in P. waltl. Then, I described somatic hypermutations in P. waltl. I mapped somatic hypermutations, studied their distribution and calculated their frequency in animals immunized on Earth and in animals immunized onboard the Mir space station. This work revealed a strong depression of somatic hypermutations in animals immunized onboard Mir. This observation does not result from a change in AID transcription. We believe that this may be the consequence of a lower B lymphocyte survival under spaceflight conditions.
-Immunité humorale
-Chaînes lourde d'anticorps
-Vol spatial
-Hypermutations somatiques
-Gène VH
-Activation-induced cytidine deaminase
-Amphibien urodèle
Durant ma thèse, j'ai participé à la caractérisation des isotypes de chaînes lourdes d'anticorps chez le pleurodèle (Pleurodeles waltl, amphibien urodèle) et à la mise en évidence d'un nouvel isotype d'anticorps : les IgP. J'ai également montré que chaque chaîne lourde a son équivalent humain. Les IgM du pleurodèle sont l'équivalent des IgM humaines. Les IgY sont exprimées principalement au niveau des muqueuses tout comme les IgA humaines. Enfin, les IgP sont observées majoritairement chez les larves et ont une diversité plus faible que les IgM. Ces deux caractéristiques sont partagées avec les anticorps produits par les cellules B1. Ces travaux m'ont ensuite permis d'aborder l'impact d'un séjour de longue durée dans l'espace sur la réponse immunitaire humorale, c'est-à-dire la réponse médiée par les anticorps qui, jusqu'à présent, a été très peu étudiée. L'équipe Développement et Immunogénétique, JE 2537, a immunisé des pleurodèles lors d'un séjour de 5 mois à bord de la station spatiale Mir et a montré que les chaînes lourdes d'IgM produites en réponse à la stimulation antigénique sont fabriquées à partir de gènes des familles VHII et VHVI. Cependant ces familles sont utilisées dans des proportions différentes chez les animaux immunisés dans Mir. Mes travaux ont permis d'approfondir ces résultats par une étude des gènes VHII et VHVI utilisés dans ces chaînes lourdes. J'ai ainsi montré qu'un seul gène VHII et quatre gènes VHVI (A, B, C et D) sont utilisés par les animaux immunisés. Les gènes VHII, VHVI.C et VHVI.D sont plus exprimés chez les animaux immunisés dans Mir alors que l'expression des gènes VHVI.A et VHVI.B est fortement diminuée chez ces mêmes animaux. Ces résultats démontrent clairement que le séjour dans Mir a affecté la réponse immunitaire humorale de ces animaux. Ces observations pourraient résulter d'un changement de la distribution et de sélection des lymphocytes B dans l'espace. Par ailleurs, j'ai décrit pour la première fois les effets d'un séjour dans l'espace sur les hypermutations somatiques. Avant d'étudier ce phénomène, j'ai isolé et caractérisé chez le pleurodèle l'ARNm codant l'effecteur indispensable pour ces mutations : la protéine AID (activation-induced cytidine deaminase). J'ai ainsi montré que cette protéine est bien présente et conservée dans cette espèce. J'ai ensuite mis en évidence et caractérisé pour la première fois le phénomène des hypermutations somatiques chez le pleurodèle. Pour cela, j'ai étudié les profils des mutations observées, cartographié ces dernières et calculé leur fréquence. Ces différents critères ont été comparés entre les animaux immunisés sur Terre et les animaux immunisés à bord de la station Mir. Ainsi, j'ai pu montrer que la fréquence des hypermutations somatiques est diminuée chez les pleurodèles immunisés dans Mir. Cette diminution n'est pas due à un changement de la transcription d'AID mais pourrait être due à une diminution de la survie des lymphocytes B dans l'espace.
Source: http://www.theses.fr/2009NAN10129/document
Publié le : lundi 19 mars 2012
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http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php
http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm U.F.R. Sciences et Techniques Biologiques de la Faculté des Sciences et Techniques
Ecole Doctorale BioSE (Biologie-Santé-Environnement)
Thèse
Présentée et soutenue publiquement pour l’obtention du titre de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE HENRI POINCARE
Mention Sciences de la Vie et de la Santé
par Matthieu BASCOVE
Etude du système immunitaire d’un amphibien et analyse des
effets de l’environnement sur sa réponse humorale
Soutenance le 17 décembre 2009
Membres du Jury :
Rapporteurs : Mme Marie-Paule LEFRANC Professeur, IMGT, UPR CNRS 1142, Université de
Montpellier II
Mme Sarah BAATOUT Docteur, Laboratoire de Radiobiologie, SCK-CEN,
Mol, Belgique
Examinateurs : Mme Marie-Christine BENE Professeur, Laboratoire d’Immunologie, Université Henri
Poincaré, Nancy Université
M Eric TSCHIRHART Professeur, Unité de Recherche en sciences de la Vie,
Université du Luxembourg
M Jean-Pol FRIPPIAT Docteur, JE2537, Université Henri Poincaré, Nancy
Université, directeur de thèse
M Christian DOURNON Professeur Emérite, Université Henri Poincaré, Nancy
Université, co-directeur de thèse
-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
JE2537, Développement et Immunogénétique, 9 Avenue de la forêt de Haye, Faculté de
Médecine, Bâtiment AB, F- 54500 Vandoeuvre-lès-NancyRemerciements
Je tiens à remercier le Docteur Jean-Pol FRIPPIAT pour m’avoir fait l’honneur de
m’encadrer durant ma thèse et pour m’avoir donné sa confiance.

J’adresse également toute ma reconnaissance envers le Professeur Christian DOURNON
pour avoir accepté de codiriger cette thèse.

Je remercie le Professeur Marie-Paule LEFRANC et le Docteur Sarah BAATOUT d’avoir
accepté d’être les rapporteurs de ce manuscrit et adresse également toute ma gratitude envers
les Professeurs Marie-Christine BENE et Eric TSCHIRHART pour avoir accepté de
participer à ce jury et d’examiner mon travail.

Ces travaux n’auraient pas pu voir le jour sans le soutien financier du ministère de
l’enseignement supérieur et de la recherche, du centre national d’études spatiales et de
l’agence spatiale européenne.

J’adresse toute ma sympathie envers le Docteur Christine LEGRAND FROSSI, le Docteur
Bérénice SCHAERLINGER, le Docteur Cécile HUIN-SCHOHN, Christiane TANKOSIC,
et Nathan GUEGUINOU pour leur soutien technique, leur gentillesse et leurs conseils.

Je remercie le Professeur Stéphane FLAMENT ainsi que toute l’équipe EA3442 pour
m’avoir accueilli dans leur laboratoire.

Je remercie également toute ma famille pour m’avoir aidé financièrement et pour m’avoir
remotivé quand c’était nécessaire.

Enfin, je tenais particulièrement à remercier Elodie pour me « supporter » depuis ces quatre
années. Table des matières
INTRODUCTION ..............................................................................1
I. Les défenses de l’organisme contre les menaces externes.................................................. 2
II. Les anticorps...................................................................................................................... 3
II.1. Structure des anticorps................................................................................................ 3
II.2. Création du répertoire primaire d’anticorps : la recombinaison V(D)J...................... 4
II.2.1. Chronologie de la recombinaison V(D)J............................................................ 5
II.2.1.1. Réarrangement des gènes de chaîne lourde................................................. 5
II.2.1.2. ent des gènes de chaîne légère 5
II.2.2. Le mécanisme de la recombinaison ................................................................... 6
II.2.3. Variabilité générée par la recombinaison V(D)J................................................ 9
II.3. Les structures canoniques des boucles constituant les sites de liaison à l’antigène ... 9
III. Les modifications somatiques des anticorps .................................................................. 10
III.1. Les mutations somatiques ....................................................................................... 10
III.2. La commutation de classe 12
III.3. Mécanisme de la maturation des anticorps ............................................................. 13
III.3.1. Points communs entre les hypermutations somatiques et la commutation de
classe .......................................................................................................................... 13
III.3.2. La protéine AID ............................................................................................... 14
III.3.3. La régulation d’AID......................................................................................... 15
III.3.3.1. Régulation transcriptionnelle .................................................................... 15
III.3.3.2. Régulation post-transcriptionnelle ............................................................ 17
III.3.3.3. Régulation post-traductionnelle ................................................................ 18
III.3.4. Autres facteurs impliqués dans les mécanismes d’hypermutation et de
commutation de classe ................................................................................................. 20
III.3.5. Modèles possibles ............................................................................................ 21
III.3.5.1. Modèle de Schanz et al ............................................................................. 21
III.3.5.2. Modèle par transcription inverse............................................................... 23
IV. Phylogénie de la réponse humorale ............................................................................... 23
IV.1. Apparition de la réponse immunitaire adaptative ................................................... 23
IV.2. Les isotypes d’immunoglobulines chez les vertébrés ............................................. 25
IV.3. Les répertoires de gènes VH ................................................................................... 26
IV.4. Organisations des loci d’anticorps chez les vertébrés 27
iIV.5. La recombinaison V(D)J dans les différentes classes de vertébrés ........................ 28
IV.6. Evolution de la commutation de classe et des hypermutations............................... 29
IV.6.1. La commutation de classe chez les amphibiens et les poissons....................... 30
IV.6.2. Les mutations somatiques chez les amphibiens et les poissons 31
V. Effet d’un vol spatial sur le système immunitaire........................................................... 32
V.1. Croissance, résistance et virulence microbienne...................................................... 33
V.2. Organes lymphoïdes et sous-populations cellulaires................................................ 33
V.3. Immunité innée......................................................................................................... 34
V.4. Immunité cellulaire................................................................................................... 35
V.5. Immunité humorale .................................................................................................. 36
Publication 1 (Journal of leukocyte biology, 2009) .........................37
VI. Objectifs ......................................................................................................................... 38
RESULTATS ....................................................................................39
Partie 1 : Caractérisation des isotypes d’anticorps produits par P.
waltl....................................................................................................40
I. Introduction....................................................................................................................... 40
II. Isotypes produits par le pleurodèle.................................................................................. 40
III. Les IgP sont spécifiques au genre Pleurodeles .............................................................. 41
IV. Origine possible des IgP ................................................................................................ 42
V. Expression des isotypes de P. waltl................................................................................. 42
VI. Diversité des chaînes lourdes d’IgM et d’IgP................................................................ 43
VII. Similitudes entre les cellules productrices d’IgP et les cellules B1 des mammifères .. 45
Publication 2 (Molecular immunology, 2008) .................................46
Partie 2 : Changements de l’expression des gènes VH après un
séjour de longue durée dans l’espace..............................................47
I. Introduction....................................................................................................................... 47
II. Nombre de gènes VHII et VHVI présents dans le génôme de P. waltl........................... 47
III. Gènes VH utilisés lors de la réponse humorale des animaux immunisés ...................... 47
IV. Expression individuelle des gènes VHVI ...................................................................... 48
V. Variabilité des régions CDR3 des réarrangements VHII-D-JH ...................................... 50
Publication 3 (FASEB journal, 2009)..............................................51
iiPartie 3 : Caractérisation de l’ARNm d’AID chez le pleurodèle .52
I. Introduction....................................................................................................................... 52
II. Découverte de l’ARNm d’AID chez P. waltl (pAID) ..................................................... 52
III. La région 3’UTR du transcrit de pAID contient un site consensus pour le microRNA
miR155................................................................................................................................. 53
IV. Comparaison de pAID avec AID d’autres espèces........................................................ 53
V. Expression de pAID durant le développement précoce du pleurodèle............................ 54
VI. Profil d’expression de pAID chez le pleurodèle adulte ................................................. 54
VII. Epissage alternatif de pAID.......................................................................................... 55
Publication 4 (molecular immunology, 2010)..................................57
Partie 4 : Etude de la maturation de l’affinité des anticorps après
un séjour de longue durée dans l’espace (non-publié)...................58
I. Introduction....................................................................................................................... 58
II. Résultats........................................................................................................................... 58
II.1. séquençage du gène VHII utilisé pour produire les chaînes lourdes des IgM chez les
animaux étudiés................................................................................................................ 58
II.2. Nature des mutations. ............................................................................................... 59
II.3. Fréquence des mutations .......................................................................................... 60
II.4. Quantification des transcrits d’AID.......................................................................... 61
III. Discussion ...................................................................................................................... 62
III.1. Maturation de l’affinité des anticorps chez le pleurodèle ....................................... 62
III.2. Effet du séjour dans l’espace sur la maturation de l’affinité des anticorps............. 64
III.3. Causes potentielles de la diminution des hypermutations dans l’espace ................ 65
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .........................................67
ANNEXE ...........................................................................................71
RÉFÉRENCES .................................................................................73
iiiAbréviations
ADAR : Adenosine Deaminase, RNA-specific
ADN : Acide DésoxyriboNucléïque
ADNc : Acide DNucléïque complémentaire
Ag : Antigène
AID : Activation Induced cytidine-Deaminase
ALL : Acute Lymphoblastic Leukemia
AMPc : Adénosine Monophosphate cyclique
APOBEC-1 : APOlipoprotein B mRNA editing Enzyme, Catalytic polypeptide 1
ARN : Acide RiboNucléïque
ARNm : Acide RiboNucléïque messager
BCR : B-Cell Receptor
BER : Base Excision Repair
Blimp1 : B lymphocyte-induced maturation protein 1
C.S. : Canonical Structure
C3B : Complement component 3B
CaM : Calmoduline
CD21R ; CR3d ; CR2 : Complement component (3d/Epstein Barr virus) Receptor 2
CDR : Complementarity Determining Region
Cellule NK : Cellule Natural Killer
CFU : Colony Forming Unit
CH : domaine Constant de chaîne lourde (Heavy)
CL : domaine Constant de chaîne légère (Light)
CP : Connecting Peptide
CRM1 : Chromosome Region Maintenance 1
CSR : Class Switch Recombination
D : segment de Diversité
DNA-PKc : DNA-activated, Protein Kinase catalytic polypeptide
DNP-KLH : DiNitroPhenylated Keyhole Limpet Hemocyanin
EBV : Epstein Barr Virus
Ei-MAR : Enhancer intronique – Matrix Attachement Region
Exo 1 : Exonuclease 1
ivFR : Framework Region
GANP : Germinal center-Associated Nuclear Protein
HEV : High Endothelial Veinule
HoxC4 : HomeoboxC4
Id2 : Inhibitor of DNA binding 2
IFN : Interféron
Ig : Immunoglobuline
IL : Interleukine
JH : domaine de Jonction de chaîne lourde (Heavy)
JL : domaine de Jonction de chaîne légère (Light)
KO : Knock Out
LMB : Leptomycine B
LPS : Lipopolysaccharide
LRR : Leucine Rich Region
LRRNT : Leucine Rich Region N-Terminal
Me : Methyl
MSH : MutSHomolog
NAR : New ou Nurse shark Antigen Receptor
NES : Nuclear Export Signal
NFB : Nuclear Factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells
NLS : Nuclear Localization Signal
PAX5 : Paired box 5
PCNA : Proliferating Cell Nuclear Antigen
PCR : Polymerase Chain Reaction
PKA : Protein Kinase AMP-activated
Pol. : Polymérase
RACE : Rapid Amplification of cDNA Ends
RAG : Recombination Activating Gene
RPA : Replication Protein A
RT : Reverse Transcription
SHM : Somatic HyperMutations
STAT6 : Signal Transducer and Activator of Transcription 6
Syndrome HIGM : syndrome Hyper-IgM
TdT : Terminal deoxynucleotidyl Transferase
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