Functional analysis of type III secretion systems in Salmonella enterica [Elektronische Ressource] = Funktionelle Analyse von Typ-III-Sekretionssystemen in Salmonella enterica / vorgelegt von Stefanie Hölzer

De
Functional analysis of type III secretion systems in Salmonella enterica Funktionelle Analyse von Typ-III-Sekretionssystemen in Salmonella enterica Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Stefanie Hölzer aus Haßfurt Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung: 25. März 2010 Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Michael Hensel Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski Danksagung Mein erster Dank gilt Prof. Dr. Martin Röllinghoff und seinem Nachfolger Prof. Dr. Christian Bogdan für die Möglichkeit, meine Promotion am Institut für Mikrobiologie anfertigen zu können. Bei Prof. Bogdan bedanke ich mich für das spannende Diagnostikseminar. Prof. Dr. Michael Hensel danke ich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, die Überlassung meines Promotionsthemas, seiner Aufgeschlossenheit gegenüber neuen Ideen und dafür, dass seine Tür für Diskussionen immer offen stand. Prof. Dr. Andreas Burkovski danke ich für seine Bereitschaft das Zweitgutachten für diese Arbeit zu übernehmen. Weiterhin möchte ich mich bei Prof. Dr. Dr. André Gessner und Prof. Dr.
Publié le : vendredi 1 janvier 2010
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Functional analysis of type III secretion systems
in Salmonella enterica


Funktionelle Analyse von Typ-III-Sekretionssystemen
in Salmonella enterica




Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.




vorgelegt von
Stefanie Hölzer
aus Haßfurt







Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen
Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg











Tag der mündlichen Prüfung: 25. März 2010

Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch

Erstberichterstatter: Prof. Dr. Michael Hensel

Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski





Danksagung

Mein erster Dank gilt Prof. Dr. Martin Röllinghoff und seinem Nachfolger Prof. Dr. Christian Bogdan
für die Möglichkeit, meine Promotion am Institut für Mikrobiologie anfertigen zu können. Bei Prof.
Bogdan bedanke ich mich für das spannende Diagnostikseminar.

Prof. Dr. Michael Hensel danke ich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, die Überlassung meines
Promotionsthemas, seiner Aufgeschlossenheit gegenüber neuen Ideen und dafür, dass seine Tür für
Diskussionen immer offen stand.

Prof. Dr. Andreas Burkovski danke ich für seine Bereitschaft das Zweitgutachten für diese Arbeit zu
übernehmen.

Weiterhin möchte ich mich bei Prof. Dr. Dr. André Gessner und Prof. Dr. Wolfgang Hillen bedanken,
die sich beide spontan bereit erklärt haben, als Prüfer zu fungieren.

Vielen lieben Dank an die Mitglieder der Ag Hensel, die mich in den letzten Jahren über kurze oder
lange Zeit begleitet haben: Meinen Joggingkollegen Anja, Caro, Petra und Sandra für die
allwöchentlichen Trainingsstunden und die herzlichen Aufmunterungen. Insbesonders Caro und Petra
möchte ich ganz herzlich danken für ihre Hilfe bei der Bewältigung des Laboralltags und für ihre
Freundschaft – je vous embrasse très fort. Dani danke ich für ihre Hilfe im Labor und für die
Ablenkung außerhalb des Labors wie Kürbis schnitzen, Grillen, Plätzchen backen. Roman für die nette
Laboratmosphäre und für die geduldige Einführung in die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie.
Barbara für die vielen Gespräche und aufbauenden Worte. Jonathan für seinen medizinischen Beistand
während der letzten vier Jahre. Alfonso für das Näherbringen der mexikanischen Kultur und das gute
mexikanische Essen. Dipa danke ich dafür, dass ich sie kennenlernen durfte und für ihre Herzlichkeit.
Lynn, Katharina und Nina danke ich für das nette Beisammensein. Herzlichen Dank an Britta, Caro,
Ralf und Tina für das aufmerksame Lesen und Verbessern dieser Arbeit. Petra sei Dank für die
Empfehlung und Erklärung des Buches: ‚Wissenschaftliche Arbeiten schreiben mit Word’. Ohne
Leo.org wäre diese Arbeit sicher auch nicht möglich gewesen, eine wirklich gute Erfindung.

Diana, Didi, Gerhard, Harald und Melanie danke ich für die vielen fröhlichen Augenblicke im Institut.

Dr. Walter Geißdörfer danke ich für seinen unermüdlichen Einsatz während meiner Sequenzierphase
und für die netten, hilfreichen Gespräche.

Bei Hasso Schüler bedanke ich mich für seinen Beistand bei computertechnischen Problemen. Ein
großer Dank gilt auch den ‚guten Geistern’ aus der Nährbodenküche, der Spülküche, des Lagers und
des Sekretariats, deren Unterstützung nicht unerheblich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
Manfred, der guten Seele des Hauses, sei ganz besonders gedankt für die Hilfe in jeder Lebenslage.

Unseren Kooperationspartner von der ETH Zürich und meinen Mitstreitern aus der BioMedTec
International Graduate School of Science (BIGSS) danke ich für die netten Abendstunden nach einem
interessanten, aber auch anstrengendem Wissenschaftstag. Besonders bei Markus Schlumberger
bedanke ich mich für die erfolgreiche Zusammenarbeit.

Ganz besonders möchte ich mich bei Frank bedanken, der gewissermaßen ‚mitpromoviert’ hat und
mich immer unterstützt hat.

Meiner Mama danke ich für ihre Fürsorge all die Jahre. Meinen Omas und Opas danke ich, dass sie
den Werdegang dieser Arbeit mit großem Interesse verfolgt haben, auch wenn sie mich deshalb nicht
so oft sehen konnten und noch etwas länger auf die langersehnten Urenkel warten müssen.

Table of contents
I. SUMMARY/ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................1
II. INTRODUCTION .................................................................................................4
1. Salmonella spp. pathogenesis ......................................................................................................................4
2. Structure and function of the Lipopolyssacharide of the Gram-negative cell envelope ........................8
2.1 Lipid A....................................................................................................................................................8
2.2 The LPS core unit ...................................................................................................................................9
2.3 The O-antigen .........................................................................................................................................9
3. Salmonella virulence factors........11
4. Salmonella pathogenicity islands ..............................................................................................................13
4.1 SPI1.......................................................................................................................................................13
4.2 SPI2...........................................................................................................................16
4.3 SPI3...........................................................................................................................21
4.4 SPI4.......................................................................................................................................................22
4.5 SPI5...........................................................................................................................22
4.6 SPI15-17 ...............................................................................................................................................23
4.7 Additional SPI.......................................................................................................................................23
5. Type III secretion systems in Salmonella .................................................................................................24
5.1 The flagella assembly system ...............................................................................................................25
5.2 The SPI1-encoded T3SS.......................................................................................................................27
5.3 The SPI2-encoded T3SS.............29
6. Tools for genomic manipulation of Salmonella .......................................................................................32
III. AIM OF THE WORK..........................................................................................35
IV. MATERIALS AND METHODS ..........................................................................36
1. Materials.....................................................................................................................................................36
1.1 Chemicals, materials and appliances.....................................................................................................36
1.2 Bacterial strains.....................................................................................................................................36
1.3 Plasmids................................................................................................................................................38
1.4 Oligonucleotides ...................................................................................................................................40
1.5 Buffers and Solutions............................................................................................................................43

I
Table of contents
1.5.1 Media for cultivation of bacteria.....................................................................................................43
1.5.2 Solutions for P22 transduction.......................................................................................................45
1.5.3 Bochner-Maloy agar .......................................................................................................................45
1.5.4 Buffers and solutions for SDS-PAGE.............................................................................................46
1.5.5 Buffers for Western Blot analyses and immune detection..............................................................48
1.5.6 Solutions for silver staining of LPS ................................................................................................48
1.5.7 Buffers and solutions for immunofluorescence analyses................................................................49
1.5.8 Buffers for luciferase assays ...........................................................................................................50
2. Methods.......................................................................................................................................................51
2.1 Bacterial culture conditions ..................................................................................................................51
2.2 Molecular genetic methods ...................................................................................................................51
2.2.1 DNA sequencing.............................................................................................................................51
2.2.2 Generation of bacterial competent cells and electrotransformation................................................52
2.2.3 P22 Phage transduction...................................................................................................................52
2.2.4 The  Red-mediated approach for gene replacement......................................................................53
2.2.4.1 The ‘classical’ method according to Datsenko and Wanner (2000) and Yu et al. (2000).....53
2.2.4.2 Modification of the ‘classical’ method according to Karlinsey and Hughes (2006) .............54
2.2.5 The QuikChange approach for the generation of plasmid-borne mutant alleles.............................54
2.2.6 Construction of mutant strains ........................................................................................................55
2.2.7 Construction of various plasmids for complementation or overexpression ....................................56
2.2.8 Constr mutant alleles of SseB and SseD ..............................................................56
2.3 Cell culture procedures .........................................................................................................................57
2.3.1 Infection procedure.........................................................................................................................57
2.3.2 Phagocytosis and intracellular replication in macrophages ............................................................58
2.3.3 Analyses of adhesion to and invasion of epithelial cells.................................................................58
2.4 Proteinbiochemical and immunological methods .................................................................................59
2.4.1 Polyacrylamid electrophoresis........................................................................................................59
2.4.2 Western Blot and immune detection...............................................................................................59
2.4.3 Analyses of LPS structure...............................................................................................................60
2.4.4 Preparation and analyses of protein expression and secretion in the background of
various O-antigen mutant strains ....................................................................................................60
2.4.5 Analyses of in vitro protein expression, surface attachment and secretion of SseB
and SseD mutant variants ...............................................................................................................61
2.4.6 Immunofluorescence analyses of intracellular SseB expression and secretion...............................62
2.4.7 Immunofluorescence analyses of SseJ translocation ......................................................................63
2.4.8 Quantification of translocation of T3SS effector proteins ..............................................................63
2.4.9 Determination of luciferase activities in bacterial lysates...............................................................64
2.4.10 Isolation of the SCV from infected macrophages ...........................................................................64
2.4.11 Analyses of serum sensitivity and killing by polymyxin B.............................................................65

II
Table of contents
2.4.12 Analyses of bacterial motility .........................................................................................................66
2.5 Bioinformatics ......................................................................................................................................67
V. RESULTS ..........................................................................................................68
1. Generation of a luciferase reporter fusion for the quantification of effector translocation by
the SPI2-encoded T3SS....................68
1.1 Rationale for the generation of a translational luciferase reporter fusion to the SPI2-
encoded T3SS effector SseJ by Red-mediated recombination..............................................................68
1.2 Synthesis of the SseJ-Luc reporter fusion in vitro ................................................................................70
1.3 Establishment of a luciferase-based translocation assay.......................................................................71
1.3.1 Determination of convenient infection conditions..........................................................................71
1.3.2 Kinetics of SseJ-Luc translocation into murine macrophages ........................................................72
2. The role of the O-antigen length of the LPS for the function of the various T3SS in
S. Typhimurium .........................................................................................................................................74
2.1 Construction and characterisation of LPS mutant strains with defined defects in O-antigen
length ....................................................................................................................................................74
2.2 Correlation between the O-antigen modal length and resistance to complement and
polymyxin B in Salmonella ..................................................................................................................75
2.3 Influence of O-antigen length modifications on bacterial motility .......................................................77
2.4 Effect of the O-antigen length on the function of the SPI1-encoded T3SS ..........................................78
2.4.1 Analyses of in vitro synthesis and secretion of the SPI1 effector SipA by O-antigen
mutant strains..................................................................................................................................78
2.4.2 Modulation of Salmonella host cell invasion by the O-antigen length ...........................................79
2.4.3 The translocation rate of the SPI1 effector SipA is enhanced in the background of
several O-antigen length variants ...................................................................................................82
2.5 Relationship between the O-antigen length and the function of the SPI2-encoded T3SS ....................83
2.5.1 Putative intracellular O-antigen length ...........................................................................................83
2.5.2 Production and in vitro secretion levels of the SPI2 T3SS substrate protein SseB.........................84
2.5.3 Uptake and intracellular replication of Salmonella is not affected by alteration of
the O-antigen length .......................................................................................................................86
2.5.4 The O-antigen length does not impair translocation of the SPI2 effector SseJ...............................87
3. Functional analysis of the putative translocon proteins SseB and SseD of the SPI2-encoded
T3SS ............................................................................................................................................................88
3.1 Mutagenesis of SseB.............................................................................................................................88
3.1.1 Construction and functional analyses of a convenient episomal expression system
for the genetic manipulation of SseB..............................................................................................88
3.1.2 Bioinformatical analysis and generation of episomal mutant alleles of SseB.................................90

III
Table of contents
3.2 Analyses of the synthesis and secretion of various mutant alleles of SseB in vitro..............................91
3.3 Synthesis of the SseB deletion variants by intracellular Salmonella ....................................................93
3.4 Effect of deletion of SseB domains on formation of translocon structures on intracellular
Salmonella ............................................................................................................................................95
3.5 Analysis of the putative translocon protein SseD .................................................................................97
3.6 Effect of deletions of domains in SseB or SseD on intracellular replication and effector
translocation mediated by the SPI2-encoded T3SS ..............................................................................99
VI. DISCUSSION...................................................................................................101
1. Quantification of effector translocation by means of a translational luciferase reporter fusion ......102
2. Truncation of the OAg length of the LPS affects the function of the SPI1 but not the SPI2 or
flagella T3SS.............................................................................................................................................105
3. All domains of the putative translocon proteins SseB and SseD cooperate in order to assemble
a functional SPI2-encoded T3SS.............................................................................................................112
4. Concluding remarks ................................................................................................................................116
VII. REFERENCES ...........................................................................................118
VIII. LIST OF ABBREVIATIONS .......................................................................135
IX. ATTACHMENT ................................................................................................137
1. Curriculum vitae......................................................................................................................................137
2. List of publications...................................................................................................................................138







IV
Summary/Zusammenfassung
I. Summary/Zusammenfassung
The Gram-negative bacterium Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) is
one of the leading causes of human gastroenteritis. The pathogen expresses three different
Type Three Secretion Systems (T3SS) in order to establish a successful infection: the flagella
assembly system essential for bacterial motility as well as the Salmonella pathogenicity island
(SPI) 1- and 2-encoded T3SS acting as molecular syringes for injection of effector proteins
into the host cell cytoplasm. The SPI1-encoded T3SS is required for active invasion of non-
phagocytic cells in the human intestine while the SPI2-encoded T3SS allows survival as well
as replication of the bacterium within host cells. Salmonella is protected against the innate
immune response of the host by repetitive O-antigen (OAg) units of the lipopolysaccharide.
Short (up to 15 repeat units), long (16-35 repeat units) and very long (more than 100 repeat
units) OAg species are present on the surface of S. Typhimurium and the OAg length pattern is
controlled by the regulator proteins Wzz and Wzz . In this study, the regulators were ST fepE
deleted and the effect of different OAg length on the function of the Salmonella T3SS was
investigated. A luciferase-based translocation assay for the quantification of SPI2-encoded
T3SS mediated effector translocation was established. By the use of this assay, it was shown
that the OAg length is not critical for the function of the SPI2-encoded T3SS. The motility of
the bacterium was also not affected by modifications of the OAg length. In contrast, truncation
of the OAg length promoted invasion into polarised as well as non-polarised epithelial cells
and increased effector translocation mediated by the SPI1-encoded T3SS. However, the short
OAg form impaired the resistance of Salmonella against human complement and antimicrobial
peptides. In summary, the data suggest that the trimodal OAg chain length distribution in
Salmonella is optimised towards a balance between invasion of epithelial cells and resistance
against antibacterial factors.
In general, T3SS are composed of a basal body spanning the Gram-negative cell envelope, a
needle-like extension of the basal body and a translocon pore connected to the needle and
integrated into the host cell membrane. Another aspect of this study included the functional
dissection of the putative translocon proteins SseB and SseD of the SPI2-encoded T3SS.
Domains of SseB were identified that are involved in expression and secretion of this protein
in vitro. However, mutagenesis of sseB and sseD had a dramatic effect on Salmonella
intracellular replication and effector translocation leading to a loss of function of the SPI2-
encoded T3SS. This work emphasises the highly sensitive nature of these structural proteins
against alterations of their primary structure.

1 Summary/Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Gram-negative Bakterium Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium)
ist der häufigste Verursacher von Gastroenteritis beim Menschen. Der pathogene Erreger
benötigt drei unterschiedliche Typ-III-Sekretionssysteme (T3SS) für eine erfolgreiche
Infektion: das Flagellensystem, welches für die Beweglichkeit benötigt wird, sowie Typ-III-
Sekretionssysteme, die innerhalb der Salmonella Pathogenitätsinsel (SPI) 1 oder 2 kodiert
sind. Diese dienen als molekulare Injektionsnadeln zur Injektion von Effektorproteinen in das
Zytoplasma der Wirtszelle. Das SPI1-kodierte T3SS wird für die aktive Invasion von nicht-
phagozytierenden Zellen im menschlichen Darm benötigt, während das SPI2-kodierte T3SS
das Überleben sowie die Vermehrung der Bakterien innerhalb der Wirtszelle ermöglicht.
Salmonellen sind durch die besondere Struktur des LPS mit sich wiederholende O-Antigen
(OAg) Einheiten des Lipopolysaccharids vor der Immunantwort des Wirtes geschützt. Auf der
Oberfläche von S. Typhimurium findet man kurze (bis zu 15 sich wiederholende Einheiten),
lange (16-35 sich wiederholende Einheiten) und sehr lange (über 100 sich wiederholende
Einheiten) Varianten des OAgs. Das Längenmuster des OAgs wird durch die
Regulatorproteine Wzz and Wzz bestimmt. In dieser Arbeit wurden diese Regulatoren ST fepE
deletiert und der Effekt der verschiedenen OAg Längen auf die Funktion der T3SS in
Salmonellen untersucht. Zur quantitativen Bestimmung der SPI2 T3SS-vermittelten Effektor-
Translokation wurde ein Luciferase-Translokations-Assay etabliert. Mithilfe dieses Assays
konnte gezeigt werden, dass die Länge des OAg keinen Einfluss auf die Funktion des SPI2-
kodierten T3SS hat. Die Beweglichkeit des Bakteriums wurde durch die Veränderung der
OAg Länge ebenfalls nicht beeinträchtigt. Eine Verkürzung des OAg hingegen begünstigte die
Invasion in polarisierte und nicht-polarisierte Epithelzellen und förderte die Effektor-
Translokation, welche durch das SPI1-kodierte T3SS vermittelt wird. Jedoch verringerte die
kurze Form des OAgs die Resistenz von Salmonellen gegenüber menschlichem Komplement
und antimikrobiellen Peptiden. Diese Daten deuten darauf hin, dass die dreistufige Verteilung
der OAg Längen optimiert ist, um ein Gleichgewicht zwischen der Invasion von Epithelzellen
und der Resistenz gegenüber antibakteriellen Faktoren zu schaffen.
T3SS sind generell zusammengesetzt aus einem Basalkörper, der die Zellmembranen des
Gram-negativen Bakteriums durchspannt, einer Nadel-ähnlichen Verlängerung des
Basalkörpers und einer Translokon-Pore, welche mit der Nadel verbunden ist und in die
Membran der Wirtszelle integriert ist. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die
Charakterisierung funktioneller Einheiten der möglichen Translokon Proteine SseB und SseD

2 Summary/Zusammenfassung
des SPI2-kodierten T3SS. Es wurden Bereiche von SseB identifiziert, die an der Expression
und Sekretion des Proteins in vitro beteiligt sind. Weiterhin hatte die Mutagenese von sseB
und sseD dramatische Effekte auf die intrazelluläre Vermehrung von Salmonellen sowie auf
die Effektor-Translokation und führte zu einem Funktionsverlust des SPI2-kodierten T3SS.
Die vorliegende Arbeit zeigt die Empfindlichkeit dieser strukturellen Proteine gegenüber
Änderungen ihrer Primärstruktur auf.



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