Étude protéomique de la microhétérogénéité des caséines [alpha]s1 et [bêta] équines : identification des variants transcriptionnels et de phosphorylation ; identification des sites phosphorylés de la caséine [bêta], Proteomic study of the microheterogeneity of equine [alpha]s1 and [bêta] caseins : identification of post-transcriptional and phosphorylation variants ; identification of phosphorylated sites of [beta] casein

De
Publié par

Sous la direction de Jean-Luc Gaillard
Thèse soutenue le 21 novembre 2008: INPL
La caséine [bêta] (CN-[bêta]) et la caséine [alpha]s1 (CN-[alpha]s1) du lait de jument possèdent un taux variable de phosphorylation et sont de bons modèles d’étude de l’influence du degré de phosphorylation et de la séquence peptidique sur la chélation de caséinophosphopeptides (CPP) avec des minéraux d’intérêt nutritionnel. Avant d’envisager une telle étude, la structure des caséines doit être déterminée précisément. Notre travail a été consacré à la caractérisation de variants post-transcriptionnels et post-traductionnels de CN-[alpha]s1 et de CN-[bêta]. Après fractionnement chromatographique et analyse par spectrométrie de masse, la CN-[alpha]s1 entière, trois variants d’épissage alternatif des exons 7 et 14 de la CN-[alpha]s1 et quatre variants délétés du résidu Gln91, résultat de l’utilisation d’un site d’épissage cryptique, ont été identifiés dans le lait équin. Nous avons montré que le degré de phosphorylation de ces isoformes varie de 2 à 8 groupes phosphates. Au total, 36 isoformes différentes de CN-[alpha]s1 ont été caractérisées. La cartographie bidimensionnelle de la CN-[bêta] a été établie avec précision après avoir isolé par chromatographie chacun des variants de phosphorylation (possédant de 3 à 7 groupes phosphates) et après avoir caractérisé les formes de CN-[bêta] modifiées par désamidation non enzymatique du résidu Asn135. Des CPP trypsiques de chaque variant de phosphorylation ont été préparés avec une technique récente de chromatographie d’affinité au dioxyde de titane, ce qui a permis de localiser par spectrométrie de masse en tandem les sites phosphorylés de la CN-[bêta] (Ser9, Ser10, Thr12, Ser18, Ser23, Ser24, Ser25) et de montrer que la phosphorylation de la CN-[bêta] n’est pas aléatoire mais séquentielle
-Lait de jument
-Caséinophosphopeptide
-Epissage alternatif
-Phosphorylation variable
-Caséines équines
Equine [bêta]-casein ([bêta]-CN) and [alpha]s1-casein ([alpha]s1-CN) have a variable phosphorylation degree and are good models for the study of the influence of phosphorylation degree and peptide sequence on chelation of caseinophosphopeptides (CPP) with minerals of nutritional interest. Before considering such study, structure of caseins must be precisely determined. Our work has been devoted to the characterization of post-transcriptional and post-translational variants of [alpha]s1-CN and [bêta]-CN. Concerning [alpha]s1-CN, the full-length protein, three alternative splicing variants involving exons 7 and 14 and four variants involving cryptic splice site resulting in deletion of residue Gln91 have been identified in mare’s milk after chromatographic fractionation and mass spectrometric analysis. The phosphorylation degree of these variants varies between 2 and 8 phosphate groups. Finally, 36 isoforms of [alpha]s1-CN have been identified. Isolation of each phosphorylation variant (having 3 to 7 phosphate groups) of [bêta]-CN by chromatography, and characterization of modified forms of [bêta]-CN by non enzymatic deamidation of residue Asn135 permits the establishment of bidimensional cartography of [bêta]-CN with precision. After hydrolysis by trypsin, CPP of each phosphorylation variant have been prepared by affinity chromatography to titanium dioxide, a recent technology, which allowed to locate by mass tandem spectrometry the phosphorylated sites of [bêta]-CN (Ser9, Ser10, Thr12, Ser18, Ser23, Ser24, Ser25). It was shown that the phosphorylation of [bêta]-CN is not a random process but follows a sequential way
-Mare’s milk
-Caseinophosphopeptide
-Alternative splicing
-Variable phosphorylation
-Equine casein
Source: http://www.theses.fr/2008INPL089N/document
Publié le : vendredi 28 octobre 2011
Lecture(s) : 151
Voir plus Voir moins
Cette publication est accessible gratuitement


AVERTISSEMENT



Ce document est le fruit d’un long travail approuvé par le jury de
soutenance et mis à disposition de l’ensemble de la communauté
universitaire élargie.
Il est soumis à la propriété intellectuelle de l’auteur au même titre que sa
version papier. Ceci implique une obligation de citation et de
référencement lors de l’utilisation de ce document.
D’autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite entraîne une
poursuite pénale.

Contact SCD INPL : scdinpl@inpl-nancy.fr




LIENS




Code de la propriété intellectuelle. Articles L 122.4
Code de la propriété intellectuelle. Articles L 335.2 – L 335.10
http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php
http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm
b
b
b
a
b
a
b
a
b
b
b
a

INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires
Ecole doctorale Science et Ingénierie des Ressources, Procédés, Produits,
Environnement

THESE

Présentée pour l’obtention du grade de
Docteur de l’Institut National Polytechnique de Lorraine
Discipline : Sciences Agronomiques

Soutenue publiquement le 21 novembre 2008 par

Aurélie MATEOS

Etude protéomique de la microhétérogénéité des caséines et équines : s1
identification des variants post-transcriptionnels et de phosphorylation ;
identification des sites phosphorylés de la caséine .



Membres du jury :
Rapporteurs : M. Saïd BOUHALLAB, Directeur de recherche, INRA, Rennes
M. Jean-Marc CHOBERT, Directeur de Recherche, INRA, Nantes
Examinateurs : M. Jean-Luc GAILLARD, Professeur, Université de Caen (Directeur de thèse)
M. Patrice MARTIN, Directeur de recherche, INRA, Jouy-en-Josas
M. Laurent MICLO, Maître de conférences, UHP, Nancy 1
Membre invité : M. Jean-Michel GIRARDET, Ingénieur d’études, UHP, Nancy 1

Unité de Recherche Animal et Fonctionnalités des Produits Animaux
Equipe Protéolyse et Biofonctionnalité des Protéines et Peptides
Faculté des Sciences et Techniques, Université Henri Poincaré- 54500 Vandœuvre-lès-Nancy Avant-propos

Ce travail a été réalisé au sein de l’équipe Protéolyse et Biofonctionnalités de
Protéines et Peptides de l’Unité de Recherche sur l’Animal et la Fonctionnalité des Produits
Animaux. Je tiens à remercier le Pr Guido Rychen, directeur d’unité, pour m’avoir accueillie
au sein de son laboratoire. Je remercie également chaleureusement le Pr Annie Dary pour ces
3 années passées au sein de son équipe.
Je tiens à remercier le Pr Jean-Luc Gaillard, mon directeur de thèse, pour m’avoir
donné la chance de pouvoir réaliser ce travail de thèse, moi qui n’étais pas initialement
biochimiste de formation…
Un grand merci au Dr Jean-Michel Girardet pour m’avoir suivie et supportée pendant
ces 3 années. C’est Jean-Michel qui m’a accueillie le premier jour et qui m’a initiée à
quasiment toutes les techniques que j’ai été amenée à utiliser. Il m’a également été de bon
conseil au cours de la rédaction de mes publications et de ce manuscrit, j’ai beaucoup appris
grâce à lui. Il a toujours été là quand j’avais besoin de lui pour un conseil, une manip ou juste
pour discuter autour d’une tasse de thé ! Merci Jean-Mi.
Merci également au Dr Laurent Miclo, mon co-directeur (pour moi en tout cas tu
l’es !). Cela fut un grand plaisir et un honneur de travailler avec quelqu’un comme Laurent.
Toujours disponible même quand son agenda était surbooké (surtout ces derniers temps…),
ses conseils m’ont été précieux tout au long de mon travail.
Merci au Dr Daniel Mollé de l’INRA de Rennes pour avoir contribué à la réalisation
de ce travail.
Je remercie aussi Delphine, Nawara, Maira, Frédérique, Faïza, Wessam et Ounki, mes
collègues thésards, pour leur soutien au quotidien et leur bonne humeur. Cela fut un plaisir de
travailler à vos côtés pendant ces quelques années.
Merci également à Emeline pour ton amitié et tes conseils ainsi que pour avoir été ma
partenaire de club pendant tout ce temps…
Une pensée particulièrement pour Leila, une stagiaire devenue une bonne amie, une
pensée également aux autres stagiaires qui ont participé de près ou de plus loin à ces travaux.
Merci également aux membres de l’équipe PB2P, Clarisse, Céline, Magali, Anne,
Catherine, Chantal, Emilie, Katy, Alain, Gérard mais aussi Frank pour leur enthousiasme, leur
sympathie et leur soutien.
Je souhaite également remercier les membres de l’équipe DAC, Jean, Pascal, Marielle
et Jean-Noël pour m’avoir fait découvrir pour la première fois le monde de la recherche.
Merci aussi à Magali avec qui se fut un plaisir de travailler. Merci Jean de m’avoir poussée à
postuler pour cette thèse qui m’a fait passer de l’étude de la perche commune au lait de
jument !
Un grand merci à Arnaud qui m’a soutenue et supportée pendant ces 3 années même
quand la distance nous a séparé…Tu m’as épaulée dans mes moments de doutes et de
désarroi, tu as toujours été là pour moi. Merci.
Merci également à la famille Griot-Campeas pour leur soutien et leur intérêt pour mon
travail. Une pensée pour Albert, un homme d’un âge vénérable que j’admire beaucoup.
Le plus important, ma famille. Je remercie de tout mon coeur mes parents d’avoir
toujours cru en moi et d’avoir contribué à ce que je suis aujourd’hui. Je vous remercie pour
votre soutien indéfectible pendant toute ma scolarité et d’avoir toujours été là en cas de
besoin. Une pensée pour Marie-José qui a réussi à trouver sa voie et finalement bien qu’étant
le numéro 3 est diplômée avant moi ! L’année 2008, finalement, est celle des palmes et des
lauriers ! Merci soeurette pour tous les moments partagés ensemble, les bons comme les
mauvais. Un gros bisous à ma Lolo, ma petite sœur, qui est née alors que je débutais mon
parcours universitaire, et nous voilà quasiment 10 ans plus tard…Que le temps passe vite !
2 D
b
b
D
D
D
D
D
b
D
D
D
D
D
D
D
D
D
b
D
b
D
D
D
D
Liste des abréviations

ACN : acétonitrile
AMP : adénosine monophosphate
Api III+ : spectromètre de masse tandem à triple quadrupôle
BAEE : N-benzoyl-L-arginine éthyl ester
-LG : lactoglobuline
C : rapport (en %) de la masse de bisacrylamide sur la masse d’acrylamide + bisacrylamide
CAPS : acide 3-(cyclohexylamino)-1-propanesulfonique
CHAPS : sulfonate de 3-[(3-cholamidopropyl)-diméthylammonio]-1-propane
CKG : caséine kinase golgienne
CK1 : caséine kinase I
CK2 : caséine kinase II
CN : caséine
CPP : caséinophosphopeptide
d : déphosphorylé
/d : désamidé
2-DE : électrophorèse bidimensionnelle
DEAE : diéthylaminoéthyle
DHB : acide 2,5-dihydroxybenzoïque
H : enthalpie
G : énergie libre
Q : délétion d’un résidu Gln
S : entropie
X : délétion de la région codée par l’exon X
ECA : enzyme de conversion de l’angiotensine
EDTA : éthylènediaminetétracétate
ESE : exonic splicing enhancer
ESI : ionisation à électropsray
ESS : exonic splicing silencer
FPLC : fast protein liquid chromatography (chromatographie liquide rapide des protéines)
F : fraction chromatographique
GABA : acide gamma-aminobutyrique
3 Gal : galactose
GalNAc : N-acétylgalactosamine
HIC : hydrophobic interaction chromatography (chromatographie d’interactions hydrophobe)
hnRNP : heterogeneous nuclear ribonucleoprotein
HPLC : high pefrormance liquid chromatography (chromatographie liquide haute
performance)
IEC : ion-exchange chromatography (chromatographie d’échange d’ions)
IEF : isoélectrofocalisation
Ig : immunoglobuline
IMAC : immobilized metal affinity chromaography (chromatographie d’affinité aux métaux
immobilisés)
IPG : immobilized pH gradient (gradient de pH immobilisé)
ISE : intron splicing enhancer
ISS : intron splicing silencer
ITC: microcalorimétrie à titration isotherme
K : constante d’affinité A
LC/ESI-MS: chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse à ionisation
électrospray
LSm : protéine « Sm-like »
MOAC : metal oxide affinity chromatography (chromatographie d’affinité aux oxydes
métalliques)
m/v : masse par volume
m/z : masse sur charge
NeuAc : acide N-acétylneuraminique
XP : X groupement(s) phosphate
PAGE : polyacrylamide gel electrophoresis (électrophorèse sur gel de polyacrylamide)
pHi : pH isoélectrique
PIMT : L-isoaspartyl méthyltransférase
PMSF : fluorure de phénylméthylsulfonyle
PP : protéose-peptone
PVDF : difluorure de polyvinylidène
Q/Star XL : spectromètre de masse hybride quadrupôle/temps de vol
R : distance de migration relative f
SerP : résidu de sérine phosphorylé
4 SDS : dodécylsulfate de sodium
SF : sous-fraction chromatographique
Sm : protéine Sm appelée ainsi car elle réagit avec les anticorps auto-immuns de sérotype Sm
de patients atteints de lupus érythémateux systémique
SMN : survival of motor neuron
SnRNA : small nuclear ribonucleic acid
SnRNP : small nuclear ribonucleoprotein
sucWGA : succinylated wheat germ agglutinin (lectine de germe de blé succinylée)
T : rapport (en %) de la masse d’acrylamide + bisacrylamide sur le volume de gel
TFA : acide trifluoroacétique
TPCK : L-1-tosylamido-2-phényléthyl chlorométhyl cétone
Tris : trihydroxy-méthyl-amino-méthane
UV : ultraviolet
v/v : volume par volume
WGA : wheat germ agglutinin (lectine de germe de blé)
5 b
a
a
k
Sommaire
Avant-proposU ............................................................................................................................. 2
Liste des abréviationsU ................................................................................................................ 3
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUEU .............................................................................. 9
1. Les protéines du laitU.................................................................................................................... 12
1.1. Les protéines lactosériquesU ................................................................................................................ 12
1.2. Les caséinesU ......................................................................................................................................... 14
1.2.1. La caséine U.................................................................................................................................. 15
1.2.2. La caséine U ............................................................................................................................... 18 s1
1.2.3. La caséine U ............................................................................................................................... 22 s2
1.2.4. La caséine U.................................................................................................................................. 23
1.2.5. La micelle de caséinesU .................................................................................................................. 27
2. Modification post-transcriptionnelle : l’épissage conventionnel et l’épissage alternatif
d’exonsU ............................................................................................................................................. 31
2.1. Le splicéosomeU .................................................................................................................................... 31
2.2. Le processus d’épissageU ..................................................................................................................... 34
..................................................................................................................................................................... 37
2.3. L’épissage alternatifU........................................................................................................................... 38
2.3.1. Facteurs influençant la reconnaissance d’un exonU 38
2.3.2. Les sites d’épissage cryptiquesU..................................................................................................... 43
2.3.3. Les différents types d’épissage alternatif pouvant être rencontrésU............................................... 43
2.4. L’épissage des caséinesU....................................................................................................................... 45
2.4.1. Structure des gènes des caséines bovinesU..................................................................................... 45
2.4.2. Epissage alternatif des caséinesU ................................................................................................... 47
3. Modifications post-traductionnelles : phosphorylation et glycosylation des caséinesU .......... 49
3.1. Phosphorylation des caséinesU ............................................................................................................ 49
3.2. Glycosylation des caséinesU ................................................................................................................. 51
4. Les lactoprotéines, source de peptides à activités biologiquesU................................................ 51
4.1. Peptides anti-microbiensU.................................................................................................................... 54
4.2. Peptides anti-hypertenseursU .............................................................................................................. 55
4.3. Peptides antithrombotiquesU............................................................................................................... 56
4.4. Peptides à activité opiacéeU ................................................................................................................. 56
4.5. Peptide anxiolytiqueU........................................................................................................................... 57
4.6. Cas des caséinophosphopeptidesU....................................................................................................... 58
4.6.1. Activité anti-oxydanteU................................................................................................................... 59
4.6.2. Activité anti-cariogèneU ................................................................................................................. 60
4.6.3. Effet mitogèneU............................................................................................................................... 61
4.6.4. Chélation de minéraux d’intérêt nutritionnel : exemple du calcium et du ferU .............................. 61
CONTEXTE ET OBJECTIFS DU TRAVAILU....................................................................... 66
MATERIELS ET METHODESU...................................................................................................... 70
1. Préparation du caséinate de sodiumU ......................................................................................... 71
2. Méthodes électrophorétiques et techniques attenantesU ........................................................... 72
2.1. Electrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (PAGE-SDS)U
..................................................................................................................................................................... 72
2.2. Electrophorèse en gel de polyacrylamide en présence d’urée (PAGE-urée)U................................. 72
2.3. Electrophorèse bidimensionnelle couplant une isoélectrofocalisation (IEF) et une PAGE-SDSU. 73
2.4. Electrotransfert de protéinesU............................................................................................................. 74
2.4.1. En cuve verticaleU .......................................................................................................................... 74
2.4.2. Transfert semi-secU ........................................................................................................................ 74
2.5. Révélation des protéines au bleu de Coomassie R-250U.................................................................... 75
2.6. Révélation des protéines sur la membrane de PVDFU...................................................................... 75
6

Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.

Lisez à volonté, où que vous soyez
1 mois offert, sans engagement Plus d'infos