Expandierung und Charakterisierung virusspezifischer humaner zytotoxischer T-Zellen unter dem Einfluss dendritischer Zellen [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Andrea Stilper

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Expandierung und Charakterisierung virusspezifischer humaner zytotoxischer T-Zellen unter dem Einfluss dendritischer Zellen DenNaturwissenschaftlichenFakultätenderFriedrichAlexanderUniversitätErlangenNürnbergzurErlangungdesDoktorgradesVorgelegtvonAndreaStilperausLaufa.d.PegnitzAlsDissertationgenehmigtvondenNaturwissenschaftlichenFakultätenderUniversitätErlangenNürnbergTag der mündlichen Prüfung: 14. Januar 2008 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. G. H. Fey Zweitberichterstatter: Prof. Dr. W. Rascher Inhaltsverzeichnis Seite 3 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung.................................................................................................7 2 Einleitung .............................................................................................................10 2.1 Prinzipien und Einsatz adoptiver zellulärer Immuntherapie .........................10 2.2 Dendritische Zellen und ihre Aufgabe in der Immunantwort ........................11 2.2.1 Herkunft und Entwicklung humaner dendritischer Zellen .................11 2.2.2 Antigen-Aufnahme und -Prozessierung durch dendritische Zelle ....13 2.2.3 Aktvierung einiger TLRs...................................................................17 2.2.4 Reifung und Migration von dendritischen Zellen .........
Publié le : mardi 1 janvier 2008
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Expandierung und Charakterisierung virusspezifischer
humaner zytotoxischer T-Zellen unter dem Einfluss
dendritischer Zellen







DenNaturwissenschaftlichenFakultäten
derFriedrichAlexanderUniversitätErlangenNürnberg

zur

ErlangungdesDoktorgrades













Vorgelegtvon
AndreaStilper
ausLaufa.d.Pegnitz






AlsDissertationgenehmigtvondenNaturwissenschaftlichenFakultätender
UniversitätErlangenNürnberg
















Tag der mündlichen Prüfung: 14. Januar 2008

Vorsitzender der
Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. G. H. Fey

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. W. Rascher Inhaltsverzeichnis Seite 3
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung.................................................................................................7
2 Einleitung .............................................................................................................10
2.1 Prinzipien und Einsatz adoptiver zellulärer Immuntherapie .........................10
2.2 Dendritische Zellen und ihre Aufgabe in der Immunantwort ........................11
2.2.1 Herkunft und Entwicklung humaner dendritischer Zellen .................11
2.2.2 Antigen-Aufnahme und -Prozessierung durch dendritische Zelle ....13
2.2.3 Aktvierung einiger TLRs...................................................................17
2.2.4 Reifung und Migration von dendritischen Zellen ..............................21
2.3 Überblick über die antivirale Immunantwort .................................................23
2.3.1 Interaktionen zwischen T-Zellen und DCs und die Aktivierung
der T-Effektorzelle............................................................................23
pos2.3.2 Differenzierung von CD8 -T-Zellen................................................27
2.3.3 Einfluss von Zytokinen auf das CTL-System....................................28
2.3.3.1 IL-12 ...................................................................................29
2.3.3.2 IL-18 ...................................................................................30
2.3.3.3 TGF-ß1...............................................................................31
3 Zielsetzung...........................................................................................................32
4 Material und Methoden.........................................................................................33
4.1 Material........................................................................................................33
4.1.1 Medien, Puffer und Seren ................................................................33
4.1.2 Antikörper.........................................................................................37
4.1.3 HLA-A2 bindende Peptide................................................................39
4.1.4 Beads...............................................................................................40
4.1.5 Zytokine ...........................................................................................40
4.1.6 Zellkulturflaschen, -platten, -röhrchen..............................................40
4.1.7 Geräte..............................................................................................41
4.2 Methoden.....................................................................................................41
4.2.1 Isolierung mononukleärer Zellen und Monocyten aus
Leukozyten-Apheresaten .................................................................41
4.2.2 Einfrieren- und auftauen von Zellen .................................................43
4.2.3 Zellkultur ..........................................................................................43
4.2.4 Mikroskopie......................................................................................44
Inhaltsverzeichnis Seite 4
4.2.5 Herstellung des Lysats zur Beladung von Dendritischen Zellen ......44
4.2.6 Trypanblaufärbung...........................................................................45
4.2.7 Zählen von lebenden Zellen.............................................................45
4.2.8 Herstellung eines EBV Überstandes................................................45
4.2.9 Anlegen einer EBV Transformation..................................................46
4.2.10 Bestrahlen der LCLs für die CTL Kultur ...........................................46
4.2.11 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ...............................46
4.2.12 Pentamer Färbung............................................................................48
pos4.2.13 Analyse der Differenzierungsstufe der spezifischen CD8 -T-
Zellen ...............................................................................................49
4.2.14 Zellartbestimmung in der CTL-Kultur ................................................50
4.2.15 Reifungs-FACS Analyse für dendritische Zellen ...............................50
4.2.16 Perforin-Messung..............................................................................50
4.2.17 Reifung- und Peptid Beladung von dendritischen Zellen.......50
4.2.19 Generierung von Peptid spezifischen CTLs.....................................51
4.2.20 Zytotoxizitäts-Test............................................................................51
4.2.21 Statistik ............................................................................................53
5 Ergebnisse ...........................................................................................................54
5.1 Einfluss Lysat-beladener DCs auf polyklonale CTL-Kulturen.......................54
5.1.1 Generierung EBV-spezifischer CTLs durch autologe
EBV-transformierte LCLs .................................................................54
5.1.2 DC-Behandlung für den Einsatz im CTL-System .............................57
5.1.2.1 Beeinflusst EDTA die Viabilität der geernteten DCs?.........57
5.1.2.2 Auswirkung des Waschvorgangs auf die gesamte DC-
Ausbeute ............................................................................60
5.1.2.3 Erfolgt eine vollständige Ausreifung der DCs, nachdem
der Reifungsstimuli ausgewaschen wurde? .......................62
5.1.2.4 Vergleich der IL-12 Expression von DCs unter
verschiedenen Bedingungen ..............................................63
5.1.3 CTL-Generierung mit Lysat-beladenen autologen DCs im
Vergleich zu autologen LCLs ...........................................................66
5.1.4 Einfluss unterschiedlich gereifter und Lysat beladener- oder
unbeladener DCs auf die Generierung von CTLs ............................76
5.2 Einführung eines Peptidsystems zur Generierung von CTLs.......................84
5.2.1 Grundaufbau des Peptidsystems .....................................................84
Inhaltsverzeichnis Seite 5
5.2.2 Einfluss R848-TLR-gereifter DCs im Vergleich zu Zytokin-
Cocktail-gereiften DCs auf die CTLs................................................85
5.2.3 Einfluss anderer TLR-gereifter DCs auf die generierten CTLs.........93
5.3 Einfluss von Zytokinen auf die expandierten Peptid-spezifischen CTLs ......96
5.3.1 Einfluss von IL-12 auf die CTL-Kultur ..............................................96
5.3.2 Einwirkung von TGF-ß1 auf die Peptid-spezifischen CTLs............109
5.3.3 Einfluss von IL-18 auf Peptid-spezifische CTLs.............................116
6 Diskussion..........................................................................................................127
6.1 Einsatz dendritischer Zellen in der adoptiven Immuntherapie....................127
6.2 Einfluss unterschiedlich gereifter DCs auf die Generierung von CTLs.......129
6.3 Auswirkung der Kokultivierung von Zytokinen in der CTL-Kultur ...............133
6.4 Schlussmodel ............................................................................................138
7 Literaturverzeichnis ............................................................................................141
8 Abkürzungsverzeichnis ......................................................................................156
9 Eigene Veröffentlichungen .................................................................................158
10 Lebenslauf..........................................................................................................159
11 Danksagung .......................................................................................................160
12 Nachdruck der eigenen Veröffentlichungen .......................................................161

1 Zusammenfassung Seite 7
1 Zusammenfassung
Virusinfektionen stellen die häufigste Ursache für Komplikationen bei
Knochenmarktransplantationen dar. Ein langfristiges Ziel besteht darin, dieses
RisikodurchspezielleSysteme,z.B.mithilfeadoptiverzellulärerImmuntherapieauf
Basis zytotoxischer TZellen, zu kontrollieren. Hinsichtlich der Einführung einer
adoptivenzellulärenImmuntherapiesowieeineroptimalenNutzungdiesesSystems
isteineErforschungderGrundlagenvonbesondererBedeutung.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass anhand optimal behandelter DCs
spezifische CTLs erfolgreicher generiert werden können als mit den bisher
verwendetenLCLs.
Die Einführung eines Peptidsystems, in dem das BMLF1Peptid hauptsächlich
MemoryZellen und das MelanAPeptid naive Vorläuferzellen erreichte,
demonstrierte entscheidende Ergebnisse. So wurden mehr Antigenspezifische
posCD8 TZellen durch reife Peptidbeladene DCs gebildet als durch unreife Peptid
beladene DCs. Ferner wurde aufgezeigt, dass auch mit TLRgereiften DCs effektive
undspezifischeCTLshervorgebrachtwerdenkönnen.
EntscheidendeEinblickekonntenebenfallsimZusammenhangmitdemZytokinIL
pos12 sowie der Anreicherung von CD8 spezifischen TZellen im MelanA und
posBMLF1System gewährt werden. Die spezifische Anreicherung der CD8 TZellen
wurdeimBMLF1SystemmitIL12deutlichvermindert,imGegensatzzumMelan
ASystem, in welchem IL12 keinen Einfluss auf die Anreicherung der spezifischen
posCD8 TZellen besaß. Einen weiteren interessanten Aspekt lieferte die
Beobachtung,dassbeiderVerwendungvonTGFß1dernegativeEinflussvonIL12
imBMLF1Systemkompensiertwerdenkonnte.
Im MelanASystem wurde durch den Einsatz von IL12 eine Verstärkung der
Effektorfunktionenerforscht.EinVergleichderPhänotypendergeneriertenCTLsin
denbeidenPeptidsystemenBMLF1undMelanAdeutete aufUnterschiedehin.So
warz.B.derOberflächenmarkerCD27imMelanASysteminKombinationmitIL12
leichterniedrigt.
EinweiteresResultatwar,dassderEffektorfaktorFasLinbeidenPeptidsystemenin
KombinationmitIL12undTGFß1deutlichanstieg.
1 Zusammenfassung Seite 8
posDasZytokinIL18beeinflusstediespezifischeCD8 TZellAnreicherungnicht.Es
wurde deutlich, dass IL18 in Kombination mit IL12 die Sekretion von FasL und
TNFαinbeidenPeptidsystemenerhöhenkann.






























1 Zusammenfassung Seite 9
1 Conclusion
Virusinfectionsshowthemostfrequentcauseforcomplicationswithmarrow
transplants.Alongtermpurposeconsistsincontrol lingthisriskbyspecialsystems,
e.g.,withthehelpofadoptivercellularimmunetherapyonthebasisofcytotoxicT
cells.Concerningtheintroductionofanadoptivencellularimmunetherapyaswellas
anoptimumuseofthissystemisaninvestigationofthebasesofspecialmeaning.
InthisworkcouldbeshownthatwiththehelpofoptimallytreatedDCsspecificCTLs
canbegeneratedmoresuccessfullythanwiththeLCLsuseduptonow.
TheintroductionofapeptidesysteminwhichtheBMLF1peptidsreachedprimarily
memorycellsandtheMelanApeptidenaiveprecursor'scells,demonstrated
posdeterminingresults.ThusmoreCD8 tcellsspecificforantigenwereformedby
ripepeptideloadedDCsthanbyimmaturepeptideloadedDCs.Furtheritwas
indicatedthatalsowithTLRmaturedDCsactualandspecificCTLscanbeproduced.
DetermininginsightscouldbelikewisegrantedinconnectionwiththeZytokintoIL
pos12aswellastheenrichmentbyTcellsspecificforCD8 intheMelanAandBMLF
pos1system.ThespecificenrichmentoftheCD8 Tcellswasclearlydecreasedinthe
BMLF1systemwithIL12,incontrasttotheMelanAsysteminwhichIL12owned
posnoinfluenceontheenrichmentofthespecificCD8 Tcells.
TheobservationdeliveredanotherinterestingaspectthatbytheuseofTGFß1the
negativeinfluencecouldbecompensatedbyIL12intheBMLF1system.
IntheMelanAsystemastrengtheningoftheeffectorfunctionwasinvestigatedby
theapplicationofIL12.AcomparisonofthePhänot ypenofthegeneratedCTLsin
bothpeptidesystemBMLF1andMelanApointedtodi fferences.Thus,e.g.,the
surfacemarkerCD27waseasilydegradedintheMelanAsystemincombinationwith
IL12.
AnotherresultwasthatoftheeffectorfactorFasLroseinbothpeptidesystemsin
combinationwithIL12andTGFß1clearly.ThecytokineIL18didnotinfluencethe
posspecificCD8 Tcellaccumulation.Itbecameclear,thatIL18incombinationwith
IL12thesecretionofFasLandTNFαinbothpeptidesystemscanraise.


2 Einleitung Seite 10
2 Einleitung
2.1 Prinzipien und Einsatz adoptiver zellulärer Immuntherapie
Die adoptive zelluläre Immuntherapie beruht auf dem Prinzip des adoptiven
TransfersvonLymphozyten,wodurch dieImmunkompetenzeines Individuumsauf
andere Individuen übertragen werden kann. J. L. Gowans konnte 1966 (Gowans &
Uhr,1966)durchseinTransferexperimentzeigen,dassLymphozytendiewichtigsten
Vermittler der Immunantwort und die Träger des immunologischen Gedächtnisses
repräsentieren. Seine Methode wurde weiterentwickelt, und es konnten sogar
posUntergruppenderLymphozytenübertragenwerden,z.B.BZellen,CD4 TZellen,
posCD8 TZellenusw.
Mittlerweile ist es möglich, auch antigenspezifische TZellen für die adoptive
Immuntherapie einzusetzen. Die spezifischen TZellen können dabei beispielsweise
gegen Tumorantigene oder virale Antigene (Ag) gerichtet sein. Die spezifischen T
Zellenwerdeninvitroaktiviert,indemihnenprofessionelleAntigenpräsentierende
Zellen (APC) die passenden Epitope bereitstellen. Die bedeutendsten Antigen
präsentierenden Zellen verkörpern dendritische Zellen (DC), Makrophagen und
aktivierteBZellen.
Es existieren mehrere Möglichkeiten, den APCs das gewünschte Antigen zur
PräsentationfürdieTZellenzuübermitteln.APCskönnendasgewünschteAntigen
endogenexprimierenundesdannnachderintrazellulärenProzessierungdurchihre
MHCKomplexe auf ihrer Oberfläche den TZellen unterbreiten. Ein anderer Weg
bestehtdarin,siemitsynthetischhergestelltenPeptidenzubeladen.
Die spezifische adoptive TZellTherapie ist noch sehr jung. Erste erfolgreiche
Ergebnisse konnten bei der Prophylaxe und Therapie von Posttransplantations
Lymphomen (PTLD) mit EpsteinBarrVirus (EBV)spezifischen TZellen sowie der
manifesten CytomegaloVirus (CMV)Infektion nach Transplantationen mit CMV
spezifischen TZellen erzielt werden. Dabei werden EBVspezifische TZellen durch
dieStimulationmitderautologenEBVinfiziertenBZelllinie,densogenanntenLCLs,
in vitro hergestellt (Riddell et al., 1992). Die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Riddel
belegte 1992, dass CMVspezifische TZellen generiert werden können. Die Gruppe
kokultivierte PMBCs (periphere mononukleäre Zellen aus dem Blut) sowie CMV
infizierte Fibroblasten und erreichte somit eine spezifische Stimulierung der
2 Einleitung Seite 11
ruhenden, antigenspezifischen TZellen. Daraus entwickelten sich monoklonale
posCD8 TZelllinien,welchedenPatientenverabreichtwurden(Riddelletal.,1992).
posDiese Ergebnisse demonstrierten, dass die CD8 TZellen für die klinische
Anwendungeingesetztwerdenkönnen.UmdiesenEinsatzzugewährleisten,sollten
posdie antigenspezifischen CD8 TZellpopulationen einfach und schnell gebildet
werden können. Außerdem sollten sie den Transfer in den Patienten gutüberleben
und im Empfängerorganismus möglichst lange ihre schützende Effektorfunktion
ausüben.BishererweistsichdieGenerierungantigenreaktiverTZellenalseinsehr
langwieriger Prozess. Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen daher die schnelle
GenerierungeffektiverCTLssowieeinespezifischeDefinitionderZellpopulationund
ihrer Effektorfunktionen. Zur effektiven Generierung wurden u. a. dendritische
Zellenherangezogen.
2.2 Dendritische Zellen und ihre Aufgabe in der Immunantwort
2.2.1 Herkunft und Entwicklung humaner dendritischer Zellen
Dendritische Zellen differenzieren sich aus omnipotenten
posKnochenmarksstammzellen (CD34 Zellen) (Schuler et al., 1993; Schuler &
Steinman, 1985) und finden sich in unreifen, frühen Stadien meistens im
nichtlymphoiden Gewebe (vgl. Abbildung 21). In diesem Gewebe kontrollieren sie
ihre Umgebung, indem sie durch Endozytose, Makropinozytose oder Phagozytose
extrazelluläre Bestandteile aufnehmen. Eine Reifung und damit eine Migration zu
densekundärenLymphoidorganenwirddurcheineInfektion,eineEntzündungoder
durchdieAktivierungüberlöslicheVermittler,wieetwaInterferone,ausgelöst.Auch
durchdieStimulierungenvonMitgliedernderTolllikeRezeptor(TLR)Familieund
von TumorNekroseFaktorRezeptor(TNFR)Familien wird eine Reifung und
somiteineMigrationzudenLymphorganenausgelöst.IndenLymphorganenkönnen
dieDCsmitdenTZelleninVerbindungtreten,umdiesefürdieImmunabwehrzu
aktivieren(Banchereauetal.,2000).DendritischeZellenagierensomitalseinehoch
entwickelte Brücke zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem
während der Infektionsabwehr (Steinman, 2003). Dieser Mechanismus wird durch
stark spezialisierte Prozesse kontrolliert, z. B. die Aufnahme von äußeren Signalen
und dem Wechsel des spezifischen Verhaltens der Zellen selbst. Darunter fällt die
Reifung der dendritischen Zellen, welche durch eine Reduktion der

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