Identification and characterisation of a new multidrug resistance protein at the blood brain barrier [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Tanja Eisenblätter

De
TANJA EISENBLÄTTER IDENTIFICATION AND CHARACTERISATION OF A NEW MULTIDRUG RESISTANCE PROTEIN AT THE BLOOD-BRAIN BARRIER 2002 Biochemie IDENTIFICATION AND CHARACTERISATION OF A NEW MULTIDRUG RESISTANCE PROTEIN AT THE BLOOD-BRAIN BARRIER Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften im Fachbereich Chemie und Pharmazie der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster vorgelegt von TANJA EISENBLÄTTER aus Kiel - 2002 - Dekan: Prof. Dr. V. Leute Erster Gutachter: Prof. H.-J. Galla Zweiter Gutachter: Dr. K.-H. Klempnauer Tag der mündlichen Prüfung: 14.06.2002 Tag der Promotion: 14.06.2002 Meinen lieben Eltern. Ich möchte mich bedanken .... bei Herrn Prof. Dr. H.-J. Galla für die interessante Themenstellung, die Möglichkeit zur Entfaltung eigener Ideen, die jederzeit freundliche Unterstützung und die Ermöglichung meines Industrie-Praktikums, bei dem Fonds der Chemischen Industrie für die Bereitstellung des Stipendiums zur Förderung der Promotion, ganz besonders bei Joe und Ursula für die vielen kreativen Diskussionen und das gründliche Korrekturlesen dieser Arbeit, bei dem Labor R.
Publié le : mardi 1 janvier 2002
Lecture(s) : 22
Tags :
Source : MIAMI.UNI-MUENSTER.DE/SERVLETS/DERIVATESERVLET/DERIVATE-80/EISENBLAETTER_DISSERTATION.PDF
Nombre de pages : 156
Voir plus Voir moins






TANJA EISENBLÄTTER


IDENTIFICATION AND CHARACTERISATION
OF A NEW MULTIDRUG RESISTANCE PROTEIN
AT THE BLOOD-BRAIN BARRIER


2002
Biochemie




IDENTIFICATION AND CHARACTERISATION
OF A NEW MULTIDRUG RESISTANCE PROTEIN
AT THE BLOOD-BRAIN BARRIER




Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
im Fachbereich Chemie und Pharmazie
der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster




vorgelegt von
TANJA EISENBLÄTTER
aus Kiel


- 2002 -
























Dekan: Prof. Dr. V. Leute
Erster Gutachter: Prof. H.-J. Galla
Zweiter Gutachter: Dr. K.-H. Klempnauer
Tag der mündlichen Prüfung: 14.06.2002
Tag der Promotion: 14.06.2002






























Meinen lieben Eltern. Ich möchte mich bedanken ....

bei Herrn Prof. Dr. H.-J. Galla für die interessante Themenstellung, die Möglichkeit zur Entfaltung eigener
Ideen, die jederzeit freundliche Unterstützung und die Ermöglichung meines Industrie-Praktikums,

bei dem Fonds der Chemischen Industrie für die Bereitstellung des Stipendiums zur Förderung der
Promotion,

ganz besonders bei Joe und Ursula für die vielen kreativen Diskussionen und das gründliche Korrekturlesen
dieser Arbeit,

bei dem Labor R.224 mit den „Krebsern“ Beate, Thanh, Joe, Jens und Dagmar und den „Gallas“ Christian,
Ruth, Alla, Anja, Evelyn, Frank und Sandra für die vielen lustigen gemeinsamen Laborstunden, -tage, -
abende, -wochenenden – wann immer man kam, man war nicht allein, und das war gut so!

bei Sabine für die große und für sie immer selbstverständliche Hilfe bei den Präps und ganz besonders bei
den abschließenden Versuchen,

ganz besonders bei Christian, Ruth, Anja und Evelyn für die tolle Zusammenarbeit und den Beitrag im
Rahmen ihrer Diplomarbeiten zum Entstehen dieser Arbeit,

genauso besonders bei den beiden Azubis Sandra und Frank, die immer fleißig mitgeholfen haben, das
Tagespensum abzuarbeiten und dabei immer locker und fröhlich blieben,

bei dem ganzen Arbeitskreis Galla (Hirnis und Lipidis!) für das nette Arbeitsklima,

bei Freddy für die vielen Hilfen in Sachen Computer und die netten Gespräche,

bei Wolfgang, Walter, Hedda, Lydia, Anne, Sandra und Steffi für so viel reibungsloses Organisieren,
Bestellen, Bearbeiten, Installieren,...

beim ganzen Institut für Biochemie für die rundum nette und kollegiale Atmosphäre,

bei meinem Chemie-LK-Lehrer Herrn Dr. J. Thönes für die Motivation zum Chemie-Studium,

bei meinen Kieler Freundinnen Mareike, Corinna, Manuela und Martina, den Würzburgern Norwin,
Steffi, Stefan, Dragan und Arno und schließlich den Münsteranern Claudia, Dana, Kasi, Tanja, Katja
und Thomas für super schöne Freizeitstunden,

bei Ursula für die beste Freundin aller Zeiten,

bei meinen lieben Eltern, die mir jederzeit und in allen Situationen unterstützend zur Seite standen,

und bei Joe. Contents I
Acknowledgements

1. Summary 1

2. Introduction 2

2.1 Permeability barriers of the central nervous system 2
2.1.1 Organisation of the blood-brain barrier 4
2.1.2 Brain capillary endothelial cells (BCEC) 5
2.1.2.1 BCEC: a permeability barrier 6
2.1.2.2 BCEC: selective transport functions as barrier 6
2.1.2.3 BCEC: metabolism as barrier 7
2.1.3 In vitro models of the blood-brain barrier 8

2.2 Drug transporters in the central nervous system 10
2.2.1 Organic cation transport systems (OCT) 10
2.2.2 Organic anion transpos (OAT) 11
2.2.3 Nucleoside transport systems (NT) 13
2.2.4 ABC transport systems 15
2.2.4.1 P-glycoprotein (Pgp) 17
2.2.4.2 Multidrug resistance associated proteins (MRPs) 22

2.3 Objectives of the project 27

3. Identification of a new multidrug resistance protein 28

3.1 Aims and rationale 28

3.2 Results 28
3.2.1 Differential screening of a subtracted cDNA library 28
3.2.2 Analysis of a putative differentially expressed cDNA clone 30
3.2.2.1 Northern blot analysis for the expression of cDNA clone C8 (BMDP) 30
3.2.2.2 Genomic Southern blot analysis of cDNA clone C8 (BMDP) 30
3.2.3 Isolation of the full-length cDNA sequence by RACE-PCR technology 32
3.2.4 Analysis of the cDNA sequence 32
3.2.5 e cDNA-deduced amino acid sequence 36

3. Discusion 39

4. Expression and localisation analysis of BMDP 42

4.1 Aims and rationale 42

4.2 Result 42
4.2.1 Expression analysis of BMDP on RNA level 42
4.2.1.1 BMDP expression at different days during cell cultivation process 42 Contents II
4.2.1.2 BMDP expression in vivo compared to primary cultured & immortalised cells 42
4.2.1.3 BMDP expression at the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barrier 44
4.2.1.4 ssion in different types of brain specific cells 44
4.2.1.5 BMDP expression in different types of endothelial cells 45
4.2.1.6 ssion in selected tissues 46
4.2.1.7 BMDP expression in human, mouse and porcine brain tissue 46
4.2.1.8 ssion compared to Pgp and MRP1 expression 48
4.2.2 Subcellular localisation of BMDP on protein level 49
4.2.2.1 Three independent ways to obtain an antibody against BMDP 49
4.2.2.2 Immunocytochemical detection of BMDP in PBCEC 51

4.3 Discussion 52

5. Characterisation of BMDP transport 58

5.1 Aims and rationale 58

5.2 Results 58
5.2.1 Exogenous expression of BMDP in HEK293 cells 58
5.2.1.1 Generating a stable cell line 58
5.2.1.2 Cytotoxicity studies 59
5.2.2 Endogenous expression of BMDP in PBCEC 61
5.2.2.1 Active transport of daunorubicin 61
5.2.2.2 Inhibition studies of daunorubicin transport 62

5.3 Discusion 63

6. General discussion 70

7. Experimental 72
7.1 Cell biology 72
7.1.1 Cell culture
7.1.1.1 Primary culture of porcine brain capillary endothelial cells (PBCEC) 72
7.1.1.2 Culture of cells 74
7.1.1.3 Cell counting 75
7.1.1.4 Storage of cells
7.1.2 Stable transfection 75
7.1.2.1 Transient transfection of HEK 293 cells 75
7.1.2.2 Reportergene assays 76
7.1.2.3 Selection of stable clones 77
7.1.3 Immunocytochemistry 78
7.1.4 Cytotoxicity assay
7.1.5 Active transport of daunorubicin by PBCEC 79
Contents III
7.2 Molecular biology 80
7.2.1 Quantification of nucleic acids 80
7.2.1.1 Photometric determination of concentrations 80
7.2.1.2 Determination of concentrations by comparison of band intensities 80
7.2.2 Agarose gel electrophoresis 80
7.2.3 Isolation of DNA from agarose gels 82
7.2.4 Isolation of plasmid-DNA 82
7.2.5 Isolation of genomic DNA 82
7.2.6 Isolation of RNA 83
7.2.6.1 Isolation of total RNA from cultured cells 83
7.2.6.2 tissue 84
7.2.6.3 Isolation of mRNA 84
7.2.7 cDNA synthesis 85
7.2.8 PCR methods 85
7.2.8.1 RT-PCR
7.2.8.2 3’-RACE-PCR 86
7.2.8.3 5’-RACE-P
7.2.8.4 LD-PCR 88
7.2.9 Site-directed mutagenesis 90
7.2.10 Nucleic acid blotting and hybridisation 90
7.2.10.1 Northern blotting 90
7.2.10.2Southern blotting 91
327.2.10.3 Preparation of α- P-labelled DNA probes 92
7.2.10.4 Hybridisation 92
7.2.10.5Washing 93
7.2.10.6 Stripping
7.2.11 Cloning and ligation 93
7.2.11.1 Restriction 94
7.2.11.2Ligation
7.2.11.3 TA-cloning 94
7.2.12 DNA sequencing 95
7.2.13Differential screening of a subtracted cDNA library 96
7.2.13.1 Establishment of a subtracted cDNA library using SSH 96
7.2.13.2 Differential screening 98

7.3 Microbiology 99
7.3.1 Preparation of competent E. coli cells 99
7.3.2 Transformation of E. coli cels 9
7.3.3 Cultures of E. coli cells 100
7.3.4 Storage of E. colicells

7.4 Protein biochemistry 100
7.4.1 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis 100 Contents IV
7.4.2 Coomassie Blue staining 101
7.4.3 Purification of BMDP-MBP-fusion protein 101

8. Materials and devices 103

8.1 Materials 103

8.2 Devices 107

9. Refrnces 109


Appendix A: Abbreviations 123

AppeB: Published sequences 127

Appendix C: WWW sites 128

Appendix D: Genotypes of Escherichia coli K12 strains 129

Appendix E: Primer sequences 130

AppeF: Clone charts 134

Appendix G: List of table and figure captions 143


Curriculum vitae

Soyez le premier à déposer un commentaire !

17/1000 caractères maximum.