Functional and molecular aspects of xenobiotic transport in choroid plexus [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Carsten H. Baehr

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INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg vorgelegt von Carsten H. Baehr, MEM, BSc aus Bensheim Tag der mündlichen Prüfung: 04.02.2005 INAUGURAL-DISSERTATION submitted to the Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Carsten H. Baehr, MEM, BSc born in Bensheim Oral examination: 04.02.2005 Functional and Molecular Aspects of Xenobiotic Transport in Choroid Plexus Supervisors: Prof. Dr. Gert Fricker Prof. Dr. Ulrich Hilgenfeldt To my family Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnolo-gie in der Abteilung Pharmazeutische Technologie und Pharmakologie der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg angefertigt. Mein Dank gilt: Herrn Prof. Dr. Gert Fricker für die interessante Fragestellung, die Betreuung und den wissenschaftlichen Freiraum, die stete Ansprechbarkeit und die Anregungen bei der Bearbeitung des Themas. Herrn Prof. Dr. Ulrich Hilgenfeldt für die Anfertigung des Zweitgutachtens. Herrn Dr.
Publié le : samedi 1 janvier 2005
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INAUGURAL-DISSERTATION







Zur Erlangung der Doktorwürde
der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät
der
Ruprecht-Karls-Universität
Heidelberg




vorgelegt von
Carsten H. Baehr, MEM, BSc
aus Bensheim






Tag der mündlichen Prüfung: 04.02.2005










INAUGURAL-DISSERTATION







submitted to the
Combined Faculties for the Natural Sciences and for Mathematics
of the Ruperto-Carola University of Heidelberg, Germany
for the degree of
Doctor of Natural Sciences




presented by
Carsten H. Baehr, MEM, BSc
born in Bensheim






Oral examination: 04.02.2005











Functional and Molecular Aspects of
Xenobiotic Transport in Choroid Plexus































Supervisors: Prof. Dr. Gert Fricker
Prof. Dr. Ulrich Hilgenfeldt










To my family

Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnolo-
gie in der Abteilung Pharmazeutische Technologie und Pharmakologie der Ruprecht-
Karls-Universität Heidelberg angefertigt.


Mein Dank gilt:

Herrn Prof. Dr. Gert Fricker für die interessante Fragestellung, die Betreuung und
den wissenschaftlichen Freiraum, die stete Ansprechbarkeit und die Anregungen bei
der Bearbeitung des Themas.

Herrn Prof. Dr. Ulrich Hilgenfeldt für die Anfertigung des Zweitgutachtens.

Herrn Dr. David Miller für die Aufenthalte am Mount Desert Island Biological Labora-
tory und die gute Zusammenarbeit.

Susanne Angelow für die Einführung in die Choroid-Plexus-Zellkultur.

Ute Hettinger für die Einführung in die Molekularbiologie.

Melanie Ott für die Kapillarendothelzellen.

Dr. Tilo Schönbrodt, Dr. Martin Bultmann und Christoph Vogel für die Lösung zahlrei-
cher Computer- und Netzwerkprobleme.

Der B-Box und deren Vorgängern für die gute Laboratmosphäre.

Allen Kollegen für die tolle Arbeitsatmosphäre und die gute Stimmung am Institut, bei
Feierlichkeiten und Betriebsausflügen.

Esther Chucholl für den seelischen Ausgleich.

Uta Hülsermann für die viele Arbeit und Korrektur von Rechtschreibung und Zeichen-
setzung.

Céline Wilke für die psychologische Unterstützung und liebevolle Zuneigung.

Meinen Eltern, meinem Bruder Daniel-Frank und meiner Omi Josefine für die ständi-
ge Unterstützung während des Studiums und der Promotion.




Parts of this thesis were presented in:

Baehr CH, DiPasqual e KD, Fricker G, Miller DS. Regulation and Transport of FL-
MTX at the Blood-Liquor Barrier of Squalus Acanthias. American Journal of Physiol-
ogy: Comparative Physiology: Submitted.

Breen CM, Sykes DB, Baehr CH, Fricker G, Miller DS. Fluorescein-
Methotrexate Transport in Rat Choroid Plexus Analyzed Using Confocal Microscopy.
American Journal of Physiology: Renal Physiology. 2004; 287(3):F562-9.

Baehr CH, Fricker G. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 2004; 369:
Supplement 1.

Reichel V, Baehr CH, Fricker G. Naunyn-Schmiedeberg’.
2004; 369: Supplement 1.

Bauer, B., Hüwel, S., Baehr, C.H., Galla, H.J., Markert, C., Delzer, J. and Fricker, G.
“Excretory Transport of Calcium Blocking Pamiles at Blood-Brain-Barrier and Choroid
Plexus,” British Journal of Pharmacology. Submitted.

Baehr CH, Fricker G. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 2003; 367:
Supplement 1.

thBaehr CH, Bauer B, Hartz A, Miller DS, Fricker G. MDIBL 17 Annual Report of Pro-
gress. 2002.

Baehr CH, Fricker G. Archiv der Pharmazie. 2002; 335: Supplement 1.

Ritter M, Buechler C, Boettcher A, Barlage S, Schmitz-Madry A, Orso E,
Bared SM, Schmiedeknecht G, Baehr CH, Fricker G, Schmitz G. Cloning
and Characterization of a Novel Apolipoprotein A-I Binding Protein, AI-BP, Secreted
by Cells of the Kidney Proximal Tubules in Response to HDL or Apoa-I. GENOMICS.
2002; 79(5):693-702.

Posters

Gordon Conference in Tilton, NH, USA, June 2004 (distinguished poster)
45. DGPT Spring Meeting in Mainz, March 2004
BioScience Workshop of Schering AG in Berlin, September 2003
44. DGPT Spring Meeting in Mainz, March 2003
Annual DPhG Meeting in Berlin, October 2002
th5 Symposium on Signal Transduction in the Blood-Brain Barriers in Berlin/Potsdam,
September 2002

Oral Presentations

Gordon Conference: Barriers to the CNS in Tilton, NH, USA, June 2004
The II International Workshop on Choroid Plexus, King’s College, University Of
London, England, April 2003


ZUSAMMENFASSUNG


Transport von ZNS-wirksamen Arzneistoffen an der Blut-Liquor-Schranke


Referent: Prof. Dr. Gert Fricker
Koreferent: Prof. Dr. Ulrich Hilgenfeldt


Neben dem cerebralen Kapillarendothel, der so genannten Blut-Hirn-Schranke
(BHS), stellen die Plexus chorioidei (CP) die zweite aktive Barriere zwischen Blut und
ZNS dar. Während die BHS in erster Linie Barrierefunktion hat, sind die CP unmittel-
bar an der Bildung der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) beteiligt, synthetisieren und
sekretieren Proteine und haben verschiedene andere neurogene und endokrine
Funktionen. Im Gegensatz zur BHS sind die CP hinsichtlich Wirkstofftransport und
Funktionen bzw. Expression von Carrierproteinen weit weniger gut charakterisiert.
Seit einigen Jahrzehnten ist bekannt, dass die CP aktiv am Export von organischen
Anionen aus der extrazellulären Flüssigkeit beteiligt sind (Pappenheimer et al., 1961;
Villalobos et al., 2002; Miller et al., 2002; Breen et al., 2004; Baehr et al., in press).
Organische Anionen wie auch Kationen in Form von kreislauffremden Xenobiotika,
pflanzlichen und tierischen Giften oder auch Arzneistoffen sind von großer physiolo-
gischer, pharmakologischer und toxikologischer Bedeutung (Pardridge und Miller,
1993; Wright und Dantzler, 2004). Eingehende Untersuchungen an CP-Gewebe sind
jedoch schwierig auf Grund der morphologischen Komplexität, der anatomischen
Lage und der Größe des Gewebes. Die molekularen Prozesse, die funktionelle Viel-
schichtigkeit und die Regulation des organischen Anionentransports an der Blut-
Liquor-Schranke sind daher noch weitgehend unerforscht.
Um die Transportprozesse, die für die Elimination von organischen Anionen aus der
CSF verantwortlich sind, genauer untersuchen zu können, wurde ein CP-
Zellkulturmodell aus Schweineepithel etabliert und auf molekularer, biochemischer
und funktioneller Ebene charakterisiert. Alle CP-Kulturen waren frei von kontaminie-
renden Zellen, bildeten intakte Monolayer und waren vollständig differenziert. Das
epitheliale Markerprotein für CP-Gewebe, Prealbumin, wurde durch Genexpression-
sanalysen, immunohistochemische Färbungen und Western Blots nachgewiesen. Die
Alkalische-Phosphatase- und γ-Glutamyltransferase-Aktivität sowie das CSF-
Sekretionsvolumen wurden bestimmt.

Weiter wurden zwei Transportproteine, das MDR1-Genprodukt P-glycoprotein (Pgp)
und das Multidrug-Resistance Associated Protein 1 (Mrp1) genauer untersucht. Ne-
ben dem Nachweis beider Proteine durch RT-PCR wurde ein semi-quantitativer Ver-
gleich des Expressionsniveaus von Mrp1 zwischen kultivierten und frisch isolierten
CP-Epithelzellen durchgeführt. Beide Transportproteine wurden in Immunfärbungen
und durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie in CP-Epithelzellen (CPEC) lokalisiert.
Mrp1 konnte klar der basolateralen CPEC-Plasmamembran zugeordnet werden.
Dagegen konnte Pgp nicht eindeutig an einer der CP-Membranen lokalisiert werden,
sondern schien subapikal und apikal ausgebildet zu sein. In weiterführenden Wes-
tern-Blot-Analysen von CP-Membranfraktionen wurde die apikale im Gegensatz zur
basolateralen Fraktion gefärbt. In abschließenden in vitro-Untersuchungen von Pgp
konnte jedoch keine signifikante funktionelle Aktivität des Transportproteins nachge-
wiesen werden. Der Transport von organischen Anionen wurde in einem Säugetier-
CP-Modell (Ratte), einem vergleichenden Elasmobranchii-Modell (Dornhai) und in
Zellkultur (Schwein) mit Hilfe des Modellsubstrats Fluorescein-Methotrexat (FL-MTX)
untersucht. Die Elimination von FL-MTX aus der CSF erfolgt spezifisch und kon-
+zentrativ und ist ein metabolismus- und Na -abhängiger Zwei-Stufen-Prozess. Des
Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Regulation des organischen Anionen-
transports über die Proteinkinasen (PK) PKC und PKA erfolgt. Die Identifizierung der
verantwortlichen Hormone bleibt zu klären.

ABSTRACT

Functional and Molecular Aspects of Xenobiotic Transport in Choroid Plexus

Supervisor: Prof. Dr. Gert Fricker
Co-Supervisor: Prof. Dr. Ulrich Hilgenfeldt

The choroid plexus (CP) epithelium forms the blood-cerebrospinal fluid (CSF) barrier,
which along with the blood-brain barrier (BBB) capillary endothelium maintains the
fluid environment of the brain. The CP not only secretes CSF, but also transports
potentially toxic xenobiotics and waste products of neural metabolism to the blood for
eventual clearance in kidney and liver.
For several decades it has been known that the CP is actively involved in removing
organic anions and other organic compounds from the extra-cellular fluid (Pappen-
heimer et al., 1961; Villalobos et al., 2002; Miller et al., 2002; Breen et al., 2004;
Baehr et al., in press). However, studying CP is difficult, due to complex morphology,
anatomical location and small size of the tissue and little is known about the molecu-
lar mechanisms, functional complexity and hormonal regulation of organic anion se-
cretion.
To further elucidate the underlying mechanisms of organic anion transport across CP
epithelium, a primary porcine CP cell culture model was established and character-
ized on a molecular and functional basis. All cultures were free of contaminating
cells, developed intact monolayers and were fully differentiated. Expression of marker
protein prealbumin was demonstrated in isolated CP epithelial cells (CPEC) using
RT-PCR, immunostaining and Western blot analyses. Alkaline phosphatase and γ-
glutamyl transferase were quantified and cerebrospinal fluid secretion was measured.
In addition, two active transport proteins, the MDR1 gene product P-glycoprotein
(Pgp) and the multidrug-resistance associated protein 1, were assessed by RT-PCR,
immunohistological staining and in Western blots of isolated membrane fractions.
Integrity of fully differentiated monolayers was ensured by TEER measurements as
well as permeability analyses using marker compounds. Further, functional analyses
of Pgp were carried out.
Organic anion transport was studied in a mammalian (rat), a comparative elasmo-
branch and in the in vitro porcine CPEC culture model, using the model compound


fluorescein-methotrexate (FL-MTX). FL-MTX transport was shown to be a specific
+and concentrative, Na -dependent and metabolism-dependent two-step process. Fi-
nally, for the first time, these studies demonstrate that organic anion transport is
regulated by protein kinase C (PKC) and PKA. Responsible hormones remain to be
identified.

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